CN112014491A - 一种短链脂肪酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种短链脂肪酸的检测方法,短链脂肪酸的检测方法包括:步骤S1:配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液,并往所述标准品混合液中加入内标,采用气相色谱‑质谱联用仪测试短链脂肪酸标准品以及内标的峰面积,求出线性回归方程;步骤S2:往测试样本中加入酸液及含内标的提取液进行提取,得到分离液,利用气相色谱‑质谱联用仪得到短链脂肪酸的峰面积以及内标的峰面积;步骤S3:计算测试样品的短链脂肪酸含量;其中,所述提取液为甲基叔丁基醚。本发明的有益效果在于:采取甲基叔丁基醚在低温下进行提取,提取方法不仅适用于多种生物样品,且简单稳定;多反应检测模式建库,排除假阳性干扰,更为准确,且灵敏度高;检测时间短。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及一种短链脂肪酸的检测方法。
背景技术
短链脂肪酸(short-chainfattyacids,SCFAs),也称挥发性脂肪酸(Volatilefattyacids,VFAs),根据碳链中碳原子的多少,把碳原子数为1-6的有机脂肪酸称为短链脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸,已酸等,主要由厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物而产生,SCFAs已被证明参与多种生命活动,因此对短链脂肪酸的检测及控制对于医学、食品等领域的研究具有很大的指导作用。
现有关于短链脂肪酸的分析检测技术中前处理方法的不稳定,会影响短链脂肪酸的分离效果,进而会影响检测结果,因此研究稳定的前处理方法增加后续检测的精确度很有必要。
发明内容
为解决现有技术中短链脂肪酸前处理不稳定的技术缺陷,本发明提供一种短链脂肪酸的检测方法。
具体技术方案如下:
一种短链脂肪酸的检测方法,其不同之处在于,所述短链脂肪酸的检测方法包括:
步骤S1:配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液,并往所述标准品混合液中加入内标,采用气相色谱-质谱联用仪测试,求出线性回归方程,所述线性回归方程是关于所测短链脂肪酸与内标物质的峰面积的比值、所测物质与内标物质浓度的比值的二元一次方程;
步骤S2:往测试样本中加入酸液及含内标的提取液进行提取,得到分离液,利用气相色谱-质谱联用仪测试所述分离液;
步骤S3:将步骤S2测试结果代入所述线性回归方程,计算测试样品的短链脂肪酸含量;
其中,所述提取液为甲基叔丁基醚;
所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸及己酸。
进一步,所述步骤S2中,提取过程为:测试样本加入酸液及提取液,经涡旋、超声及离心处理进行分离后,取分离液。
进一步,所述步骤S2中,提取过程包括:测试样本加入酸液及提取液后,在4℃以下处理。
进一步,短链脂肪酸的离子对和碰撞能量如下表所示:
进一步,所述气相色谱-质谱测试的参数设置如下表所示:
进一步,所述内标为2-甲基戊酸。
进一步,所述酸液为体积百分比为0.5%的磷酸或体积百分比为36%的磷酸。
进一步,测试样品为血清样品,所述酸液为体积百分比为36%的磷酸。
进一步,测试样品为饲料样品或粪便样品,所述酸液为体积百分比为 0.5%的磷酸。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:采取甲基叔丁基醚进行提取,提取方法不仅适用于多种生物样品,且简单稳定,后续检测分离效果良好;多反应检测模式建库,排除假阳性干扰,更为准确,且灵敏度高;检测时间短,6min可一次检测7中短链脂肪酸,检测更加快捷。
附图说明
图1为加标标准品总离子流质谱出峰图;
图2为血清样品短链脂肪酸总离子流质谱出峰图;
图3为小鼠粪便短链脂肪酸总离子流质谱出峰图;
图4为饲料样品短链脂肪酸总离子流质谱出峰图;
图5为对比例1提取方法血清样品总离子流质谱出峰图;
其中,1,乙酸;2,丙酸;3,异丁酸;4,丁酸;5,异戊酸;6,戊酸; 7,内标:2-甲基戊酸;8,己酸。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
一种短链脂肪酸的检测方法,其不同之处在于,所述短链脂肪酸的检测方法包括:
步骤S1:配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液,并往所述标准品混合液中加入内标,采用气相色谱-质谱联用仪测试,求出线性回归方程,所述线性回归方程是关于所测短链脂肪酸与内标物质的峰面积的比值、所测物质与内标物质浓度的比值的二元一次方程;
步骤S2:往测试样本中加入酸液及含内标的提取液进行提取,得到分离液,利用气相色谱-质谱联用仪测试所述分离液;
步骤S3:将步骤S2测试结果代入所述线性回归方程,计算测试样品的短链脂肪酸含量;
其中,所述提取液为甲基叔丁基醚(MTBE)。
本发明中,术语所述“气相色谱-质谱”是指在磁场(或电场)作用下,按这些离子的质荷比进行扫描记录,最后运用计算机处理资料,依据每种化合物的色谱保留时间,以及质谱的分子离子与关键碎片离子组成的断裂型式,结合标样或标准谱图,对化合物逐个作出定性鉴定与定量分析。
现有技术中,已采用多种短链脂肪酸的提取液应用于短链脂肪酸的提取,如乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂,其中,乙醚更是被广泛应用,但研究发现,经乙醚前处理的样品在后续气质检测中,样品难以被完全分离。本发明中,针对乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸及己酸,采取MTBE 能够提高前处理的稳定性,进而在进行气相色谱-质谱检测时,短链脂肪酸更加容易分离。
进一步,所述步骤S2中,提取过程为:测试样本加入酸液及提取液,经涡旋、超声及离心处理进行分离后,取分离液。
进一步,所述步骤S2中,提取过程包括:测试样本加入酸液及提取液后,在4℃以下处理。
本发明中,将样品在低温下进行处理,可以避免在提取过程中提取液的挥发,影响前处理的稳定性,进一步提高后续测试的分离性。
进一步,短链脂肪酸的离子对和碰撞能量如下表所示:
进一步,所述气相色谱-质谱测试的参数设置如下表所示:
进一步,所述酸液为体积百分比为0.5%的磷酸或体积百分比为36%的磷酸。
进一步,测试样品为血清样品,所述酸液为体积百分比为36%的磷酸。
进一步,测试样品为饲料样品或粪便样品,所述酸液为体积百分比为 0.5%的磷酸。
本发明中,磷酸的加入使短链脂肪酸的提取更加容易,与此同时,配合合理的磷酸加入量,配合提取液,能进一步提高短链脂肪酸的分离效果。
进一步,所述内标为2-甲基戊酸。
实施例1
定性离子对/定量离子对以及出峰时间的确认
乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-甲基戊酸(内标)及己酸分别用甲基叔丁基醚稀释成10ug/ml的短链脂肪酸单标,然后利用Agilent 7890B-7000D仪器单独SCAN模式GCMS检测,通过标品及NIST数据库检索双重方法进行结构鉴定,得到每个物质的出峰时间后,再8种标准品进行混合,如图1所示。
MRM建库:通过质谱及文献参考信息确定目标物质的前体离子,进行子离子扫描,确定子离子信息,每个目标物质至少选择2~3对离子对,然后进行碰撞能量的优化,最终确定目标物质的母离子、子离子及碰撞能量,结果如表1所示。
表1短链脂肪酸的离子对和碰撞能量
实施例2标准曲线的确认
步骤S1:配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液,并往所述标准品混合液中加入内标,进行GC-MS/MS分析。
具体步骤如下:
标曲配制步骤:
取7种1000μg/mL的短链脂肪酸单标各100μL于棕色进样瓶中,加入 300μLMTBE,涡旋30s,得到100μg/mL外标混合工作液(编号:MIX01)。
取MIX01溶液300μL于EP管中,再加入MTBE溶液2700μL,涡旋 30s,得到10μg/mL外标混合工作液(编号:MIX02)。
内标配制:配制1000μg/ml内标溶液,稀释成6μg/ml(编号:Z03);
取MIX02溶液与Z03溶液混合后,再加入MTBE进行稀释,MIX02溶液与Z03溶液如表2所示。
表2 MIX02溶液与Z03溶液的取量表
GC-MS/MS测试条件如表3所示。
表3 GC-MS/MS测试条件
根据测试结果,绘制出标准曲线,得到线性回归方程。
得到的线性方程如表4所示:
其中,表中x为所测物质与内标物质的峰面积比,y为所测物质与内标物质浓度比。
表4短链脂肪酸的线性方程
上述结果表明,本发明方法线性关系良好,标准曲线根据仪器工作时间,间隔一段时间需进行更新,保证准确率。
实施例3
血清样品的制备
步骤S2:血清样本解冻后,涡旋1min混匀(所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大)。
取血清样本50uL加入到对应的已编号的1.5mL离心管中,加入200 uL36%(v/v)磷酸溶液,涡旋3min。加入250uL含内标的MTBE溶剂,涡旋3min,冰浴下超声5min;12000r/min、4℃条件下离心10min;
离心完后吸取上层清液100uL到编号有玻璃内衬管的进样瓶中,-20℃冰箱保存,GC-MS/MS分析后结果如图2所示,GC-MS/MS测试条件如表1及表3所示。
将S1测试数据代入标准曲线,求出结果,结果如表5所示。
表5血清样本短链脂肪酸浓度(mg/L)
实施例4
小鼠粪便短链脂肪酸的测试
将小鼠粪便进行预处理后,其余处理及测试方法如实施例3所示。
小鼠粪便的预处理方法为:
称取样本100mg于2mlEP管中,加入1.5ml磷酸(0.5%v/v)溶液,加入一颗小钢珠,20Hz下球磨仪10s,重复2次,涡旋10min混匀(所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大),再冰浴下超声5min。
12000r/min、4℃条件下离心10min,取上清液200μL加入到对应的已编号的1.5mL离心管中,加入500μL含内标的MTBE溶剂,涡旋3min。
冰浴下超声5min;
小鼠粪便样品GC-MS/MS测试数据如图3所示,GC-MS/MS测试条件如表1及表3所示。
将测试结果带入标准曲线。
测试结果如表6所示。
表6小鼠粪便样品短链脂肪酸浓度(mg/L)
实施例5
饲料链脂肪酸的测试
饲料的预处理方法为:
球磨仪研磨成粉末,称取100mg于2mlEP管中,加入0.5ml磷酸(0.5% v/v)溶液,涡旋10min混匀(所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大),冰浴下超声5min;
加入500μL含内标的MTBE溶剂,涡旋3min,冰浴下超声5min;
12000r/min、4℃条件下离心10min;
离心完后吸取上层清液200μL到编号有玻璃内衬管的进样瓶中,-20℃冰箱保存,待GC-MS/MS分析,GC-MS/MS测试条件如表1及表3所示。
饲料样品GC-MS/MS测试数据如图4所示。
带入线性标准曲线后,得到结果。
测试结果如表7所示。
表7饲料样本短链脂肪酸浓度(mg/L)
实施例6
精密度实验:
日内精密度:量取32份相同重量的样本,其中6份加入10微升0.1ppm 的混标,6份10微升1ppm的混标,最后6份加入10ppm的混标,进行上述的前处理过程,当天上机检测;
日间精密度:上述实验重复做三套,每天做一套;每一套当天检测,上机检测后数据一起处理未日间精密度;
回收率实验:利用精密度实验的数据,回收率计算方法:加标样浓度减去实际样本浓度除以加的标品浓度;
测试结果如表8所示。
表8精密度及回收率结果
实施例7
加酸量的优化实验
按实施例3方法测试血清样品,与实施例3不同的是分别往测试样品中加入同体积的36%(36%v/v)磷酸溶液与5%(5%v/v)磷酸溶液,分别测试其结果,得到结果如表9所示。
表9血清样品酸优化结果(mg/L)
血清 | Name | 0.5%磷酸 | 36%磷酸 |
1 | 乙酸 | 1.227 | 1.0234 |
2 | 丙酸 | 0.5057 | 0.4025 |
3 | 异丁酸 | 0.3071 | 0.3978 |
4 | 丁酸 | 0.5381 | 0.4827 |
5 | 异戊酸 | 0.4654 | 0.3686 |
6 | 戊酸 | 0.2673 | 0.2778 |
7 | 己酸 | 0.4321 | 0.3213 |
按实施例4方法测试粪便样品,与实施例4不同的是分别往测试样品中加入同体积的36%(36%v/v)磷酸溶液与5%(5%v/v)磷酸溶液,分别测试其结果,得到结果如表10所示。
表10粪便样品酸优化结果(mg/L)
按实施例5方法测试饲料样品,与实施例5不同的是分别往测试样品种加入同体积的36%(36%v/v)磷酸溶液与5%(5%v/v)磷酸溶液,分别测试其结果,得到结果如表11所示。
表11饲料样品优化结果(mg/L)
饲料 | Name | 0.5%磷酸 | 36%磷酸 |
1 | 乙酸 | 5.78 | 5.62 |
2 | 丙酸 | 3.0885 | 2.75 |
3 | 异丁酸 | 0.249 | 0.26 |
4 | 丁酸 | 0.1897 | 0.1922 |
5 | 异戊酸 | 0.037 | 0.025 |
6 | 戊酸 | 0.509 | 0.43 |
7 | 己酸 | 0.0604 | 0.0666 |
上述结果表明,对于血清样品,采用体积百分比为36%的磷酸,提取效果更佳,对于粪便样品及饲料样品,采用体积百分比为0.5%的磷酸,提取效果更佳。
对比例1
乙醚作为提取液进行血清样本前处理:
步骤S1:血清样本解冻后,涡旋1min混匀(所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大)。
取血清样本50μL加入到对应的已编号的1.5mL离心管中,加入200μL 36%磷酸溶液,涡旋3min。加入250μL含内标的乙醚溶剂,涡旋3min,冰浴下超声5min;12000r/min、4℃条件下离心10min;
离心完后吸取上层清液100μL到编号有玻璃内衬管的进样瓶中,-20℃冰箱保存,GC-MS/MS分析后结果如图5所示,GC-MS/MS测试条件如实施例1所示。
结果分析:从图2及图5可以明显看出,同样的检测参数下,MTBE提取样本的检测结果优于乙醚;
乙醚即使前处理在低温下操作,对其挥发进行控制,分离效果依然不理想。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,所述短链脂肪酸的检测方法包括:
步骤S1:配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液,并往所述标准品混合液中加入内标,采用气相色谱-质谱联用仪测试,求出线性回归方程;
步骤S2:往测试样本中加入酸液及含内标的提取液进行提取,得到分离液,利用气相色谱-质谱联用仪测试所述分离液;
步骤S3:将步骤S2测试结果代入所述线性回归方程,计算测试样品的短链脂肪酸含量;
其中,所述提取液为甲基叔丁基醚;
所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸及己酸。
2.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,所述步骤S2中,提取过程包括:测试样本加入酸液及提取液,经涡旋、超声及离心处理进行分离后,取分离液。
3.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,所述步骤S2中,提取过程包括:测试样本加入酸液及提取液后,在4℃以下处理。
6.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,所述内标为2-甲基戊酸。
7.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,所述酸液为体积百分比为0.5%的磷酸或体积百分比为36%的磷酸。
8.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,测试样品为血清样品,所述酸液为体积百分比为36%的磷酸。
9.根据权利要求1所述一种短链脂肪酸的检测方法,其特征在于,测试样品为饲料样品或粪便样品,所述酸液为体积百分比为0.5%的磷酸。
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CN114740107A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-07-12 | 武汉生物样本库有限公司 | 基于gc-ms或gc-ms/ms测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法 |
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