CN115856131A

CN115856131A - 一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法

Info

Publication number: CN115856131A
Application number: CN202211545441.0A
Authority: CN
Inventors: 尹小丽; 廖志正; 易木林
Original assignee: Hunan Taixin Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Taixin Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明属于医药检测技术领域，公开一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法，包括以下步骤：血浆样品处理：血浆样品解冻后加入内标，经涡旋后加入沉淀剂，涡旋离心后取上清液，得到待检测血浆样品；采用液质联用系统对待检测血浆样品进行测定；所述液质联用系统的液相条件为：流动相采用含甲酸水溶液和乙腈的混合液，梯度洗脱；质谱条件为：采用ESI源，正离子MRM模式检测。本发明具有专属性强，灵敏度高，样品预处理简单、快速，分析周期短等特点，适于血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度测定和药代动力学研究以及组织分布研究。

Description

一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法

技术领域

本发明涉及药物动力学和医药检测技术领域，具体涉及一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法。

背景技术

赛拉瑞韦钾片是一款治疗丙肝的NS3/4A蛋白酶抑制剂，为多元环结构，可阻断HCV病毒表达的单链多肽的酶切过程；该药是新一代蛋白酶抑制剂，与第一代上市药物相比，赛拉瑞韦钾具有更好的药效与药代动力学特征。其结构如式(A)所示：

目前国内尚无针对丙肝的小分子靶向药上市，赛拉瑞韦钾片有望成为中国首个口服丙肝疗法。

文献(Molecules 2015,20,4319-4336)中，建立了一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法测定生物样品(Beagle犬、SD大鼠血浆)中塞拉瑞韦钾的浓度并且研究了赛拉瑞韦钾的体内药代动力学行为。选用紫杉醇作为内标，样品前处理采用甲基叔丁基醚进行液液萃取，建立的Beagle犬血浆样品分析方法的线性范围为1.996～4990.00ng/ml，SD大鼠血浆样品分析方法的线性范围为1.990～4975.00ng/ml，最低定量下限为2ng/ml，但是该方法在实际运用过程中仍旧需要二次开发，在临床研究中存在局限性。

为了能有效开展赛拉瑞韦钾在人体内的吸收、分布、代谢、排泄有关特征的药代动力学研究，有必要建立一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法，采用LC-MS/MS法测定人血浆中赛拉瑞韦钾浓度，检测灵敏度高，结果准确可靠，预处理简单，快速，血浆用量少，重现性好。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法，包括以下步骤：

(3)血浆样品处理：血浆样品解冻后加入内标，经涡旋后加入沉淀剂，涡旋离心后取上清液，得到待检测血浆样品；

(4)采用液质联用系统对待检测血浆样品进行测定；

所述液质联用系统的液相条件为：流动相采用含甲酸水溶液和乙腈的混合液，梯度洗脱；

质谱条件为：采用ESI源，正离子MRM模式检测。

进一步地，所述质谱条件中定量分析的离子分别为：赛拉瑞韦钾：m/z865.3→214；内标IS：m/z839.2→214；碰撞能量均为46V。

进一步地，所述内标为GP199甲醇溶液，其浓度为200ng/mL。

进一步地，所述血浆样本来源：采集自给予口服赛拉瑞韦钾片的健康人体，经肝素钠抗凝，分离后的血浆样本待测，检测前自然解冻。

进一步地，所述血浆样品处理过程如下：50μL血浆样品解冻后加入20μL内标，经涡旋30s后加入300μL沉淀剂，涡旋3min，2490g，10min，离心后取10μL上清液，得到待检测血浆样品。

进一步地，所述液质联用系统的液相条件为：

色谱柱：WatersXBridgeC18(4.6×50mm，3.5micron)；

保护柱：Gemini C18(4×3.0mm，Phenomenex，USA)；

流动相A∶0.1％甲酸水溶液，流动相B∶乙腈；

流速0.6mL·min^-1；停止时间5.00min；洗针程序：洗针液冲洗5s；进样量10μL；柱温30℃；最大压力为400.00bar；

流动相比例设置如下

1)0-2.40min,流动相A和流动相B的体积比为3:7；

2)2.41-2.80min,流动相A和流动相B的体积比为5:95；

3)2.81-5.00min,流动相A和流动相B的体积比为3:7。

进一步地，所述液质联用系统的质谱条件为：

采用ESI源，正离子MRM模式检测；

赛拉瑞韦钾的参数设置如下：ISTD：No，Q1 Mass：865.3Da，Q2 Mass：214 Da，Dwell：200msec，Frag：150，CE：46，Cell Acc：4，Polarity：Positive；

GP199的参数设置如下：ISTD：Yes，Q1 Mass：839.2Da，Q2 Mass：214Da，Dwell：200msec，Frag：150，CE：46，Cell Acc：4，Polarity：Positive；

质谱切换阀设置如下：1)Total time：1.0min，Position：B；2)Total time：3.5min，Position：A；

质谱切换阀设置如下：0～0.8min，To waste；0.8min～，To MS；

离子源参数设置如下：

Parameter	Value(+)	Value(-)
			Gas Temp(℃)	350	350
Gas Flow	10	10
			Nebulizer(psi)	45	45
Sheath Gas	320	320
			Sheath Gas Flow	11	11
Capillary(V)	4000	3500
			VChaging	500	500

。

进一步地，所述检测方法对赛拉瑞韦钾定量分析的线性范围为0.500～200ng/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明提供了一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法，建立了复杂生物基质血浆中微量目标化合物的定量检测方法，能够有效测定给予赛拉瑞韦钾的体内浓度。

本发明的血浆样品采用乙腈沉淀蛋白；涡旋混合后，离心取上清液直接进样，该处理方法简单快速且方便，适用于常规定量分析检测，尤其对于大批量样品的检测，减少操作步骤和操作时间，具有重要意义，大大加快大批量样品的处理时间。

在本实验所采用的色谱条件下，赛拉瑞韦钾的保留时间为2.54min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的赛拉瑞韦钾的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限0.5ng/mL，在0.5～200ng/mL浓度范围内呈线性，批内和批间精密度RSD均小于±15％。本发明方法重现性好，准确度高，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同人群的血浆对本发明方法无干扰现象。

本发明方法对生物体血浆样本的取样量少，只需50μL即可完成检测。在5min内即可检测到目标药物，为人体血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度测定以及药代动力学研究与组织分布的研究提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 LC-MS/MS法测得的人血浆中赛拉瑞韦钾的标准曲线图；

图2 LC-MS/MS法测得的人血浆中赛拉瑞韦钾的液质图；

图3 LC-MS/MS法测得的人血浆中GP199的液质图；

图4 赛拉瑞韦钾正离子多反应检测扫描质谱图；

图5 GP199正离子多反应检测扫描质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.主要仪器

Agilent G6470型三重四极杆液质联用仪，配有液相色谱仪(含自动进样器)、电喷雾电离离子源(ESI)及Agilent Mass Hunter Workstation Software数据处理系(Agilent，美国)；METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平(METTLER，瑞士)；XW-80A涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂)；多管涡旋振荡器(安简(北京)科技有限公司)；TGL16M型冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；DW-25L262医院低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；DW-86 L578J医院低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；DW-HL388超低温冷冻储存箱(中科美菱低温科技股份有限公司)；Eco-S15HUVF实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。

2.色谱条件

色谱条件色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×50mm，3.5micron)；

保护柱：Gemini C18(4×3.0mm，Phenomenex，USA)；

流动相A∶0.1％甲酸水溶液，流动相B∶乙腈；

流速0.6mL·min^-1；停止时间3.00min；洗针程序：洗针液冲洗5s；进样量10μL；柱温30℃；流动相比例设置如下表1：

	Time	A	B	Max Pressure
					1	0.00min	30.0％	70.0％	400.00bar
2	2.40min	30.0％	70.0％	400.00bar
					3	2.41min	5.0％	95.0％	400.00bar
4	2.80min	5.0％	95.0％	400.00bar
					5	2.81min	30.0％	70.0％	400.00bar
6	3.00min	30.0％	70.0％	400.00bar

6.2.2.2质谱条件

采用ESI源，正离子MRM模式检测，具体参数设置如表2：

质谱切换阀设置如下表3：

	Start Time(min)	Div Valve
			1	0	To waste
2	0.8	To MS

离子源参数设置如下表4：

Parameter	Value(+)	Value(-)
			Gas Temp(℃)	350	350
Gas Flow(L/min)	10	10
			Nebulizer(psi)	45	45
Sheath Gas Heater	320	320
			Sheath Gas Flow	11	11
Capillary(V)	4000	3500
			VChaging	500	500

4.抗凝剂：肝素钠

5.内标：

(GP199)，类白色粉末，纯度不得低于90％。

6.数据处理

色谱保留时间及色谱峰面积由Agilent Mass Hunter Workstation Software采集处理与定量分析，采用Agilent ECM网络系统。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。

实施例1

1.溶液配制

流动相A：(0.1％甲酸水溶液)量取1L超纯水，加入1mL甲酸，混匀。

流动相B：(乙腈)量取1L乙腈至适当的溶剂瓶中。

稀释溶液(甲醇∶水，50∶50，v/v)：分别取50mL甲醇和50mL超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀。

洗针溶液配制(甲醇∶水，50∶50，v/v)：取500mL甲醇与500mL纯化水至适当的溶剂瓶中，混匀。

沉淀剂：乙腈。

2.标准溶液配制：

标准对照品储备液的配制

赛拉瑞韦钾对照品储备液的配制(STD stock，1mg/mL)

称取赛拉瑞韦钾对照品略多于10mg(原始记录中准确记录称量重量)，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用10mL移液管吸取10mL甲醇加入玻璃瓶中，摇匀，根据实际称量值及赛拉瑞韦钾含量((1-3.4％)*99.3％)计算浓度达到1mg/mL所需补加的甲醇量，用移液器补加甲醇量至赛拉瑞韦钾浓度达到1mg/mL，摇匀。即得含赛拉瑞韦钾浓度为1mg/mL的标准对照品储备溶液，置于-20℃条件下保存。

标准系列工作溶液的配制如表5：

标准曲线标准血浆样品的配制如表6：

3.内标标准溶液配制

内标储备溶液配制

对照品储备溶液配制(IS Stock，1mg/mL)

称取GP199对照品略多于10mg(原始记录中准确记录称量重量)，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用10mL移液管吸取10mL甲醇加入玻璃瓶中，摇匀，根据实际称量值及GP199含量(93.91％)计算浓度达到1mg/mL所需补加的甲醇量，用移液器补加甲醇量至GP199浓度达到1mg/mL，摇匀。即得含GP199浓度为1mg/mL的质控对照品储备溶液，置于-20℃条件下保存。

内标工作溶液配制(IS Spike2，200ng/mL)

吸取50.0μL内标对照品储备液(IS Stock，1mg/mL)，加稀释液950μL，得50.0μg/mL的IS Spike 1。

吸取200μL内标对照品工作液(IS Spike 1，50.0μg/mL)置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，即得浓度为200ng/mL的内标工作溶液，转移至棕色广口瓶中，置于-20℃条件下保存。

4.赛拉瑞韦钾质控对照品储备液的配制(QC stock，1mg/mL)

称取赛拉瑞韦钾对照品略多于10mg(原始记录中准确记录称量重量)，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用10mL移液管吸取10mL甲醇加入玻璃瓶中，摇匀，根据实际称量值及赛拉瑞韦钾含量((1-3.4％)*99.3％)计算浓度达到1mg/mL所需补加的甲醇量，用移液器补加甲醇量至赛拉瑞韦钾浓度达到1mg/mL，摇匀。即得含赛拉瑞韦钾浓度为1mg/mL的质控对照品储备溶液，置于-20℃条件下保存。

质控溶液配制

按以下表格程序配制如表7：

注：质控工作溶液均存于-20℃条件下保存。

质控血浆样品配制

按以下表格程序配制如表8：

4.血浆样品处理步骤

·取出IS Spike2、空白血浆、SST样品，标准曲线血浆样品STD 1～8、未知生物样品、解冻后涡旋1min；

·分别移取空白血浆(Double blank、Blank、carryover)、超纯水(Reagent andMaterials blank)、标准曲线血浆样品、SST样品、未知生物样品50.0μL至96孔处理板中。

·加20.0μL内标(IS Spike2，200ng/mL)至Blank样品、标准曲线血浆样品、未知生物样品、SST样品中，并加入稀释液20.0μL至Double blank、carryover、Reagent andMaterials blank。

·盖96孔板后，涡旋30s。

·每个孔中加入乙腈沉淀剂300μL。

·盖96孔板后，涡旋3min。

·离心，2490g，10min。

·10.0μL进样到色谱系统分析。

备注：Double blank为双空白样品、carryover为残留考察用双空白样品、blank只加内标的单空白样品、Reagent and Materials blank为试剂耗材验收样品。

5.方法学验证

5.1线性范围和定量下限

取配制的标准曲线血浆样品STD 1～850μL至96孔处理板中，样品孔中(96孔板)加入20μL内标(IS Spike2，200ng/mL)。

封板，涡旋30s。每个孔中加入乙腈沉淀剂300μL。盖96孔板后，涡旋3min。离心，2490g，10min。10μL进样到色谱系统分析。

将检测的结果采用加权最小二乘法进行回归分析，得到标准曲线，所得标准曲线样品的线性曲线如下图1所示，x表示待测药物浓度；y表示待测药物与内标峰面积之比：线性方程为y＝0.0118x-0.001251，R²＝0.99615855；最低检测限的液质图如图2-3所示；

赛拉瑞韦钾的线性范围为0.5～200ng/mL，血药浓度的最低定量下限为0.5ng/mL，在线性范围内线性关系良好。

5.2精密度与准确度

取四个不同浓度的质控血浆样品，质控血浆样品液的浓度分别为1.5ng/mL、16ng/mL、160ng/mL、1600ng/mL，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度，如下表9：

结果表明：LLOQ浓度水平样品应在标示值的80％～120％范围内，其他浓度水平样品应在标示值的85％～115％范围内。每个浓度质控样品的准确度一般应在85～115％，每一分析批至少2/3的质控样品，且每一个浓度水平至少50％的样品符合要求。说明本发明方法对血浆中的赛拉瑞韦钾的检测具有良好的精密度和准确度。

5.3系统适用性：

取经预处理过的赛拉瑞韦钾质控血浆样品，浓度为0.5ng/mL；10μL进样检测，重复分析5次；

分别记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数，系统适用性如下表10：

结论：待测物信噪比(S/N不小于5)，5次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于5％；5次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于15.0％。说明本发明方法对血浆中药物的检测方法适用测定赛拉瑞韦钾。

以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种定量分析血浆中赛拉瑞韦钾的血药浓度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)血浆样品处理：血浆样品解冻后加入内标，经涡旋后加入沉淀剂，涡旋离心后取上清液，得到待检测血浆样品；

(2)采用液质联用系统对待检测血浆样品进行测定；

质谱条件为：采用ESI源，正离子MRM模式检测。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述质谱条件中定量分析的离子分别为：赛拉瑞韦钾：m/z 865.3→214；内标IS：m/z 839.2→214；碰撞能量均为46V。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述内标为GP199甲醇溶液，其浓度为200ng/mL。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述血浆样本来源：采集自给予口服赛拉瑞韦钾片的健康人体，经肝素钠抗凝，分离后的血浆样本待测，检测前自然解冻。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述血浆样品处理过程如下：50μL血浆样品解冻后加入20μL内标，经涡旋30s后加入300μL沉淀剂，涡旋3min，2490g，10min，离心后取10μL上清液，得到待检测血浆样品。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，，所述液质联用系统的液相条件为：

色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×50mm，3.5micron)；

保护柱：Gemini C18(4×3.0mm，Phenomenex，USA)；

流动相A∶0.1％甲酸水溶液，流动相B∶乙腈；

流动相比例设置如下

1)0-2.40min,流动相A和流动相B的体积比为3:7；

2)2.41-2.80min,流动相A和流动相B的体积比为5:95；

3)2.81-5.00min,流动相A和流动相B的体积比为3:7。

7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述液质联用系统的质谱条件为：

采用ESI源，正离子MRM模式检测；

赛拉瑞韦钾的参数设置如下：ISTD：No，Q1 Mass：865.3Da，Q2 Mass：214Da，Dwell：200msec，Frag：150，CE：46，CellAcc：4，Polarity：Positive；

GP199的参数设置如下：ISTD：Yes，Q1 Mass：839.2Da，Q2 Mass：214Da，Dwell：200msec，Frag：150，CE：46，CellAcc：4，Polarity：Positive；

质谱切换阀设置如下：0～0.8min，To waste；0.8min～，To MS；

离子源参数设置如下：

Parameter Value(+) Value(-) GasTemp(℃) 350 350 GasFlow(L/min) 10 10 Nebulizer(psi) 45 45 SheathGasHeater 320 320 SheathGasFlow 11 11 Capillary(V) 4000 3500 VChaging 500 500

。

8.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法对赛拉瑞韦钾定量分析的线性范围为0.500～200ng/mL。