CN114236016A - 一种快速、准确测定生物样本中48种游离脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用GC‑MS/MS的方法，通过样本分离萃取，能够在25分钟；检测人体血清中游离的48种脂肪酸；多反应检测模式建库，排除假阳性干扰，更为准确，且灵敏度高。
Description
技术领域
本申请涉及样本中标志物的检测，具体涉及48种游离脂肪酸的检测，属于生物检测领域。
背景技术
脂肪酸(Fatty acid，FA)由C、H、O三种元素组成，是一端含有一个羧基的脂肪族碳氢链。脂肪酸可分成两类：一类是分子内不带碳碳双键的饱和脂肪酸，如硬脂酸、软脂酸等；另一类是分子内带有一个或几个碳碳双键的不饱和脂肪酸，最常见的有油酸，油酸的碳链中只有一个碳碳双键，所以又叫单不饱和脂肪酸。一般脂肪酸化合物的碳链都较短，其长度一般在18-36个碳原子，最少的就是12个碳原子，如月桂酸。不管饱和的或不饱和的，生物体内脂肪酸的碳原子数大多是偶数，极少含有奇数碳原子，尤其是在高等动植物体内主要存在12碳以上的高级脂肪酸，一般在14-24个碳，以16和18碳脂肪酸最为常见。
游离脂肪酸又称为非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid，NEFA)。存在于人体内的脂质，大致可以分为胆固醇、中性脂肪(三酸甘油脂)、磷脂质等3种。游离脂肪酸是中性脂肪分解成的物质之一。当肌肉活动所需能源——肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。所以，游离脂肪酸可说是进行持久活动所需的物质。研究表明，胰岛素、脂联素、泛酸、促酰化蛋白等会促使血液中NEFA水平的降低，而肿瘤坏死因子-α、儿茶酚胺类激素、白细胞介素-6、瘦素等会导致NEFA水平的增加。另外，血液中NEFA水平的升高与心血管疾病、肝脏疾病、糖尿病等相关疾病关系密切，因此，临床上已经将测定血液中NEFA的水平作为评价和诊断上述疾病的辅助性指标。
气相色谱法–质谱法联用(英语：Gas chromatography–mass spectrometry，简称气质联用，英文缩写GC-MS)是一种结合气相色谱法和质谱法的特性，在试样中鉴别不同物质的分析的方法。GC-MS的使用包括药物检测(主要用于监督药物的滥用)、火灾调查、环境分析、爆炸调查和未知样品的测定。GC-MS也用于为保障机场安全测定行李和人体中的物质。另外，GC-MS还可以用于识别物质中以前认为在未被识别前就已经蜕变了的痕量元素。
GC-MS已经被广泛地誉为司法学物质鉴定的金标方法，因为它被用于进行“专一性测试”。所谓“专一性测试”就是能十分肯定地在一个给定的试样中识别出某个物质的实际存在。而非专一性测试则只能指出试样中有哪类物质存在。尽管非专一性测试能够用统计的方法提示该物质具体是那种物质，但存在识别上的正偏差。刘佩珊等利用GC-MS的方法检测血清中的游离脂肪酸，可以检测31种(刘佩珊等，气相色谱-质谱法测定血浆中31种游离脂肪酸含量，分析测试学报，2020年第8期)。本发明将克服现有技术中的缺陷，以更短的时间检测更多种类的游离脂肪酸。
发明内容
本发明公开了一种气相色谱-质谱联用仪25min内准确定性、定量分析生物样本中48种游离脂肪酸的方法，包括如下步骤：
(1)样本提取；
(2)向提取液中加入同位素正十七烷酸内标物，并加入三氟化硼甲醇溶液进行衍生化反应；
(3)衍生后溶液经过萃取，利用GC-MS/MS在25min内对生物样本中48种游离脂肪酸准确定性、定量分析。
在一个具体的实施例中，其中步骤(1)具体为：向血清样本中加入提取液，所述的提取液由甲醇：MEBE:36％磷酸按体积比为3:4:1组成；振荡3min，上清液吹干，加入200μL15％三氟化硼甲醇溶液，振荡2min，60℃烘箱下保持30min。
在另外一个具体的实施例中，所述步骤(3)的萃取是指：将步骤(1)获得的溶液冷却至室温，加入500μL正己烷，200μL饱和氯化钠溶液，振荡3min，4℃下12000r/min离心2min，取200μL上层溶液，至棕色进样瓶中玻璃内衬管内，用于GC-MS/MS分析。
在另外一个具体的实施例中，所述步骤(3)的GS-MS/MS分析中，气相色谱仪条件主要包括：1)色谱柱：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent公司)；2)载气：高纯氦(纯度>99.999％)；3)升温程序：40℃(保持2min)，以30℃/min升至200℃(保持1min)，以10℃/min升至240℃(保持1min)，以5℃/min升至285℃(保持3min)；4)流量：1.0mL/min；进样口温度：230℃；进样量：1.0μL。
在另外的一个具体实施例中，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析中，质谱条件如下：电子轰击离子源(Electron impact，EI)温度230℃；电离电压：70Ev；传输线温度：240℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：4.0min；扫描模式：SIM。
在另外的一个具体实施例中，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析还包括数据处理的步骤；优选的，所述的数据处理为：利用软件Qualitative Navigator处理质谱数据；更优选的，根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种游离脂肪酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；更优选的，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应游离脂肪酸的相对含量，最终得到样本中游离脂肪酸的定性和定量分析结果。
在另外一个具体的实施例中，所述的数据处理包括：(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断游离脂肪酸提取和检测的重复性；(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的游离脂肪酸标准品溶液，获取48种游离脂肪酸各个浓度标准品的对应定量信号质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制48种游离脂肪酸标准曲线；(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有游离脂肪酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式，计算后得到实际样本中每种游离脂肪酸的绝对含量。
本发明的第二个方面是提供上述方法在血清样本中游离氨基酸含量的检测的应用；优选的，所述的应用为非诊断方法的应用；更优选的，所述的检测样本为人体样本；最优选的，所述的样本为人体血清样本。
本发明的有益效果包括：分离时间短，大多分离时间为30分钟以上，本方法25分钟；检测物质多，大多在40种以内，本方法48种物质；多反应检测模式建库，排除假阳性干扰，更为准确，且灵敏度高。
附图说明
图1为48种游离脂肪酸TIC重叠图。
具体实施方式
1、液体样本提取方法：
(1)取50μL血清样本，加入400μL提取液(甲醇：甲基叔丁基醚：36％磷酸＝3:4:1，V/V/V)，每份样本中加入20μL(10ppm)同位素正十七烷酸内标物，振荡3min，上清液吹干，加入200μL 15％三氟化硼甲醇溶液，振荡2min，60℃烘箱下保持30min。
(2)冷却至室温，加入500μL正己烷，200μL饱和氯化钠溶液，振荡3min，4℃下12000r/min离心2min，取200μL上层溶液，至棕色进样瓶中玻璃内衬管内，用于GC-MS/MS分析。
2、仪器参数条件：
GC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括气相色谱仪(Agilent7890B)和串联质谱MS/MS(7000D)。其中，气相色谱仪条件主要包括：
1)色谱柱：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent公司)；
2)载气：高纯氦(纯度>99.999％)；
3)升温程序：40℃(保持2min)，以30℃/min升至200℃(保持1min)，以10℃/min升至240℃(保持1min)，以5℃/min升至285℃(保持3min)；
4)流量：1.0mL/min；进样口温度：230℃；进样量：1.0μL。
3、质谱条件如下：
电子轰击离子源(Electron impact，EI)温度230℃；电离电压：70Ev；传输线温度：240℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：4.0min；扫描模式：SIM。
4、游离脂肪酸的数据处理
利用软件Qualitative Navigator处理质谱数据。根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种游离脂肪酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应游离脂肪酸的相对含量，最终得到样本中游离脂肪酸的定性和定量分析结果。
离子对信息如下表所示：
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断游离脂肪酸提取和检测的重复性，48种游离脂肪酸TIC重叠图如图1所示。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的游离脂肪酸标准品溶液，获取48种游离脂肪酸各个浓度标准品的对应定量信号质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制48种游离脂肪酸标准曲线。
所述的标准曲线如下表所示：
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有游离脂肪酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式，计算后得到实际样本中每种游离脂肪酸的绝对含量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。
Claims (8)
1.一种气相色谱-质谱联用准确定性、定量分析生物样本中48种游离脂肪酸的方法，包括如下步骤：
(1)样本提取；
(2)向提取液中加入同位素正十七烷酸内标物，并加入三氟化硼甲醇溶液进行衍生化反应；
(3)衍生后溶液经过萃取，利用GC-MS/MS在25min内对生物样本中48种游离脂肪酸准确定性、定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)具体为：向血清样本中加入提取液，所述的提取液由甲醇：MEBE:36％磷酸按体积比为3:4:1组成；振荡3min，上清液吹干，加入200μL15％三氟化硼甲醇溶液，振荡2min，60℃烘箱下保持30min。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)的萃取是指：将步骤(1)获得的溶液冷却至室温，加入500μL正己烷，200μL饱和氯化钠溶液，振荡3min，4℃下12000r/min离心2min，取200μL上层溶液，至棕色进样瓶中玻璃内衬管内，用于GC-MS/MS分析。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)的GS-MS/MS分析中，气相色谱仪条件主要包括：1)色谱柱：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent公司)；2)载气：高纯氦(纯度>99.999％)；3)升温程序：40℃(保持2min)，以30℃/min升至200℃，保持1min，以10℃/min升至240℃，保持1min，以5℃/min升至285℃保持3min；4)流量：1.0mL/min；进样口温度：230℃；进样量：1.0μL。
5.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析中，质谱条件如下：电子轰击离子源温度230℃；电离电压：70Ev；传输线温度：240℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：4.0min；扫描模式：SIM。
6.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析还包括数据处理的步骤；优选的，所述的数据处理为：利用软件Qualitative Navigator处理质谱数据；更优选的，根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种游离脂肪酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；更优选的，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应游离脂肪酸的相对含量，最终得到样本中游离脂肪酸的定性和定量分析结果。
7.根据权利要求1所述的方法，所述的数据处理包括：(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，以判断游离脂肪酸提取和检测的重复性；(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的游离脂肪酸标准品溶液，获取48种游离脂肪酸各个浓度标准品的对应定量信号质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制48种游离脂肪酸标准曲线；(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有游离脂肪酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式，计算后得到实际样本中每种游离脂肪酸的绝对含量。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在血清样本中游离氨基酸含量的检测的应用；优选的，所述的应用为非诊断方法的应用；更优选的，所述的检测样本为人体样本；最优选的，所述的样本为人体血清样本。
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