CN113311098A - 一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,包括步骤:将母乳定量滴于干血斑卡片固定的斑点范围内,干燥制成干乳斑,干乳斑经干血斑提取系统提取,用液相色谱‑质谱联用仪分析,采用外标法测定。本发明方法将母乳采用专用卡片收集干乳斑样本,便于运输保存,使用自动萃取仪‑串联液相色谱‑串联质谱法(DBS‑LC‑MS法),省去繁琐的检测前处理,且不需使用昂贵的同位素内标,即能达到准确测定母乳中游离Omega‑3脂肪酸和游离Omega‑6脂肪酸,该检测方法简单、快速、准确、检测成本低,以期为开展泌乳期母婴个性化膳食摄入研究提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测领域,具体涉及一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法。
背景技术
母乳是婴儿最理想的天然食品,母乳中含有3%-5%的脂肪,是婴儿营养的重要组成,可为婴幼儿生长发育提供45%~60%的能量,并且母乳脂肪酸作为生物活性物质影响婴儿中枢神经系统发育,尤其是Omega-3脂肪酸和Omega-6脂肪酸等多不饱和脂肪酸。
目前行业内对母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的检测一般使用气相色谱-串联质谱法(GC-MS),该方法具有高选择性,高特异性和高灵敏度等优点。但由于GC-MS法存在母乳样本在运输途中十分不便,样本用量大,检测方法前处理步骤比较繁琐,前处理步骤包括游离脂肪酸的提取,游离脂肪酸的固相萃取柱净化,游离脂肪酸的甲酯化,GC-MS测定等,而且为了消除基质效应需要添加昂贵的同位素内标,检测时间长,检测成本高,难以适用于大样本的乳母和婴儿人群的健康监测需要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,该方法简单、快速、准确、检测成本低。
本发明是通过以下技术方案实现:
一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,包括如下步骤:
将母乳定量滴于干血斑卡片固定的斑点范围内,干燥制成干乳斑,干乳斑经干血斑提取系统提取,用液相色谱-质谱联用仪分析,采用外标法测定。
本发明所述的游离脂肪酸为游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸,具体可以为α-亚麻酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)、(7,10,13,16,19)二十二碳五烯酸(DPA n-3)、二十碳五烯酸(EPA)、亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、11,14-二十碳二烯酸(EDA)、二十碳三烯酸(DGLA)、花生四烯酸(二十碳四烯酸)(AA)、7,10,13,16-二十二碳四烯酸(AdA)、(4,7,10,13,16)二十二碳五烯酸(DPA n-6)等。
优选的,所述干燥的时间为2-4小时。
优选的,所述干血斑提取系统中采用的萃取液为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种,更优选为乙腈。
为保证充分萃取,优选的,所述萃取液与母乳的体积比为(3-5):2。
优选的,所述液相色谱的条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以2.5-10mmol/L乙酸铵溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,流速为0.2-0.5ml/min;柱温为25-45℃;梯度洗脱程序如下:
时间min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 40 | 60 |
1 | 40 | 60 |
4.5 | 2 | 98 |
7 | 2 | 98 |
7.1 | 40 | 60 |
10 | 40 | 60 |
。
优选的,所述质谱条件为:电离方式:电喷雾正离子模式;检测方式:多反应检测MRM;气帘气压力:35psi;离子喷雾电压:-4500V;温度:650℃;雾化气:50psi;辅助加热气:50psi。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:
本发明提供了一种通过干乳斑测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,将母乳采用专用卡片收集干乳斑样本,便于运输保存,使用干血斑提取系统-串联液相色谱-串联质谱法(DBS-LC-MS法),省去繁琐的检测前处理,且不需使用昂贵的同位素内标,即能达到准确测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸,该检测方法简单、快速、准确、检测成本低,以期为开展泌乳期母婴个性化膳食摄入研究提供科学依据。
本发明通过对干乳斑中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验、方法对比试验,证明该含量测定方法科学有效,能对干乳斑的游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸含量起到质量控制的目的。
附图说明
图1为空白色谱图;
图2为对照色谱图;
图3为流动相为乙酸铵溶液-甲醇的色谱图;
图4为流动相为甲酸铵溶液-乙腈的色谱图;
图5为流动相乙酸铵溶液-乙腈的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明,以下实施例为本发明具体的实施方式,但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1:一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法
1仪器
干血斑提取系统:DBS-MS 500(CAMAG,瑞士);液相色谱-质谱联用仪:LC-30A型液相色谱仪(SHIMADZU,日本)串联QTRAP 4500型质谱仪(AB SCIEX,美国);XP205型电子天平(Mettler Toledo,瑞士)。
2试剂
试剂:一级用水;乙腈(色谱纯);乙酸铵(LC-MS);异丙醇(色谱纯);甲酸(LC-MS)。对照品如表1:
表1
名称 | 厂家 | 批号 | 规格 |
α-亚麻酸(ALA) | ANPEL | 91620050 | 100mg |
二十二碳六烯酸(DHA) | Supelco | FN03032006 | 0.5mL(500μg/mL) |
(7,10,13,16,19)二十二碳五烯酸(DPA n-3) | ANPEL | F4430010 | 100mg |
二十碳五烯酸(EPA) | ANPEL | H0660050 | 100mg |
亚油酸(LA) | SIGMA | BCCC2597 | 5mL(>98%) |
γ-亚麻酸(GLA) | ANPEL | Y1320020 | 100mg |
11,14-二十碳二烯酸(EDA) | ANPEL | X2810010 | 100mg |
二十碳三烯酸(DGLA) | ANPEL | U5260010 | 100mg |
花生四烯酸(二十碳四烯酸)(AA) | ANPEL | 96080010 | 100mg |
7,10,13,16-二十二碳四烯酸(AdA) | NU-CHEK | U-83A-JY9-D | 100mg |
(4,7,10,13,16)二十二碳五烯酸(DPA n-6) | NU-CHEK | U-102A-A2-E | 10mg |
3分析方法
3.1仪器条件与参数:
3.1.1干血斑提取系统条件
干血斑卡片:AHLSTROM MUNKSJO Auto Collect Color;萃取液:乙腈;萃取体积:40μL;定量环:约3.8μL(0.18mm*150mm)。
3.1.2液相色谱条件
本发明对液相色谱条件进行了优化:
本发明使用了液相色谱-质谱联用仪,ALA和GLA是同分异构体,它们的离子对具有相同的质荷比,色谱条件优化的关键是使ALA和GLA达到分离,为此本发明对流动相做了如下优化:
(1)尝试使用5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇作为流动相,如图3所示,ALA和GLA达不到基线分离;
(2)尝试使用5mmol/L甲酸铵溶液-乙腈作为流动相,如图4所示,ALA和GLA达不到基线分离;
(3)尝试使用5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈作为流动相,如图5所示,ALA和GLA能达到基线分离。
因此,本发明确定优选的色谱条件为:色谱柱:Waters,ACQUITY UPLC BEHC18,100×2.1mm,2.5μm;柱温:40℃;流速:0.3mL/min;流动相:A为5mmol/L乙酸铵溶液,B为乙腈,按下表2梯度洗脱;
表2
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 40 | 60 |
1 | 40 | 60 |
4.5 | 2 | 98 |
7 | 2 | 98 |
7.1 | 40 | 60 |
10 | 40 | 60 |
3.1.3质谱条件(见表3)
MRM模式:
表3
CUR | CAD | IS | TEM | GS1 | GS2 | EP | CXP |
35 | Medium | -4500 | 650 | 50 | 50 | -10 | -10 |
*定量离子对。
3.2对照品溶液的配制
精密称取ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6对照品适量,加异丙醇溶解并定容,摇匀,即得ALA(8.56mg/mL)、DHA(0.5mg/mL)、DPA n-3(2.96mg/mL)、EPA(0.668mg/mL)、LA(102.0mg/mL)、GLA(3.16mg/mL)、EDA(15.04mg/mL)、DGLA(17.00mg/mL)、AA(8.83mg/mL)、AdA(3.724mg/mL)、DPA n-6(0.504mg/mL)的储备标准液。
分别精密移取适量储备标准液,置液相样品瓶中,加异丙醇补足体积至1mL,摇匀,即得工作标准液,见下表4。
表4:
3.3标准工作曲线绘制
精密吸取工作标准液4μL,滴于卡片固定的斑点范围内,在避光的环境,干燥3h制成工作标准卡片,工作标准卡片按照3.1条件,经干血斑提取系统提取,注入液相色谱-质谱联用仪,建立标准曲线方程。
3.4供试品制备(干乳斑)
精密吸取母乳20μL,滴于干血斑卡片固定的斑点范围内,在避光的环境,干燥3h制成干乳斑,干乳斑按照3.1条件,经干血斑提取系统提取,注入液相色谱-质谱联用仪,测定各成分含量。
3.5结果计算:
工作标准液4μL与母乳20μL能均匀分布于卡片固定的斑点范围内,建立标准曲线方程时,工作标准液的浓度应除以5,通过标准曲线方程,计算母乳各成分的含量。游离Omega-3脂肪酸包括:ALA、DHA、DPA n-3;游离Omega-6脂肪酸包括:EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6。
4方法学验证
4.1专属性试验(空白)
4.1.1试验方法
不加样品,按3.4试样制备方法处理空白溶液,按3.1条件测定空白溶液,与ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6工作标准液的出峰时间对比。
4.1.2试验结果(见图1-2)。
4.1.3试验结论:
空白溶液在ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6的出峰时间处均无峰,表明空白对测定结果基本无干扰。
4.2线性范围确认
4.2.1试验数据如表5:
表5
名称 | 线性方程 | 相关系数(R) |
ALA | y=4491.29891x-2516.98709 | 0.99917 |
DHA | y=124737x+21868.75964 | 0.99934 |
DPA n-3 | y=38082.1x-3269.44040 | 0.99956 |
EPA | y=66442.4x-2011.18761 | 0.99916 |
LA | y=751.75066x+113589 | 0.99724 |
GLA | y=16005.03515x-1092.18010 | 0.99922 |
EDA | y=36156.1x+475048 | 0.99277 |
DGLA | y=3601.67013x-6325.84657 | 0.99954 |
AA | y=45522.5x-49001.4 | 0.99890 |
AdA | y=28305.06939x+14948.33398 | 0.99961 |
DPA n-6 | y=106660x+485.74602 | 0.99938 |
4.2.4线性试验结论
线性评价:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6相关系数R分别为0.99917、0.99934、0.99956、0.99916、0.99724、0.99922、0.99277、0.99954、0.99890、0.99961、0.99938,所以用该方法测定游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6呈现良好的线性,符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99】。
4.3检出限和定量限
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析浓度,QL定义为S/N=10时对应的待分析浓度。
ALA:检出限为:1μg/mL,定量限为:3μg/mL。
DHA:检出限为:0.05μg/mL,定量限为:0.15μg/mL。
DPA n-3:检出限为:0.04μg/mL,定量限为:0.12μg/mL。
EPA:检出限为:0.04μg/mL,定量限为:0.12μg/mL。
LA:检出限为:7μg/mL,定量限为:21μg/mL。
GLA:检出限为:0.5μg/mL,定量限为:0.15μg/mL。
EDA:检出限为:0.1μg/mL,定量限为:0.3μg/mL。
DGLA:检出限为:1.4μg/mL,定量限为:4.2μg/mL。
AA:检出限为:0.2μg/mL,定量限为:0.6μg/mL。
AdA:检出限为:0.1μg/mL,定量限为:0.3μg/mL。
DPA n-6:检出限为:0.04μg/mL,定量限为:0.12μg/mL。
4.4精密度试验
4.4.1日内精密度
4.4.1.1试验方法
取6份样品,按3.4试样制备方法处理样品,检测样品含量,计算其RSD(%)。
4.4.1.2试验数据(见下表6)【试验样品为:干乳斑】
表6
4.4.1.3试验结论
6份样品游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6含量的RSD分别为3.5%、2.3%、2.7%、3.3%、2.5%、2.3%、3.2%、3.8%、2.7%、1.3%、3.4%,表明该方法有较好的日内精密度。
4.4.2日间精密度
4.4.2.1试验方法
取9份样品,分成3组,每组3份,一天检测一组,按3.4试样制备方法处理样品,检测样品含量,计算其RSD(%)。
4.4.2.2试验数据(见下表7)【试验样品为:干乳斑】
表7
4.4.2.3试验结论
9份样品游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6含量的RSD分别为5.1%、6.9%、8.2%、5.6%、5.0%、2.8%、3.4%、6.7%、8.5%、7.5%、6.6%,表明该方法有较好的日间精密度。
4.5耐用性试验(稳定性)
4.5.1试验方法:
按3.4试样制备方法处理样品,干乳斑卡片放入铝箔袋中密封,分别在室温、4℃、-18℃、-80℃下放置0天、5天、20天后,按3.1条件检测样品含量,绘制含量趋势图。
6.5.2试验数据如表8:
表8
4.5.3试验结论
干乳斑卡片分别在-18℃、-80℃下放置0天、5天、20天后,游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6含量稳定性良好,表明干乳斑卡片的游离型脂肪酸在-18℃、-80℃的环境下20天内稳定性良好。
干乳斑卡片分别在室温、4℃下放置0天、5天后,游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6含量稳定性良好,表明干乳斑卡片的游离型脂肪酸在室温、4℃的环境下5天内稳定性良好。
干乳斑卡片分别在室温、4℃下放置20天后,游离型脂肪酸ALA、DHA、DPA n-3、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6含量有明显的升高,表明在室温、4℃的环境下,甘油酯型的脂肪酸会慢慢释放出来游离型的脂肪酸。
4.6准确度试验(回收率)
4.6.1试验方法
加标:精密移取母乳1.00mL,分别精密加入储备标准液ALA:5μL,DHA:20μL,DPA n-3:2.5μL,EPA:2.5μL,LA:10μL,GLA:2.5μL,EDA:2.5μL,DGLA:2.5μL,AA:5μL,AdA:5μL,DPAn-6:5μL,涡旋混匀。按3.4试样制备方法处理样品。
4.6.2试验数据如下表9:【试验样品为:干乳斑】
表9:回收率试验结果表
回收率(%)=(测得值-本底值)/加标值×100%
4.6.3试验结论
游离型脂肪酸:ALA、DHA、DPA n-3、EPA、LA、GLA、EDA、DGLA、AA、AdA、DPA n-6平均回收率分别为:93.1%、102.3%、102.1%、97.0%、100.3%、96.8%、98.0%、99.8%、97.7%、94.1%、93.3%,RSD分别为7.1%、5.9%、6.3%、4.5%、6.0%、6.7%、5.4%、5.4%、7.3%、7.5%、7.2%;表明该方法有较好的回收率,证明准确度良好。
对比例1:气相色谱-串联质谱法(GC-MS)与本发明干乳斑测定(DBS-LC-MS)的方法对比试验
5.1GC-MS的试验方法
游离脂肪酸的提取:取5g母乳置于离心管中,加1mL 0.5mol/L的硫酸溶液和5mL的乙醇溶液摇匀,加10mL含有正庚酸标准品的乙醚溶液,10mL正己烷;涡旋震荡1min,4500r/min 0℃离心10min,静止30min,取上清液于具塞试管。重复以上步骤提取一次;再用5mL乙醚和正己烷再提取一次;加3g无水硫酸钠静置过夜。
游离脂肪酸的分离:用正己烷湿润柱硅胶氧化铝层析柱(400mm*16mm),硅胶和氧化铝的比值为l:4。将上清液过层析柱,用10mL正己烷:乙醚为1:l的溶液洗去其他可溶性脂类,再用15mL 6%的甲酸乙醚溶液洗脱层析柱,收集洗脱液于三角瓶中并用氮气浓缩。
游离脂肪酸的甲酯化:浓缩液与20mL的14%的三氟化硼甲醇溶液于80℃水浴15~30min,冷却至室温,将溶液转移至离心管,并用饱和食盐水溶洗容器三次,合并饱和食盐水。加5mL的乙醚震荡,以5000r/min离心5min,取上清液。再用5mL乙醚重复提取一次,合并提取液。将提取液用氮气浓缩至1mL,供气相色谱-串联质谱仪测定。
5.2试验结果对比(见表10)
表10
5.3试验结论
通过对GC-MS方法和本发明DBS-LC-MS方法测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的含量的对比,两个方法的结果相对偏差<10%,证明通过干乳斑测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的方法,准确度良好。
本发明测定方法与GC-MS方法相比,省去了繁琐的检测前处理,且不需使用昂贵的同位素内标,即能达到准确测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸,该检测方法简单、快速、准确、检测成本低。
对比例2:母乳直接测定(LC-MS)与本发明干乳斑测定(DBS-LC-MS)的方法对比试验
6.1LC-MS的试验方法
精密移取母乳200μL,置于10mL的容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,混匀,然后精密移取母乳稀释液100μL于1mL离心管中,再精密加入100μL混合脂肪酸同位素内标液,加入300μL 1%甲酸乙腈溶液,涡旋混匀后,10000r/min离心3min,取上清,经0.22μm滤膜过滤后,按照3.1.2液相条件和3.1.3质谱条件,2μL注入液相色谱-质谱联用仪,测定各成分含量。
6.2试验结果对比(表11)
表11
6.3试验结论
通过对LC-MS方法和DBS-LC-MS方法测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的含量的对比,两个方法的结果相对偏差<10%,证明通过干乳斑测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的方法,准确度良好。
本发明方法与直接LC-MS方法相比,使用干血斑卡片收集干乳斑样本,便于母乳的运输保存,且不需使用昂贵的同位素内标,即能达到准确测定母乳中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸,该检测方法简单、快速、准确、检测成本低。
综上,本发明通过对干乳斑中游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸的含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验、方法对比试验,证明含量测定方法科学有效,能对干乳斑的游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸含量起到质量控制的目的。
Claims (7)
1.一种测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将母乳定量滴于干血斑卡片固定的斑点范围内,干燥制成干乳斑,干乳斑经干血斑提取系统提取,用液相色谱-质谱联用仪分析,采用外标法测定。
2.根据权利要求1所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述游离脂肪酸为游离Omega-3脂肪酸和游离Omega-6脂肪酸。
3.根据权利要求1所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述干燥的时间为2-4小时。
4.根据权利要求1所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述干血斑提取系统中采用的萃取液为乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种,优选乙腈。
5.根据权利要求4所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述萃取液与母乳的体积比为(3-5):2。
6.根据权利要求1所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述液相色谱的条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以2.5-10mmol/L乙酸铵溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,流速为0.2-0.5 ml/min;柱温为25-45 ℃;梯度洗脱程序如下:
。
7.根据权利要求1所述的测定母乳中游离脂肪酸含量的方法,其特征在于,所述质谱条件为:电离方式:电喷雾正离子模式;检测方式:多反应检测MRM;气帘气压力:35 psi;离子喷雾电压:-4500V;温度:650℃;雾化气:50 psi;辅助加热气:50 psi。
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