CN109239238A - 一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。其中所述的23种脂肪酸分别为：C14:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3‑α、C20:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5、C22:6、C24:0、C24:1；该方法采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，3min可完成23种脂肪酸的分离和检测，精密度和准确度基本满足要求。

Description

一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。
技术背景
脂肪酸(fatty acids)是一类羧酸化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。根据单双键组成脂肪酸可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸3种。它们在生命过程中互相转换，对调节生物体内各项生理和生物功能起着重要作用，主要包括：①合成磷脂构成生物膜，维护细胞和器官的生物化学特性②作为哺乳动物主要贮存能量的物质③作为第二信使的前体物质。
生物样本中的脂肪酸组成及含量变化是评价机体脂肪酸摄入和能量代谢的重要标志，随着生命科学技术的发展，脂肪酸的定性、定量研究为医学基础科研和临床检验提供了重要的依据。流行病学研究表明，脂肪酸与自身免疫性疾病以及风湿性关节炎，神经退行性疾病，肾脏和肝脏等疾病的发生具有一定的关联性。人体血清中总脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行人体血液中的脂肪酸组分分析有助于健康状况评价。但由于脂肪酸生理作用的复杂性，代谢的多变性以及缺乏适当、准确的研究手段，使得脂肪酸等小分子脂类研究受到限制。目前测定血清中脂肪酸的方法较多，如酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法、气相色谱法等。以上方法操作繁琐且精密度差。目前市场上开发出一种用于检测脂肪酸的试剂盒，该试剂盒存在稳定性不好，测定范围不一致，线性范围窄等缺点。
综上所述，临床上以及科研中迫切需要一种能够对脂肪酸进行快速、稳定并且灵敏度高的测定试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒，其包括：洗脱液，23种标准曲线混合工作液，基质，沉淀剂，同位素内标，稀释液，复溶液，质控品，其中上述各组分具体见下表，
23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制
23种标准曲线混合工作液中的STD A，STD B，STD C，STD D，STD E，STD F，STD G，STDH为：
质控品中的QC(L)，QC(M)，QC(H)为：
一种同时检测23种脂肪酸的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，所述的23种脂肪酸分别为：C14:0(肉豆蔻酸)、C14:1(肉豆蔻油酸)、C16:0(棕榈酸)、C16:1(棕榈油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)、C18:3-α(α-亚麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(二十碳烯酸)、C20:2(二十碳二烯酸)、C20:3(二十碳三烯酸)、C20:4(花生四烯酸)、C20:5(二十碳五烯酸)、C22:0(山嵛酸)、C22:1(芥酸)、C22:2(二十二碳二烯酸)、C22:3(二十二碳三烯酸)、C22:4(二十二碳四烯酸)、C22:5(二十二碳五烯酸)、C22:6(二十二碳六烯酸)、C24:0(木焦油酸)、C24:1(神经酸)；
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量。
其中预处理方法为：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
前柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18guard column(2.1mm inner diameter×5mm with1.7μm particles)；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(2.1mm inner diameter×50mmwith1.7μm particles)；
流动相A：10mmoL/L甲酸铵水溶液；
流动相B：10mmoL/L甲酸铵甲醇溶液；
采用梯度洗脱的方式，洗脱程序见表1；
柱温：40℃；进样室温度：4℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；
表1流动相梯度洗脱参数
Time(min) 流动相A(v％) 流动相B(v％)
0.00 10 90
0.50 1 99
2.00 1 99
2.20 10 90
3.40 10 90
(2)质谱条件
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式：喷雾电压为﹣4500V；气帘气为25psi；离子源雾化气和加热辅助器均为50psi；去溶剂温度为500℃；各个目标物的质谱参数见表2
表2脂肪酸质谱参数
其中，所述的血浆为人的血浆，
其中，所述的经过预处理的血浆按照如下方法制备得到：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃ 5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
其中所述的内标物为混合内标液，其为300μL含2nmol C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇溶液，具体配制方法如下：精确称取1mg BHT粉末，加入100mL甲醇中，再精密量取68μL浓度为10mmol的C16D31脂肪酸氘代内标溶液。
所述的标准品按表3配制成标准母液，具体标准品量和甲醇体积见表3，
表3 23种脂肪酸标准母液配制方法
分别从以上的标准母液中吸取2.5μL、2.5μL、20μL、5μL、10μL、20μL、20μL、5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、2.5μL、10μL、10μL于玻璃试管中，用甲醇定容至500μL，得到23种脂肪酸的最大终浓度(MIX H)分别为50μmoL/L、50μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、200μmoL/L、400μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L。
23种脂肪酸的混合标准品溶液按表4进行配制得到如下浓度的系列标准品溶液，见表5
表4各级MIX配制如表：
(μL) MeOH(μL)
MIX G 150MIX H 50
MIX F 100MIX H 100
MIX E 100MIX F 100
MIX D 100MIX E 100
MIX C 100MIX D 100
MIX B 80MIX C 120
MIX A 80MIX B 120
表5标准品溶液进样曲线范围
在该方法中使用的色谱瓶内插管为玻璃材质，在洗针液中加入异丙醇。
本发明的有益效果是：
1、本发明采集200例健康人的血液对该方法进行反复验证，通过数据可以看出，该方法选用的内标稳定，检测方法稳定。2、本发明能同时定性和定量检测23种脂肪酸，操作简单、选择性高、灵敏度高、稳定性良好，并且整个HPLC-MS/MS检测过程用时仅有3min，每年对脂肪酸检测的报道很多，但是他们在灵敏度、脂肪酸检测数量以及检测时间上远远不能满足临床的要求。而本发明采用很少的血样及简单的有机试剂就能准确的检测出23种脂肪酸的含量，可以推行到例行体检和一些代谢性疾病的诊断中去。
附图说明
图1是本发明实施例所述的脂肪酸标准品LC-MS负离子采集模式色谱图。
图2是本发明实际应用中血浆样品脂肪酸检测LC-MS负离子采集模式色谱图。
图3图3分别为使用Axygen1.0mL EP管、Axygen1.5mL EP管和玻璃试管色谱图，(最高峰)为加入的氘代内标，1.4min的峰为C18:0。
图4洗针液使用纯甲醇色谱
图5 23种脂肪酸校准曲线
图6双空白样品
图7单空白样品
具体实施方式
根据下述实施例可以更好的理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1.材料
方法学研究实验的样本来自于锦州医科大学附属第一医院体检中心的血浆样本。
(1)仪器：液相色谱-质谱联用仪(岛津HPLC-AB SCIEX 4500MD)；医用高速冷冻离心机(TECHCOMP型号CT18RT)；震荡仪(IKA VORTEX3)；超声波清洗器(新芝型号SB-25-12D)；氮吹仪(沃信型号VSD150-2)；可调移液器(eppendorf)；玻璃试管(fisher)；烧杯、量筒等。
(2)试剂耗材：色谱级甲醇(fisher)，LC-MS级甲酸铵(Sigma)，屈臣氏纯净水；前柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18guard column(2.1mm inner diameter×5mm with 1.7μm particles)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(2.1mm inner diameter×50mm with 1.7μm particles)；
(3)标准品：C14:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3-α、C20:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5、C22:6、C24:0、C24:1均购自于Nu-chek Prep；同位素内标C16D31脂肪酸购自于CDN Isotopes；
(4)质控品：分低中高三个浓度分别为QC(LL)QC(L)QC(M)QC(H)，见表6所示。
表6脂肪酸质控品对应浓度(单位μmoL/L)
2.方法
(1)色谱条件：前柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18guard column(2.1mminnerdiameter×5mm with 1.7μm particles)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEHC18column(2.1mm inner diameter×50mm with 1.7μm particles)；柱温：40℃；进样室温度：4℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；流动相A：10mmoL/L甲酸铵水溶液；流动相B：含10mmoL/L甲酸铵甲醇溶液。梯度洗脱，洗脱程序见表1
(2)质谱条件
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式：喷雾电压为﹣4500V；气帘气为25psi；离子源雾化气和加热辅助器均为50psi；去溶剂温度为500℃；各个目标物的质谱参数见表2，同位素内标(m/z 286.5)。对每个目标物的去簇电压进行优化，以便达到更高的稳定性和灵敏度。
(3)标准品制备
所述的标准品按表3配制成标准母液。具体标准品量和甲醇体积见表3。
分别从以上的标准母液中吸取2.5μL、2.5μL、20μL、5μL、10μL、20μL、20μL、5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、2.5μL、10μL、10μL于玻璃试管中，用甲醇定容至500μL，得到23种脂肪酸的最大终浓度(MIX H)分别为50μmoL/L、50μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、200μmoL/L、400μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L。
23种脂肪酸的混合标准品溶液按表4进行配制得到如下浓度的系列标准品溶液，见表5
(4)质控品的配制：见表7
表7质控品QC配制
(μL) MeOH(μL)
QC LL 10QC M 90
QC L 10QC H 90
QC M 50MIX H 50
QC H 80MIX H 20
表8质控品QC溶液进样曲线范围
(5)样品处理
1)标准品(质控品)处理
所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μLBSA，加入20μL标准工作液(质控品)，震荡15秒，4℃ 5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
2)血浆样本前处理
所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃ 5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
分析试剂盒中各组分见表9
表9 23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制
3.方法的建立与优化
1)本发明在前期预实验中考虑本底残留问题分别使用NEST 1.0mL EP管、Axygen1.5mLEP管和fisher玻璃试管进行前期预处理，通过数据分析发现EP管和玻璃试管中都含有C18：0脂肪酸，但是玻璃试管中C18：0脂肪酸含量最低，于是在样本前期处理方面我们改用玻璃试管，进样时使用玻璃插管色谱瓶，对比图见图3。2)本发明前期使用甲醇水的洗针液发现有携带效应，最后在洗针液中加入异丙醇携带效应降为零见图4。3)实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，采用MRM模式监测其衍生化产物负离子(Q1)，使用Ramp选择不同的DP进行优化，从优化色谱图中即可看见离子最高信号强度所对应的最佳结果，记录优化结果见表2。4)本发明对初始流动相配比进行优化发现流动相B为85％时色谱峰全部分离且用时最短。5)此外，其它一些参数如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。
4.方法验证
1)负离子色谱图：23种脂肪酸的标准品和血浆样品的峰型比较对称，基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1是脂肪酸标准品LC-MS负离子采集模式色谱图。图2是血浆样品脂肪酸检测LC-MS负离子采集模式色谱图，由图可以看出这23种脂肪酸基本完全分离开，LC-MS检测足以满足定量要求。
2)校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线(见图5)，并计算出血浆中待测物的浓度。23种脂肪酸在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表10。
表10脂肪酸线性回归方程及线性相关系数
3)精密度试验：包括批内精密度和批间精密度
按照“质控前处理方法”制备样本，每个浓度(QC低，QC中，QC高)分别制备6个样本，连续测定3天，并与标准曲线同批测定，以当日的标准曲线计算质控样品的浓度，求得方法的精密度(RSD)，结果见表11。
表11精密度试验结果
4)回收率试验
精密量取含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL BSA，加入20μL脂肪酸的低、中、高三个浓度的QC样品(每浓度三样本分析)，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。所得峰面积带入当天的随行标准曲线，用测得的浓度与加入理论浓度进行比较，计算加样回收率。见表12
表12回收率试验结果
5)基质效应
精密量取含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL BSA，加入20μL脂肪酸的低、中、高三个浓度的QC样品(每浓度三样本分析)，测得的峰面积计为A1；另精密量取含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL水，加入20μL脂肪酸的低、中、高三个浓度的QC样品(每浓度三样本分析)，测得的峰面积计为A2；以每一浓度两种处理方法的峰面积比值A1/A2*100％计算基质效应。结果见表13。
表13基质效应试验结果
6)双空白样品
在12x75mm玻璃试管中，加入含0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL BSA，加入20μL甲醇，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。色谱图见图6。
7)单空白样品
在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL BSA，加入20μL甲醇，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。色谱图见图7。
8)提取回收率试验
A组：精密量取含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μLBSA，加入20μL脂肪酸的低、中、高三个浓度的QC样品(每浓度三样本分析)，震荡15秒，4℃5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。B组：精密量取含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μLBSA，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，加入20μL脂肪酸的低、中、高三个浓度的QC样品(每浓度三样本分析)，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。计算A组测定浓度与B组的比值。结果见表14。
表14提取回收率试验
5.讨论
本研究采用高效液相色谱串联质谱技术同时测定23种脂肪酸。目前测定血浆中脂肪酸的方法较多，如酶法、滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法、气相色谱法等。以上方法操作繁琐且精密度差，LC-MS/MS是同时针对目标物的出峰时间和离子进行检测，灵敏度高，可极大的避免交叉反应的干扰，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基体的干扰，能够达到准确定量。
考察了这23种脂肪酸的重现性和回收率，批内精密度为0.70％-12.8％，批间精密度为2.45％-14.28％，都在可接受范围之内，(可接受标准为≤15％)，因此该方法稳定性良好，此外，实验获得的提取回收率在70％-120％之间，可接受标准为80％-120％，其中C14:0、C16:1的提取回收率小于80％，但也与待测物的浓度有关，若浓度较低可接受的范围可放宽至70％-130％，其它脂肪酸都满足要求。

Claims (7)

1.一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒，其包括：洗脱液，23种标准曲线混合工作液，基质，沉淀剂，同位素内标，稀释液，复溶液，质控品，其中上述各组分具体见下表，
23种脂肪酸分析试剂盒组分的配制
23种标准曲线混合工作液中的STD A，STD B，STD C，STD D，STD E，STD F，STD G，STD H为：
质控品中的QC(L)，QC(M)，QC(H)为：
2.一种同时检测23种脂肪酸的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，所述的23种脂肪酸分别为：C14:0(肉豆蔻酸)、C14:1(肉豆蔻油酸)、C16:0(棕榈酸)、C16:1(棕榈油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)、C18:3-α(α-亚麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(二十碳烯酸)、C20:2(二十碳二烯酸)、C20:3(二十碳三烯酸)、C20:4(花生四烯酸)、C20:5(二十碳五烯酸)、C22:0(山嵛酸)、C22:1(芥酸)、C22:2(二十二碳二烯酸)、C22:3(二十二碳三烯酸)、C22:4(二十二碳四烯酸)、C22:5(二十二碳五烯酸)、C22:6(二十二碳六烯酸)、C24:0(木焦油酸)、C24:1(神经酸)；
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量，具体色谱条件为：
其中预处理方法为：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
(1)高效液相色谱条件：
前柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 guard column(2.1mm inner diameter×5mmwith 1.7μm particles)；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column(2.1mm inner diameter×50mm with1.7μm particles)；
流动相A：10mmoL/L甲酸铵水溶液；
流动相B：10mmoL/L甲酸铵甲醇溶液；
采用梯度洗脱的方式，洗脱程序见表1；
柱温：40℃；进样室温度：4℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；
表1流动相梯度洗脱参数
Time(min) 流动相A(v％) 流动相B(v％) 0.00 10 90 0.50 1 99 2.00 1 99 2.20 10 90 3.40 10 90
(2)质谱条件
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式：喷雾电压为﹣4500V；气帘气为25psi；离子源雾化气和加热辅助器均为50psi；去溶剂温度为500℃；各个目标物的质谱参数见表2
表2脂肪酸质谱参数
3.根据权利要求2所述的一种同时检测23种脂肪酸的方法，其特征在于，所述的血浆为人的血浆。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测23种脂肪酸的方法，其特征在于，所述的经过预处理的血浆按照如下方法制备得到：所有步骤都在冰上操作，在12x75mm玻璃试管中，加入含2nmol内标C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇300μL，加入20μL血浆，震荡15秒，4℃，5,000g离心10分钟，将上清200μL转入10x75mm玻璃试管，氮气吹干，重溶于200μL甲醇:乙腈溶液(v:v＝1:1)，转入带玻璃插管色谱瓶中待上样1μL。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测23种脂肪酸的方法，其特征在于，内标物为混合内标液，其混合内标溶液按如下方法制得：精确称取1mg BHT粉末，加入100mL甲醇中，再精密量取68μL浓度为10mmol的C16D31脂肪酸氘代内标溶液。配制成含2nmol C16D31脂肪酸、0.001％BHT的甲醇溶液。
6.根据权利要求2所述的一种同时检测23种脂肪酸的方法，其特征在于，所述的标准品按表3配制成标准母液，具体标准品量和甲醇体积见表3
表3 23种脂肪酸标准母液配制方法
分别从以上的标准母液中吸取2.5μL、2.5μL、20μL、5μL、10μL、20μL、20μL、5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、10μL、2.5μL、2.5μL、10μL、10μL于玻璃试管中，用甲醇定容至500μL，得到23种脂肪酸的最大终浓度(MIX H)分别为50μmoL/L、50μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、200μmoL/L、400μmoL/L、400μmoL/L、100μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L、50μmoL/L、20μmoL/L、20μmoL/L。
23种脂肪酸的混合标准品溶液按表4进行配制得到如下浓度的系列标准品溶液，见表5
表4各级MIX配制如表：
(μL) MeOH(μL) MIX G 150MIX H 50 MIX F 100MIX H 100 MIX E 100MIX F 100 MIX D 100MIX E 100 MIX C 100MIX D 100 MIX B 80MIX C 120 MIX A 80MIX B 120
表5标准品溶液进样曲线范围
7.根据权利要求2-6任一项所述的一种同时检测23种脂肪酸的方法，其中，在该方法中使用的色谱瓶内插管为玻璃材质，在洗针液中加入异丙醇。
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