CN113325100A - 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用 - Google Patents

一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113325100A
CN113325100A CN202110584310.2A CN202110584310A CN113325100A CN 113325100 A CN113325100 A CN 113325100A CN 202110584310 A CN202110584310 A CN 202110584310A CN 113325100 A CN113325100 A CN 113325100A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
fatty acids
mobile phase
fatty
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110584310.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113325100B (zh
Inventor
冯振
景叶松
弭兆元
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd filed Critical Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110584310.2A priority Critical patent/CN113325100B/zh
Publication of CN113325100A publication Critical patent/CN113325100A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113325100B publication Critical patent/CN113325100B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood

Abstract

本发明提供一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用，属于脂肪酸检测技术领域。本发明采用蛋白沉淀法结合HPLC‑MS/MS测定17种脂肪酸在血清中的含量，并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对上述17种脂肪酸在血清中的测定方法进行了充分的验证，最终该方法可应用于临床脂肪酸的含量检测，有助于给出患者体内脂肪酸的真实浓度的真实水平，指导医生合理制定治疗方案，合理用药减少副作用，对患者实现获得最佳疗效具有重要意义。

Description

一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用
技术领域
本发明属于脂肪酸检测技术领域，具体涉及一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脂肪酸是指一端含有一个羧基的长脂肪族氢链，是由碳氢氧3种元素组成的一类有机化合物，也是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。脂肪酸的生理与病理意义已日益受到人们的高度重视，胎儿和婴幼儿生长快速期若对脂肪酸供应不足，会影响其大脑发育和功能。人们所需要的脂肪酸包括：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、反式油酸、亚油酸、α-亚麻酸、β-亚麻酸、花生油酸、花生四烯酸、二十烷五烯酸、二十二烷六烯酸、二十烷三烯酸、顺二十二烷五烯酸、反二十二烷五烯酸等。许多疾病的发生、预防和治疗也与脂肪酸缺乏有关，脂肪酸类化合物在生命过程中具有非常重要的作用，脂肪酸通常是生物体内重要的营养成分和代谢产物。例如亚油酸是人体的主要脂肪酸，主要来自玉米油、芝麻油等，亚油酸在体内经过脱氢酶的去饱和及碳链延长而衍生为二十烷四烯酸，是生物膜磷脂的重要成分。而人体过量增高的游离脂肪酸，又与代谢综合征、高血压、冠心病及心力衰竭等疾病的发生发展密切相关，因此，人体血清中脂肪酸的组成及其水平是人体摄入脂肪酸和代谢后的重要指标，进行脂肪酸组分分析有助于健康状况评价，而检测血液中各脂肪酸的含量是评估自身以及科学指导的唯一依据。因此提供一种同时测定多种脂肪酸在血清中含量的方法并应用于人体内脂肪酸含量监测进而研究脂肪酸的含量-疗效关系亟待解决。为了更好地监测脂肪酸，需要一种灵敏、特异、准确的测定血清中脂肪酸的方法，以观察脂肪酸的量效关系。
关于使用高效液相色谱-紫外色谱法、气相色谱-质谱法和高效液相色谱-质谱联用法对生物液中脂肪酸进行定量的论文已经发表。张苇苇等人在2021年采用气相色谱法定量棕榈酸和亚油酸，线性范围为81.96～1 639.20μg/mL，20.72～414.40μg/mL，定量限较高无法满足临床检测的需要，且需要衍生才能实现定量测定，其分析时间太长、测定样品所需体积太大无法实现高通量。Xu Q等人建立了用HPLC-MS快速、准确地对人体血液中游离脂肪酸进行定性和定量检测的方法，采用Dole提取法，提取的样品不需要衍生化直接进样，但发明人发现，其检测限较高，提取方法较复杂，灵敏度差。相比较于脂肪酸检测领域常用的气质色谱法，液质联用技术检测脂肪酸的方法常常诟病于灵敏度差、检测限高、专属性差等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用。本发明通过向流动相中添加氟化铵从而在脂肪酸结构上加合氟离子的方法解决了以往液质联用技术检测脂肪酸的难题。脂肪酸结构中大多碳链较长，且结构上很少含羟基、氨基、羧基等易带电基团，因此在以往的脂肪酸分析中，很少有用电喷雾质谱仪检测脂肪酸，而本发明通过在流动相中加入了一定量氟化铵，在母离子检测时发现每个脂肪酸母离子加合氟离子后可以在图谱上发现+19的质谱峰且响应很高，从而可有效以应用于临床脂肪酸检测项目，具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法，所述脂肪酸包括月桂酸C12:0、肉豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、棕榈油酸C16:1w7、油酸C18:1w9、反式油酸E-C18:1w9、亚油酸C18:2w6、α-亚麻酸C18:3w3、β-亚麻酸C18:3w6、花生油酸C20:1w9、花生四烯酸C204w6、二十烷五烯酸C20:5w3、二十二烷六烯酸C22:6w3、二十烷三烯酸C20:3w6、顺二十二烷五烯酸C22:5w3和反二十二烷五烯酸C22:5w6，所述方法包括：以标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；
具体的，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。
其中，上述脂肪酸质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL。
所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与同位素内标工作液混合，离心取上清制得。
所述试验样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
所述同位素内标工作液可以为上述17种脂肪酸同位素内标工作液中的任意一种或多种的混合；
具体的，所述同位素内标工作液制备方法可以为：将脂肪酸的同位素内标原料使用二甲基亚砜溶解，制成内标储备液，然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液。
所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液，所述乙腈和二甲基亚砜的用量比例为15～20:1～5，优选为17:3，所述甲酸含量为0.00001～0.001％，优选为0.0001％。
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)，流动相B相：乙腈(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)；
色谱柱采用五氟苯基柱；流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为25～40℃(优选为35℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；
具体的，所述色谱柱为CORE PFP C17柱，经研究发现，其能够对各个加合氟离子的脂肪酸进行分离，各个脂肪酸同分异构体之间均可以保证分离度且分析时间控制在10分钟内。
梯度洗脱方式具体为：0-3.0min，流动相B 55-55％；3.0-5.3min，流动相B 55-90％；5.3-6.3min，流动相B 90-90％；6.3-6.4min，流动相B 90-100％；6.4-8.4min，流动相B 100-100％；8.4-8.5min，流动相B 100-55％；8.5-10.0min，流动相B 100-55％。
质谱条件包括：
离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
本发明的第二个方面，提供检测多种脂肪酸的试剂盒，所述试剂盒包括：月桂酸C12:0、肉豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、棕榈油酸C16:1w7、油酸C18:1w9、反式油酸E-C18:1w9、亚油酸C18:2w6、α-亚麻酸C18:3w3、β-亚麻酸C18:3w6、花生油酸C20:1w9、花生四烯酸C204w6、二十烷五烯酸C20:5w3、二十二烷六烯酸C22:6w3、二十烷三烯酸C20:3w6、顺二十二烷五烯酸C22:5w3和反二十二烷五烯酸C22:5w6中的任意一种或多种标准品；
月桂酸-d3、肉豆蔻酸-d5、棕榈酸-d3、硬脂酸-d3、棕榈油酸-d5、油酸-d3、亚油酸-d2、亚麻酸-d2、花生油酸-d3、花生四烯酸-d2、二十烷五烯酸-d2、二十二烷六烯酸-d3、二十烷三烯酸-d5、二十二烷五烯酸-d3中的任意一种或多种作为同位素内标原料；
稀释液为乙腈或含有甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液。
其中，所述乙腈和二甲基亚砜的用量比例为15～20:1～5，优选为17:3，所述甲酸含量为0.00001～0.001％，优选为0.0001％。
本发明的第三个方面，提供上述方法和/或试剂盒在脂肪酸的量效关系研究中的应用。
其中，所述血液包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案采用蛋白沉淀法结合HPLC-MS/MS测定17种脂肪酸在血清中的含量，并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对上述17种脂肪酸在血清中的测定方法进行了充分的验证。该方法可以应用于临床脂肪酸检测项目，有助于给出患者体内脂肪酸的真实浓度的真实水平，指导医生合理制定治疗方案，合理用药减少副作用，对患者实现获得最佳疗效具有重要意义。
上述技术方案提供了一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定多种脂肪酸在血清中含量的方法，从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对17种脂肪酸在血清中的测定进行了充分的验证。
上述技术方案液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点，有助于给出患者体内脂肪酸含量的真实浓度的真实水平，指导医生合理制定治疗方案，合理用药减少副作用，对患者实现获得最佳疗效具有重要意义，因此对血清中脂肪酸的含量分析具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中17种脂肪酸的质谱色谱图(月桂酸C12:0、肉豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、棕榈油酸C16:1w7、油酸C18:1w9、反式油酸E-C18:1w9、亚油酸C18:2w6、α-亚麻酸C18:3w3、β-亚麻酸C18:3w6、花生油酸C20:1w9、花生四烯酸C204w6、二十烷五烯酸C20:5w3、二十二烷六烯酸C22:6w3、二十烷三烯酸C20:3w6、顺二十二烷五烯酸C22:5w3、反二十二烷五烯酸C22:5w6)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，目前针对脂肪酸检测常用的气质色谱法及液质联用技术普遍存在灵敏度差、检测限高、专属性差等缺点，因此供一种同时测定多种脂肪酸在血清中含量的方法并应用于临床检测进而研究脂肪酸的含量-疗效关系亟待解决。
有鉴于此，本发明提供一种同时测定多种脂肪酸在血清中含量的方法及其应用，从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对17种脂肪酸在血清中的含量测定进行了充分的验证，最终本发明可应用于临床脂肪酸检测，显示出明显的优越性。
本发明的一个具体实施方式中，所述测定方法，其步骤如下：
(1)17种脂肪酸的储备液用二甲基亚砜溶解精确称量的标准对照品，17种脂肪酸的最终浓度为1000μg/mL。将0.10mL精确体积的17种脂肪酸标准溶液移入10mL容量瓶中，并用乙腈定容，得到17种脂肪酸10μg/mL的工作液。用乙腈稀释，得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时，将17种脂肪酸的同位素内标原料用一定体积二甲基亚砜溶解，制备1000μg/mL的内标储备液。17种脂肪酸的同位素内标的工作液浓度为50ng/mL，稀释溶剂为乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸。所有物质的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天，无变化。
在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的17种脂肪酸在血清中的物质浓度点中制备其标准曲线。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南，为了进行准确度和精密度研究，QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品，包括定量下限(LLOQ)、低(L：定义为LLOQ的三倍)、中(M：定义为中范围)和高(H：定义为高范围)。而对于其他试验(在样品分析期间)，只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于17种脂肪酸，分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。
将45μL人空白血清置于2.0mL离心管中，加入精确体积5μL的17种脂肪酸2-600ng/mL工作溶液，以获得17种脂肪酸的0.1-30ng/mL血清浓度。然后加入200μL 17种脂肪酸同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸)沉淀蛋白，振荡10min，提取分析物及其内标，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于100μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液；
(2)将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)，流动相B相：乙腈(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中将40-50μL人空白血清置于2.0mL离心管中，加入精确体积4-6μL的17种脂肪酸2-600ng/mL工作溶液，以获得17种脂肪酸的0.1-30ng/mL血清浓度。然后加入100-300μL 17种脂肪酸同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸)沉淀蛋白，振荡10min，提取分析物及其内标，在4℃下以13000-15000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将50-150μL上清液溶解于50-150μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液。
本发明为了获得满意的色谱行为和最大限度地提高分析物和内标化合物的电离响应，我们在流动相体系上进行了几次尝试。由于检测模式为负离子模式，流动相中添加酸性试剂易导致负离子模式下化合物电离受到影响，而本发明方法针对的化合物脂肪酸中大多数脂肪酸的pKa均在3-6范围内，其流动相的pH环境会极大影响脂肪酸的不同形态分配比，为了得到单一的峰形且不影响脂肪酸在负离子模式下的检测，本发明比较了在流动相中添加0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％甲酸时17种脂肪酸的响应情况，结果发现流动相中甲酸浓度超过0.0005％时脂肪酸的响应会受到70％的影响，而流动相中不添加甲酸则会导致脂肪酸色谱峰杂乱，无法分辨出分析物的保留时间。因此，本专利在不影响脂肪酸的响应同时为了得到单一且专属性强的脂肪酸色谱峰，最终在流动相中添加0.0001％的甲酸。
相比较于脂肪酸检测领域常用的气质色谱法，液质联用技术检测脂肪酸的方法常常诟病于灵敏度差、检测限高、专属性差等缺点，本专利针对这一缺点进行实验探索并最终通过向流动相中添加氟化铵从而在脂肪酸结构上加合氟离子的方法解决了液质联用技术检测脂肪酸的难题。脂肪酸结构中大多碳链较长，且结构上很少含羟基、氨基、羧基等易带电基团，因此在以往的脂肪酸分析中，很少有用电喷雾质谱仪检测脂肪酸，而本专利通过在流动相中加入了10mM氟化铵，在母离子检测时发现每个脂肪酸母离子加合氟离子后可以在图谱上发现+19的质谱峰且响应很高。本发明还比较了不同浓度下氟化铵(如1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)对脂肪酸加合离子的响应影响和不同添加剂(如氟化铵、乙酸铵、甲酸铵等)对脂肪酸加合离子的响应影响。根据峰形、保留时间、稳定性和灵敏度，流动相A相：水(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)，流动相B相：乙腈(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)作为流动相。
本发明使用的色谱柱是资生堂CORE PFP C17柱，由于脂肪酸中含较多同分异构体，例如油酸和反式油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸、顺二十二碳五烯酸和反二十二碳五烯酸，同分异构体的分子量相同但在色谱行为无法分开的情况下也较难实现独自定量。而脂肪酸的同分异构体的结构差别只是空间异构，脂肪酸结构中碳链太长也无法使用分离同分异构体的C8柱(无保留)。本发明针对上述问题，结合流动相中氟化铵对脂肪酸的加合作用，选择资生堂的五氟苯基柱对各个加合氟离子的脂肪酸进行分离，结果各个同分异构体之间均可以保证分离度且分析时间控制在10分钟内。本发明同时比较了多家色谱柱、多款型号的五氟苯基柱，最终选择资生堂CORE PFP C17柱。
本发明利用HPLC-MS/MS分析和MS参数优化负离子模式，提高了MRM测量对ESI源的响应。
在样品制备的优化方面，与乙酸乙酯液-液萃取法相比，蛋白质沉淀法具有精度高、回收率高、操作简单等优点。样品制备采用蛋白质沉淀法。17种脂肪酸的定量限值可用于血清样品中脂肪酸的定量分析。
最初，沉淀蛋白的溶剂是乙腈和甲醇，但这造成了亚油酸和二十二烷六烯酸含量的巨大损失，这可能是由于乙腈和甲醇不能有效地将分析物从蛋白质中解吸出来造成的。影响电荷态分布的因素包括溶剂pH值和脂肪酸溶解度。亚油酸和二十二烷六烯酸的pKa较低，当pH较高时易降解。因此，一种更易溶解的溶液：乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸作为提取液，成功地解决了这个问题。在提取液中添加二甲基亚砜是为了增强溶剂对脂肪酸的溶解，减少提取液不能从蛋白中解吸脂肪酸的可能性。而二甲基亚砜的加入会影响化合物在喷雾时的离子化，因此本发明通过比较在提取液中添加5％、10％、15％、20％、25％、30％二甲基亚砜时17种脂肪酸的响应，发现当提取液中添加5％二甲基亚砜就可以明显提高脂肪酸的峰响应，而二甲基亚砜的比例增加到20％时开始出现离子化抑制，最终选择在流动相中添加10％二甲基亚砜作为助溶剂从而改善提取效率提高脂肪酸响应。
本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(2)中色谱柱为CORE PFP C17柱(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。
本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.4mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.4mL/min。
同时，本发明试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为35℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为35℃。
17种脂肪酸及其内标化合物的质谱参数见表1。
表1 17种脂肪酸及其内标化合物的质谱参数
Figure BDA0003087592710000111
Figure BDA0003087592710000121
本发明同时对质谱条件进行优化，采用API5500型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化17种脂肪酸及其内标化合物的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测结果如表1所示，17种脂肪酸及其内标化合物均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。
在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了20min的色谱图。结果表明9.0min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择10.0min作为分析时间。
本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)中梯度洗脱方式为：0-3.0min，流动相B55-55％；3.0-5.3min，流动相B 55-90％；5.3-6.3min，流动相B 90-90％；6.3-6.4min，流动相B 90-100％；6.4-8.4min，流动相B 100-100％；8.4-8.5min，流动相B 100-55％；8.5-10.0min，流动相B 100-55％；
本发明的又一具体实施方式中，上述中质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；
本发明的又一具体实施方式中，采用月桂酸-d3、肉豆蔻酸-d5、棕榈酸-d3、硬脂酸-d3、棕榈油酸-d5、油酸-d3、亚油酸-d2、亚麻酸-d2、花生油酸-d3、花生四烯酸-d2、二十烷五烯酸-d2、二十二烷六烯酸-d3、二十烷三烯酸-d5、二十二烷五烯酸-d3作为同位素内标化合物。
需要说明的是，本发明采用HPLC-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中曾经尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，无法实现定量分析，然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量17种脂肪酸，用常规液相方法检测存在耗时长，分离较难，检测限高等缺点，不利于试验的进行。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种同时测定多种脂肪酸在血清中含量的方法，包括如下步骤：
第一步：
17种脂肪酸的储备液用二甲基亚砜溶解精确称量的标准对照品，17种脂肪酸的最终浓度为1000μg/mL。将0.10mL精确体积的17种脂肪酸标准溶液移入10mL容量瓶中，并用乙腈定容，得到17种脂肪酸10μg/mL的工作液。用乙腈稀释，得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时，将17种脂肪酸的同位素内标原料用一定体积二甲基亚砜溶解，制备1000μg/mL的内标储备液。17种脂肪酸的同位素内标的工作液浓度为50ng/mL，稀释溶剂为乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸。所有物质的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天，无变化。
在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的17种脂肪酸在血清中的物质浓度点中制备其标准曲线。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南，为了进行准确度和精密度研究，QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品，包括定量下限(LLOQ)、低(L：定义为LLOQ的三倍)、中(M：定义为中范围)和高(H：定义为高范围)。而对于其他试验(在样品分析期间)，只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于17种脂肪酸，分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。
将45μL人空白血清置于2.0mL离心管中，加入精确体积5μL的17种脂肪酸2-600ng/mL工作溶液，以获得17种脂肪酸的0.1-30ng/mL血清浓度。然后加入200μL 17种脂肪酸同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈：二甲基亚砜＝17:3，含0.0001％甲酸)沉淀蛋白，振荡10min，提取分析物及其内标，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于100μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液；
第二步：
测定：将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)，流动相B相：乙腈(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)。
在本实施例中，色谱柱为CORE PFP C17柱(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。各有效成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为：0-3.0min，流动相B 55-55％；3.0-5.3min，流动相B 55-90％；5.3-6.3min，流动相B90-90％；6.3-6.4min，流动相B 90-100％；6.4-8.4min，流动相B 100-100％；8.4-8.5min，流动相B 100-55％；8.5-10.0min，流动相B 100-55％。
质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；
第三步：
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对专属性、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应及提取回收率。
专属性：通过比较六个人的空白血清样品、以30ng/mL的浓度加入17种脂肪酸的血清样品和以0.1ng/mL的浓度加入17种脂肪酸的血清样品的色谱图来评估特异性和内源性干扰。通过比较50％乙腈和添加17种脂肪酸的三蒸馏水(0.1ng/mL)的最低定量限和17种脂肪酸内标(50ng/mL)的色谱图来评估特异性和外源性干扰。制备并分析所有空白血清样品，以确保没有干扰峰。在所建立的色谱条件下，血清中没有内源性干扰，表明该方法的选择性是可以接受的；
定量限：采用1/X2加权线性最小二乘回归模型，以17种脂肪酸/脂肪酸内标与血清浓度的峰面积比构建校准曲线。最低定量限(LLOQ)表示线性范围内分析物的最低浓度，可以用可接受的精度和准确度进行测定。
精密度：在同一天对四种浓度(0.1、0.25、2.5和25ng/mL)的六个重复的LLOQ和QC样品进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中17种脂肪酸的精密度和准确度结果见表2。17种脂肪酸各样品水平的精密度(RSD)均小于9.99％。对17种脂肪酸各样品水平的准确度在1.48％到8.31％之间。测定值均在可接受范围内。
表2血清中测定17种脂肪酸含量方法的精密度和准确度
Figure BDA0003087592710000161
Figure BDA0003087592710000171
Figure BDA0003087592710000181
基质效应和提取回收率：提取回收率是通过比较在6个不同批次血清中制备的三个水平的QC样品中提取的分析物与IS比的绝对峰面积与空白血清、高溶血性血清和高脂肪血清提取后用相同浓度的分析物纯溶液进行强化LQC、MQC、HQC。通过比较六批样品在LQC、MQC、HQC水平下强化的空白血清提取物与相同浓度水平分析物强化的空白水提取物中分析物绝对峰面积与IS比值的比较，来评估基质效应。在人空白血清中，17种脂肪酸内标物均匀化的平均基质效应为98.2-108.0％，而高溶血性的平均基质效应为96.5-108.4％。在高脂血清中，17种脂肪酸的基质效应为96.5-107.1％。如表3所示，所有相对标准偏差值在0.75％到9.17％之间，这表明血清基质的影响对于分析来说是可以忽略的。17种脂肪酸内标物均匀化后的平均提取回收率为96.7-103.8％，不同浓度下17种脂肪酸的提取回收率结果准确、重现性好。
表3血清中测定17种脂肪酸含量方法的提取回收率和基质效应(n＝6)
Figure BDA0003087592710000191
Figure BDA0003087592710000201
Figure BDA0003087592710000211
Figure BDA0003087592710000221
Figure BDA0003087592710000231
稳定性试验：对三种不同浓度的QC样品在不同条件下的稳定性进行了分析：(1)室温(23℃)制备前3h；(2)冰箱温度(4℃)制备后20小时，室温(23℃)制备后6小时；(3)自动进样器10℃制备后24小时；(4)冰箱温度(-20℃)制备前3、8、31天。通过比较储存的QC样品和新制备的样品的平均浓度来评估溶液的稳定性。样品被认为是稳定的，与标称浓度的偏差在±15.0％以内。所有稳定性试验样品在6个重复中进行分析，并根据新制备的样品确定偏差。17种脂肪酸在室温下放置至少3h后，17种脂肪酸的CV％(5.35％)的响应无显著差异(<15％)，表明17种脂肪酸在此条件下是稳定的。处理后的样品在自动进样器中稳定达24小时，在室温托盘中稳定达3小时，CV％值分别至少为6.57％和6.95％。结果见表4。
表4 17种脂肪酸的样品稳定性(n＝6，以Mean±R.E.％表示)
Figure BDA0003087592710000241
Figure BDA0003087592710000251
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法，所述脂肪酸包括月桂酸C12:0、肉豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、棕榈油酸C16:1w7、油酸C18:1w9、反式油酸E-C18:1w9、亚油酸C18:2w6、α-亚麻酸C18:3w3、β-亚麻酸C18:3w6、花生油酸C20:1w9、花生四烯酸C204w6、二十烷五烯酸C20:5w3、二十二烷六烯酸C22:6w3、二十烷三烯酸C20:3w6、顺二十二烷五烯酸C22:5w3和反二十二烷五烯酸C22:5w6，其特征在于，所述方法包括：以标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控；
优选的，所述脂肪酸质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与同位素内标工作液混合，离心取上清制得；
所述试验样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清；
所述同位素内标工作液为上述17种脂肪酸同位素内标工作液中的任意一种或多种的混合；
优选的，所述同位素内标工作液制备方法为：将脂肪酸的同位素内标原料药使用二甲基亚砜溶解，然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液，所述乙腈和二甲基亚砜的用量比例为15～20:1～5，优选为17:3，所述甲酸含量为0.00001～0.001％，优选为0.0001％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)，流动相B相：乙腈(10mM氟化铵，0.0001％甲酸)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为25～40℃(优选为35℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，梯度洗脱方式具体为：0-3.0min，流动相B55-55％；3.0-5.3min，流动相B 55-90％；5.3-6.3min，流动相B 90-90％；6.3-6.4min，流动相B 90-100％；6.4-8.4min，流动相B100-100％；8.4-8.5min，流动相B 100-55％；8.5-10.0min，流动相B 100-55％。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，质谱条件包括：
离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：负离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
9.一种检测多种脂肪酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：月桂酸C12:0、肉豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、棕榈油酸C16:1w7、油酸C18:1w9、反式油酸E-C18:1w9、亚油酸C18:2w6、α-亚麻酸C18:3w3、β-亚麻酸C18:3w6、花生油酸C20:1w9、花生四烯酸C204w6、二十烷五烯酸C20:5w3、二十二烷六烯酸C22:6w3、二十烷三烯酸C20:3w6、顺二十二烷五烯酸C22:5w3和反二十二烷五烯酸C22:5w6中的任意一种或多种标准品；
月桂酸-d3、肉豆蔻酸-d5、棕榈酸-d3、硬脂酸-d3、棕榈油酸-d5、油酸-d3、亚油酸-d2、亚麻酸-d2、花生油酸-d3、花生四烯酸-d2、二十烷五烯酸-d2、二十二烷六烯酸-d3、二十烷三烯酸-d5、二十二烷五烯酸-d3中的任意一种或多种作为同位素内标原料；
优选的，稀释液为乙腈或含有甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液；
进一步优选的，所述乙腈和二甲基亚砜的用量比例为15～20:1～5，优选为17:3，所述甲酸含量为0.00001～0.001％，优选为0.0001％。
10.权利要求1-8任一项所述方法和/或权利要求9所述试剂盒在脂肪酸的量效关系研究中的应用。
CN202110584310.2A 2021-05-27 2021-05-27 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用 Active CN113325100B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110584310.2A CN113325100B (zh) 2021-05-27 2021-05-27 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110584310.2A CN113325100B (zh) 2021-05-27 2021-05-27 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113325100A true CN113325100A (zh) 2021-08-31
CN113325100B CN113325100B (zh) 2023-04-07

Family

ID=77421676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110584310.2A Active CN113325100B (zh) 2021-05-27 2021-05-27 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113325100B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114324641A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 山东英盛生物技术有限公司 一种冠心病代谢标志物及在诊断、预后方面的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2874738A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Process and apparatus for rapid, high-throughput analysis of fatty acids
CN109239238A (zh) * 2018-11-22 2019-01-18 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法
CN111830163A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 南京品生医学检验实验室有限公司 超高效液相色谱串联质谱检测血清中18种脂肪酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2874738A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Process and apparatus for rapid, high-throughput analysis of fatty acids
CN109239238A (zh) * 2018-11-22 2019-01-18 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法
CN111830163A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 南京品生医学检验实验室有限公司 超高效液相色谱串联质谱检测血清中18种脂肪酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEPH J. PESEK，ET AL: "Ammonium fluoride as a mobile phase additive in aqueous normal phase chromatography", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
JURRE J. KAMPHORST,ET AL: "Liquid chromatography – high resolution mass spectrometry analysis of fatty acid metabolism", 《ANAL CHEM.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114324641A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 山东英盛生物技术有限公司 一种冠心病代谢标志物及在诊断、预后方面的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113325100B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. A tandem mass spectrometry assay for the simultaneous determination of acetaminophen, caffeine, phenytoin, ranitidine, and theophylline in small volume pediatric plasma specimens
Zhang et al. A LC-MS–based workflow for measurement of branched fatty acid esters of hydroxy fatty acids
CN112946101B (zh) 一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法及其应用
Li et al. Comparative analysis of nucleosides and nucleobases from different sections of Elaphuri Davidiani Cornu and Cervi Cornu by UHPLC–MS/MS
CN112129871B (zh) 复合磷脂脂质体中dope和m5两种磷脂含量的检测方法
Magiera et al. Determination of carnitine and acylcarnitines in human urine by means of microextraction in packed sorbent and hydrophilic interaction chromatography–ultra-high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry
CN111257486A (zh) 检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒
CN111929391A (zh) 用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法
CN113325100B (zh) 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用
Jovanov et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to tandem mass spectrometry as a method for simultaneous determination of guanidinoacetate and creatine
CN114264745A (zh) 甲磺酸伊马替尼有关物质及其制剂有关物质的检测方法
CN112394124A (zh) 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法
Xie et al. Simultaneous quantification and pharmacokinetic investigation of selexipag and its main metabolite ACT-333679 in rat plasma by UPLC-MS/MS method
CN111103383A (zh) 一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法
CN111103384A (zh) 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法
CN114544796B (zh) 一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法
CN113030343B (zh) 一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法
CN113820424A (zh) 一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的hplc-ms/ms方法
Lin et al. Determination of phosphatidylserine in milk-based nutritional products using online derivatization high-performance liquid chromatography
CN112213417A (zh) 一种检测干血斑中霉酚酸药物浓度的试剂盒及检测方法
CN112485340A (zh) 一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法
CN112903849B (zh) 一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用
Magiera et al. A rapid method for determination of 22 selected drugs in human urine by UHPLC/MS/MS for clinical application
CN111175392B (zh) 一种止咳枇杷糖浆的质量控制方法
CN114518423B (zh) 一种用于检测盐酸多巴胺注射液中杂质的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant