CN103776911A

CN103776911A - 一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法

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Publication number: CN103776911A
Application number: CN201210405954.1A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 陈世礼; 李艳杰; 李佳; 赵欣捷; 路鑫
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明公开了一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法，将待分析的微量组织冷冻干燥后，准确称量1mg~25mg，加入一定比例的甲醇（MeOH)、甲基叔丁基醚（MTBE)、水等溶剂进行提取。提取完成后溶液分为两层，上层主要含有非极性的代谢物和脂质，下层主要含有极性和中等极性的代谢物。上下层溶液按比例混合冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的代谢组学分析，上层溶液冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的脂质组学分析。本发明的优点在于可以通过少量组织的一次性提取将尽可能多的代谢物和脂质一起提取出来，并进行代谢组学和脂质组学分析，节约了组织样品量以利于进行其它生化分析。

Description

一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及到一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取并进行基于液相色谱-质谱联用的代谢组学和脂质组学分析的新方法。

背景技术

肝脏和肌肉组织代谢紊乱涉及到众多疾病的发生发展。基于液相色谱-质谱联用的非靶标和靶标代谢组学和脂质组学分析是研究健康和患病组织代谢的有用工具。在人体活组织检查时能获得的有限的组织量以及常用小鼠模型可得到的少量组织，使得无论在伦理上或是在实际需求上都需要发展一种高效、节省组织用量的代谢物提取流程。人体肌肉活组织检查时经常得到湿重约50mg的组织，相当于干重15mg。在这么少量的组织中，需要做一系列的分析，例如mRNA和磷酸化蛋白的定量、酶学测定、病理学检查、代谢组学和脂质组学分析等，用于获得对机体代谢的全面认知及其分子机理的探究。一些小鼠肌肉组织，如常用的比目鱼肌，干重只有2.5mg，使得尤其需要发展一种从单一少量组织样本中同时提取分析代谢相关产物的方法，而传统的方法提取代谢相关产物往往需要多种提取步骤，消耗大量的组织样本。

80％甲醇体系是提取具有不同极性的两亲性代谢物的常用方法，而提取甘油三酯等中性的脂质则需要使用亲脂性的有机溶剂。经典的脂质组学提取方法使用氯仿、甲醇、水体系，而氯仿的毒性较大，对实验操作人员存在潜在危害。最近由Matyash等发展的脂质组学提取方法则使用毒性较小的MTBE代替氯仿进行提取。然而到目前为止，全面分析脂质和两亲性代谢物至少需要进行两次提取，这就不可避免导致消耗相对大量的组织样本。

针对目前常用组织提取方法存在的组织样本用量大、需要多次提取等不足，本发明发展了一种从微量组织中同时提取代谢物组和脂质组的新方法，采用一次提取就可从微量组织得到涵盖不同种类的代谢物，继而通过液相色谱-质谱联用方法进行微量组织的代谢组学和脂质组学分析。

发明内容

本发明的目的在于建立一种同时提取微量组织中代谢物组和脂质组的新方法。相对于传统的多次提取方法，此方法消耗的样本量少，通量高，且提取效率可与经典的多次提取方法相当。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

通过甲醇（MeOH)、甲基叔丁基醚（MTBE)、水对待分析的微量组织样本进行提取；提取完成后离心分离去除固体物质，溶液分为两层，上层主要含有非极性的代谢物和脂质，下层主要含有极性和中等极性的代谢物；

上下层溶液混合冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的代谢组学分析，上层溶液冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的脂质组学分析。

具体为：

1）样本制备：将待分析的微量组织样本进行冷冻干燥，并置于-80°C冰箱保存；样本提取前室温解冻，并准确称取1~25mg于离心管中；

2）样本提取：加入300~500μL 75%的甲醇溶液并超声1~10min，然后加入500~2000μL的MTBE并振荡0.25~2h，然后加入150~350μL的水并振荡1~5min，静置5~20min后高速离心，溶液分为上下两层；

3）溶剂用量：75%甲醇溶液与MTBE的体积比例在1:5和1:2之间，水与MTBE的体积比例在在1:5和1:2之间；75%甲醇溶液、MTBE和水的用量可以根据组织样本用量进行成比例的缩放；

4）提取液转移：定量吸取部分上层溶液置于新的离心管中；同时定量吸取部分上层和下层溶液置于另一新的离心管中进行混合，上层和下层混合的比例在3:1和1:1之间；

5）提取液干燥：将离心管中的溶液在冷冻干燥机上进行冷冻干燥；

6）提取物保存：提取物分析前置于-80°C冰箱保存；

7）代谢组学分析：混合层提取物加入50~2000μL 20%~80%的甲醇或乙腈溶液；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标代谢组学分析；

8）脂质组学分析：上层提取物加入50~4000μL乙腈、异丙醇和水的混合溶液（混合体积比例为65:30:5）；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标脂质组学分析。

9）实际样品应用：利用所建立的微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法对实际样本（动物或人的肝脏、肌肉等组织及人体活组织检查样本）进行代谢组学和脂质组学分析。

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1）一次提取可以同时提取出微量组织中的代谢组和脂质组，减小了组织样本用量，节约组织样本以用于其它生化分析；

2）代谢组和脂质组来自同一次提取，两者之间的相对重复性好于多次提取，便于多平台分析的数据整合；

3）溶液提取后上下层混合对代谢物的回收率高于单独使用上层或下层溶液对代谢物的回收率；

4）使用毒性较小的MTBE代替氯仿进行代谢组和脂质组的提取，减小了对实验操作人员的潜在危害；MTBE提取时，蛋白和不溶物沉积在提取试管的底端，有利于提取后上层和下层溶液的转移；而氯仿提取时蛋白和不溶物积聚在提取试管的中间，溶液转移时容易被污染。

附图说明

图1肝脏MTBE混合层提取物的非靶标代谢组学分析色谱-质谱图。

图2MTBE提取肝脏中酰基肉碱的回收率：其中上图为MTBE下层提取物与80％甲醇提取物的酰基肉碱回收率比较；下图为MTBE混合层提取物与80％甲醇提取物的酰基肉碱回收率比较。

图3MTBE混合层提取物与MTBE上层提取物的游离脂肪酸回收率比较

图4肝脏MTBE上层提取物的脂质组学分析色谱-质谱图。

图5肝脏MTBE上层提取物与氯仿/甲醇体系提取物脂质回收率比较。

图6不同肝脏样本量相对于10mg肝脏酰基肉碱的提取回收率。

图7不同肝脏样本量相对于10mg肝脏代表性脂质的提取回收率。

图8比目鱼肌MTBE混合层提取物酰基肉碱分析结果。

图9比目鱼肌MTBE混合层提取物游离脂肪酸分析结果。

图10比目鱼肌MTBE上层提取物（代表性脂质）脂质组学分析结果。

具体实施方式

实施例一：肝脏样本中代谢物组和脂质组的同时提取分析

1.样本采集

肝组织采自麻醉并处死后的C57Bl/6J小鼠，用磷酸缓冲盐冲洗后在液氮中冷冻。冷冻的组织在冷冻干燥机中冻干，并通过组织研磨器磨碎。冻干前后，肝组织保存在-80°C冰箱里。

2.MTBE体系提取代谢物组和脂质组

称取10mg肝组织置于2mL Eppendorf管中，加入400μL 75%甲醇并超声2min。加入1mL MTBE并振荡1h。加入250μL水使提取液分为上下两层。室温静置10min后在14000g转速下离心15min。

移取220μL上层提取液置于1.5mL Eppendorf管中冻干，记为上层提取物；移取110μL下层提取液置于1.5mL Eppendorf管中冻干，记为下层提取物；移取220μL上层提取液和110μL下层提取液混合置于1.5mLEppendorf管中冻干，记为混合层提取物（mix）。

3.80%甲醇体系提取代谢物组（经典代谢组学提取方法）

称取10mg肝组织置于2mL Eppendorf管中，加入1mL甲醇并超声2min，在14000g转速下离心15min。移取200μL上清液置于1.5mLEppendorf管中冻干，记为80%甲醇提取物（MeOH）。

4.氯仿/甲醇体系提取脂质组（经典脂质组学提取方法）

采取经典的氯仿/甲醇（2/1，v/v）体系提取肝组织中的脂质组，并移取相当体积的脂质层溶液冻干用于脂质组学分析。

5.MTBE提取物非靶标代谢组学分析

高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱联用仪（Agilent 1200RRLC-6510Q-TOF MS）用于肝脏MTBE混合层提取物的非靶标代谢组学分析。

肝脏MTBE混合层提取物复溶于100μL的20%甲醇溶液中，进样量为 5μL。色谱柱为UPLC ACQUITY T3柱，柱温为35°C。流动相A为0.1%甲酸/水溶液，流动相B为0.1%甲酸/乙腈，流速为0.3mL/min。洗脱梯度为：1%B起始并保持1min，1至5min线性升至40%B，5至8min线性升至50%B，8至10min线性升至65%B，10至16min线性升至76%B，16至20min线性升至100%B，在100%B保持5min，然后降至1%B并保持5min。质谱采用正离子模式，毛细管电压为4000V，去簇电压为175V，N₂雾化气压为45psi，N₂干燥气流速为9L/min，干燥气温度为350°C，质谱扫描范围为m/z 80~1100。

图1为肝脏MTBE混合层提取物的非靶标代谢组学分析色谱-质谱图。从图1可以看出，通过当前的提取和分析方法，得到了肝脏组织丰富的代谢物信息。通过软件进行信息挖掘，上千个代谢物离子可以被检测出来。6.MTBE提取物靶标代谢组学分析及与经典代谢组学提取方法比较

超高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱联用仪（Agilent 1290 UHPLC-6460 QQQ MS）用于肝脏提取物中酰基肉碱（acylcarnitine）和游离脂肪酸（FFA）的靶标分析。

用于酰基肉碱分析的肝脏提取物复溶于500μL的50%乙腈溶液中，进样量为1μL。色谱柱为UPLC ACQUITY T3柱，柱温为35°C。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.3mL/min。洗脱梯度为：10%B起始并保持0.5min，0.5至3min线性升至15%B，3至5min线性升至30%B，5至19min线性升至97%B，在97%B保持7.5min，然后降至10%B并保持3.5min。质谱采用正离子模式，动态多反应监测。毛细管电压为4000V，喷嘴电压为600V，N₂雾化气压为40psi，N₂干燥气流速为9L/min，温度为350°C。多反应监测的母离子为准分子离子[M+H]⁺，子离子m/z=85.1。

通过靶标的方法可以从肝脏提取物中检测出肉碱和35种酰基肉碱（图2和表1）。与经典的代谢组学提取方法80％甲醇提取物相比，在MTBE下层提取物中，只有碳链长度在C2到C10的酰基肉碱可以被定量提取出来，而C12:1到C20的酰基肉碱的回收率随着碳链增加（非极性增强）而降低，最低的甚至只有10％（图2上图）。而将MTBE提取液上下层混合后，与80％甲醇提取物相比，大部分酰基肉碱的回收率接近100％（图2下图）。这充分说明了MTBE提取时上下两层混合对提高两性代谢物回收率的重要性，同时也可以看出MTBE混合层提取物对酰基肉碱代谢物的提取效率与经典的代谢组学提取方法80％甲醇提取相当。

用于脂肪酸分析的肝脏提取物复溶于1mL的80%甲醇溶液中，1μL用于进样分析。

色谱柱为UPLC ACQUITY C8柱，柱温为35°C。流动相A为10mM甲酸铵水溶液（pH=5），流动相B为乙腈，流速为0.35mL/min。洗脱梯度为：50%B起始并保持0.5min，0.5至15min线性升至90%B，在90%B保持5min，然后降至50%B并保持3min。质谱采用负离子模式，动态多反应监测。毛细管电压为-3500V，喷嘴电压为-400V，N₂雾化气压为40psi，N₂干燥气流速为9L/min，温度为350°C。准分子离子[M-H]^-用作多反应监测的母离子和子离子。

通过当前的方法可以从肝脏提取物中检测出28种游离脂肪酸（图3和表2）。虽然通常认为游离脂肪酸应主要被MTBE体系提取到上层非极性层，但通过比较发现，混合层提取物中游离脂肪酸的回收率要稍优于仅使用上层提取物。这说明上下两层混合对提高非极性代谢物的回收率也是有益的。而与经典的代谢组学提取方法80%甲醇提取体系相比，MTBE混合层提取游离脂肪酸的回收率基本都在80%以上（表2），满足了定量分析的要求。7.MTBE提取物脂质组学分析及与经典脂质组学提取方法比较

超高效液相色谱-Orbitrap质谱联用仪（Thermo UHPLC-Orbitrap MS）用于脂质组学分析。

肝脏提取物复溶于乙腈、异丙醇和水的混合溶液（混合体积比例为65:30:5）。色谱柱为UPLC ACQUITY C8柱，柱温为55°C。流动相A为60%乙腈，流动相B为异丙醇/乙腈（9:1，v/v），二者均含有10mM甲酸铵，流速为0.26mL/min。洗脱梯度为：25%B起始并保持1min，1至4min线性升至50%B，4至19min线性升至97%B，在97%B保持4min，然后降至25%B平衡柱子。Orbitrap质谱正离子模式用于数据采集，质谱扫描范围为m/z 450~1100。根据准确分子量和二级质谱对脂质进行结构鉴定。

从MTBE上层提取物中检测出了上百种脂质，其典型的色谱-质谱图如图4所示。与经典的脂质组学提取方法氯仿/甲醇脂质提取体系相比，MTBE上层提取物中代表性脂质的回收率基本都在80%以上（图5），满足了定量分析的要求。

实施例二：不同样本量肝脏组织中靶标代谢物组和脂质组的同时提取分析为了测试方法所适用的组织样品量，分别称取1mg，2.5mg，5mg，10mg及25mg冻干后的小鼠肝脏组织，采用实施例一中的方法对样品进行提取，并进行靶标的酰基肉碱（混合层提取物）分析及脂质组学（上层提取物）分析。提取物复溶溶剂的体积随着样本用量增加而成比例增加，使得不同样本量组织中酰基肉碱代谢物和脂质分析的结果具有可比性。

从分析结果可以看出，相对于10mg组织，1mg、2.5mg、5mg及25mg组织中绝大多数酰基肉碱类代谢物（图6）及代表性脂质（图7）的提取效率都接近100%，说明本发明所建立的方法适用的组织样本量范围较广（1~25mg）。

实施例三：比目鱼肌样本中靶标代谢物组和脂质组的同时提取分析

上述MTBE提取-液相色谱质谱联用分析方法用于小鼠比目鱼肌（干重2.5mg）中酰基肉碱（混合层提取物)、游离脂肪酸（混合层提取物）等靶标代谢物组和非靶标脂质组（上层提取物）的分析。

在比目鱼肌中可以检测出肉碱和42种酰基肉碱类代谢物（图8），24种游离脂肪酸（图9）和上百种脂质（代表性脂质如图10所示）。从这么少量的肌肉组织中（干重2.5mg）可以检测出这么多的代谢物和脂质，充分显示了本发明所建立方法的优越性。

附表

表1肝组织MTBE混合层提取物与80%甲醇提取物的酰基肉碱回收率比较

表2肝组织MTBE混合层提取物与80%甲醇提取物的游离脂肪酸回收率比较

附表1

*RSD：相对标准偏差，来自三个提取重复的相对标准偏差

附表2

*RSD：相对标准偏差，来自三个提取重复的相对标准偏差

本发明的优点在于可以通过少量组织的一次性提取将尽可能多的代谢物和脂质一起提取出来，并进行代谢组学和脂质组学分析，节约了组织样品量以利于进行其它生化分析。以极性范围较宽的酰基肉碱类代谢物为例，在进行代谢组学分析时，上下两层按比例混合得到的代谢物回收率高于下层极性相的回收率，尤其是对非极性较强的长链肉碱。对于非极性较强的游离脂肪酸类代谢物，上下两层混合得到的代谢物回收率也稍高于上层非极性相的回收率。上下两层按比例混合得到的代谢物回收率与经典的80%甲醇提取体系相当，且方法的稳定性更好，进一步说明了此方法用于代谢组学分析的可行性。在上层非极性相中，可以检测出上百种脂质，而且对脂质的回收率与经典的氯仿/甲醇提取体系相当。本方法也可用于人体活组织检查时代谢物组和脂质组的同时提取分析。

Claims

1.用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法，其特征在于：

通过甲醇MeOH、甲基叔丁基醚MTBE、水对待分析的微量组织样本进行提取；提取完成后离心，溶液分为两层，上层主要含有非极性的代谢物和脂质，下层主要含有极性和中等极性的代谢物；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：进行提取的具体步骤如下，

1）将待分析的微量组织样本进行冷冻干燥，并准确称取1~25mg于离心管中；

2）加入300~500μL 75%的甲醇溶液并超声1~10min，然后加入500~2000μL的MTBE并振荡0.25~2h，然后加入150~350μL的水并振荡1~5min，静置5~20min后高速离心，溶液分为上下两层；

3）吸取部份上层溶液置于新的离心管中，将离心管中的溶液在冷冻干燥机上进行干燥；

同时吸取部份的上层和下层溶液置于另一新的离心管中进行混合，将离心管中的溶液在冷冻干燥机上进行干燥。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：75%甲醇溶液、MTBE和水的用量可以根据组织用量进行成比例的缩放；

75%甲醇溶液与MTBE的体积比例在1:5-1:2之间，水与MTBE的体积比例在1:5-1:2之间。

4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于：同时吸取部份的上层和下层溶液置于另一新的离心管中进行混合时，上层和下层混合的比例在3:1-1:1之间。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于：高速离心的转速为10000g~15000g，离心时间为5~20min。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：冻干的提取物复溶后进行代谢组学和脂质组学分析的具体步骤如下：

1）权利要求2中所述的上下层溶液混合后的冻干物0.2~10mg加入50~2000μL20%~80%的甲醇或乙腈水溶液；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标代谢组学分析；

2）权利要求2中所述的上层溶液冻干物0.1~5mg加入50~4000μL乙腈、异丙醇和水的混合溶液，混合体积比例为65:30:5；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标脂质组学分析。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述微量组织为冷冻干燥后的动物或人的肝脏或肌肉组织。