CN107228908A - 一种基于cid碎裂鉴定脂质组学中脂质成分结构的方法 - Google Patents

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徐建亚
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Abstract

本发明公开了一种基于CID碎裂鉴定脂质组学中未知脂质成分的简单方法，主要技术路线包括：1.建立脂质组学分析测定方法；2.应用多级碎裂质谱杂交高分辨质谱仪建立脂质组学分析测定方法；3.根据精确质量数搜索在线谱库归属所需鉴定的脂质色谱峰所对应的脂质成分类型；4.确定脂质分子中脂肪酰部分总含碳量和不饱和度；5.依据简易公式确定各色谱峰的特征性碎片信息；6.根据得到的特征性碎片信息推导每个脂肪酰基团的含碳个数和不饱和度；7.最终确定脂质分子德结构。该方法准确、灵敏、不依赖于标准化合物，快速的鉴定脂质组学数据中未知脂质分子的结构。

Description

一种基于CID碎裂鉴定脂质组学中脂质成分结构的方法
技术领域：
本发明涉及生命科学，具体涉及代谢组学、脂质组学分析测定方法的建立以及未知脂质成分结构的快速鉴定。
背景技术
由于生命体的整体性、复杂性等特点，现代生物学的发展从器官、组织、细胞到基因的方式，回归到整合性研究的新高度，意味着分子生物学时代进入系统生物学时代。因此，基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等系统生物学研究方法成为诠释生命体科学奥秘和阐明生理病理变化以及药物干预作用机制的新手段。
脂质组学是近年来发展较快的一种系统生物学分析方法，是继代谢组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学新方法。脂质分子在生命科学中发挥着举足轻重的作用。其中，甘油三酯是储存能量的重要物质，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等是构成细胞膜的重要组成成分，同时也是组成细胞器膜，包括线粒体、高尔基体、内质网的重要成分，此外磷脂酰肌醇的代谢产物肌醇是许多生理病理过程中重要的信号分子，而炎症脂质介质，包括花生四烯酸、前列腺素E2、前列腺素D2、血栓烷A2等参与了机体的炎症反应。脂质代谢异常与多种疾病密切相关，如动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、肿瘤、脂肪肝等。研究发现某些特异性的脂质分子参与了疾病的发生发展或者是发挥着干预治疗的作用。如棕榈酰-油酰-磷脂酰甘油(POPG)能够显著干扰人体的呼吸道合胞病毒感染，达到治疗的作用；老年痴呆症患者体内发现缩醛磷脂的含量显著降低。这些例子能够充分脂质分子在生理病理过程中发挥着重要的作用，因此建立稳定性的、普适性的脂质组学分析平台对于揭示这些脂质分子的作用显得十分的举足轻重。
但是由于脂质分子结构的多样性、复杂性以及相应分析手段的滞后阻碍了人们对生命体的整体脂质以及复杂的代谢网络和功能调控进行规模性、整体性的系统研究。近年来，随着快速、高通量、高精度脂质分析技术的发展，特别是软电离离子化技术、高分辨质谱技术、各种杂交质谱的发展使得研究者能够对生物样品中的脂质分子进行全面的，精确的结构确定。尽管分析技术的发展给脂质类化合物的分析带来许多益处，然而基于质谱的脂质分析在对脂质分子结构的进一步确定上存在瓶颈。质谱分析带来了大量的谱图数据，分析工作者需要花很多时间和精力去解析这些谱图，而这项工作对于大部分的生命科学家而言，也比较困难。
鉴于此，本发明应用基于CID碎裂建立了一种快速确定脂质组学中脂质分子的方法，对脂质组学的研究具有重要意义和普遍使用性。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：利用高分辨的质谱建立脂质组学分析测定方法，并对其中的多种脂质成分进行归属，并确定最终的结构。
本发明提供如下技术方案，步骤包括：
a：针对不同的生物样品设计合理的脂质组学提取方法，以确保全面的提取生物样本的脂质成分，脂质提取过程中的影响因素包括：生物样本(如血浆、组织、培养贴壁细胞、培养的悬浮细胞、植物药材、食品、保健品)的含量和提取的方法(固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀、Folch提取法、MTBE提取法等)。
b：根据脂质成分的理化性质选择合适的检测仪器和检测方法；检测仪器指具有能够测定离子精确质量数的高分辨质谱仪同时具有多级或二级碎裂功能的杂交质谱，如高分辨的LTQ-Orbitrap质谱仪测定、Q-TOF质谱仪测定、Q-Orbitrap质谱仪测定；检测方法的选择包括是否选择色谱柱分离、是否选择鸟枪法脂质组学(shotgun lipidomics)、正离子还是负离子、CID碎裂的能量、母离子以及子离子选择的质核比范围，选择二级碎裂还是多级碎裂等；
c：确定母离子及对应的碎裂MS2或/和MS3谱图
d：通过HMDB和Metline Scripps搜库确定该质荷比所对应的脂质成分归属，主要的脂质成分归属包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、丝氨酸等
e：依据附图2和3，即各脂质成分所对应的诊断离子的筛选公式确定其脂肪酰部分的组成，最终确定其脂质成分的结构
本发明具有以下优点：
本发明提出各脂质成分所对应的诊断离子的确证公式能够较快的确定脂质分子的组成，并确定其结构。本发明所涉及的脂质成分包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、丝氨酸等多种类型。
附图说明：
图1该法的技术路线
图2各脂质成分所对应的筛选诊断离子的公式
图3各脂质成分的诊断离子所对应的脂肪酰的结构
图4甘油三酯的MS2碎裂图
图5磷脂酰胆碱的MS2碎裂图
具体实施方式：
实施例1：
人血浆样品中甘油三酯的成分确定
a：血浆样品脂质成分的提取
选择Folch提取法提取血浆样品中的甘油三酯，具体如下：20μL血浆样品加入180μL甲醇充分涡旋，后加入400μL氯仿，样品涡旋，最后引入150μL水分层。充分提取后4℃8000g离心10min。取下层富含脂质的氯仿层。将氯仿溶剂挥干。用异丙醇/甲醇溶剂复溶。离心，取上层清液进样。
b：选择合适的检测方法和检测条件
色谱分离条件：色谱柱：Hypersil GOLD aQ柱(2.1×150mm，3μm I.D.)。流动相：A为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的乙腈/水溶液(40∶60，V/V)，B为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的异丙醇/乙腈溶液(9∶1，V/V)。梯度洗脱流速为0.35mL/min；柱温55℃。
质谱检测条件：电喷雾离子源，正离子模式检测，喷雾电压4.5kV，离子源温度300℃，源电压3.5V，毛细管电压100V，套管镜头100V，鞘气45arb，辅助气10arb。鞘气为高纯氮气，辅气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气。MS1谱图通过FTMS模式获取，扫描范围血浆上层样本为m/z 150～1500，其余均为m/z 80～1000，分辨率设为30000FWHM；MS2谱图通过ITMS模式获取，分辨率为7500FWHM，碰撞能量为35eV。
c：在MS1谱图中确定母离子，并通过精确质量数搜索Metline Scripps数据库确定其相应的甘油三酯的归属。如m/z 894.75629，通过Metline Scripps数据库搜索确定其为甘油三酯。基于精确质量数预测的分子式为C57H100O6N。根据附图2可以确定该甘油三酯中脂肪酰中的总含碳量及总不饱和度，表示为(54∶7)。
d：根据附图2中甘油三酯的公式，在MS2谱图中确定其诊断离子分别为m/z 575.5，597.6，621.5(见附图4)，查附图3确定其所对应的脂肪酰的归属分别为(34∶2)、(36∶5)和(38∶7)，最终确定其主要结构TG(16∶0/18∶2/20∶5)。
实施例2：
SD大鼠肺组织样品中磷脂酰胆碱的成分确定
a：肝组织样品脂质成分的提取
选择甲基叔丁基醚-甲醇提取法(MTBE提取法)提取肝组织样品中的磷脂酰胆碱的成分，具体如下：50mg肝脏样品匀浆后，加入400μL预冷75％甲醇溶液，振荡涡旋10min后加入1mL甲基叔丁基醚，涡旋20min，再加入60μL Milli-Q超纯水，涡旋10min，静置10min，17000rpm离心10min后，样本分层，取上层清液900μL置离心浓缩仪挥干。上层浓缩物予100μL(异丙醇∶甲醇＝8∶2)混合液复溶，水浴超声10min，17000rpm离心10min，取上清液40μL待测。
b：选择合适的检测方法和检测条件
色谱分离条件：色谱柱：Hypersil GOLD aQ柱(2.1×150mm，3μm I.D.)。流动相：A为含0.1％ 甲酸和5mM甲酸铵的乙腈/水溶液(40∶60，V/V)，B为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的异丙醇/乙腈溶液(9∶1，V/V)。梯度洗脱流速为0.35mL/min；柱温55℃。
质谱检测条件：电喷雾离子源，正离子模式检测，喷雾电压4.5kV，离子源温度300℃，源电压3.5V，毛细管电压100V，套管镜头100V，鞘气45arb，辅助气10arb。鞘气为高纯氮气，辅气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气。MS1谱图通过FTMS模式获取，扫描范围血浆上层样本为m/z 150～1500，其余均为m/z 80～1000，分辨率设为30000FWHM；MS2谱图通过ITMS模式获取，分辨率为7500FWHM，碰撞能量为35eV。
c：MS1谱图中确定母离子，并通过精确质量数搜索Metline Scripps数据库确定其相应的磷脂酰胆碱的归属。如m/z 786.60388，通过Metline Scripps数据库搜索确定其为磷脂酰胆碱。基于精确质量数预测的分子式为C44H85O8NP。根据附图2可以确定该磷脂酰胆碱中脂肪酰中的总含碳量及总不饱和度，表示为(36∶2)。
d：根据附图2中磷脂酰胆碱的公式，在MS2谱图中确定其诊断离子分别为m/z 502.4和506.5(见附图5)，查附图3确定其所对应的脂肪酰的归属分别为(18∶2)和(18∶0)，最终确定其主要结构PC(18∶0/18∶2)。

Claims (7)

1.一种基于CID碎裂鉴定脂质组学中未知脂质成分的简单方法，其特征在于由以下几个步骤组成：
a：针对不同的生物样品，优化相应的提取条件，为保证样品浓度在合适的范围，应摸索生物样品所需要的量以及提取脂质成分所选择的方法；
b：根据脂质成分的性质，确定合适的质谱检测仪器以及质谱检测条件，包括是否需要液相分离并确定合适的洗脱梯度、正负离子的选择、使用合适的流动相调节剂、使用合适的色谱柱等；
c：在得到脂质组学色谱质谱图信息的基础上，针对精确的母子质核比，搜索在线脂质组学谱库确定其可能的脂质成分归属，由此确定其结构中脂肪酰的总含碳量和不饱和度；
d：运用简易公式，确定MS2谱图中所对应的诊断离子；
e：根据诊断离子归属各脂肪酰的含碳量和不饱和度，最终确定该脂质分子可能的结构。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤a中涉及的生物样品包括植物样品、动物或人的血浆样品、组织样品、尿液样品、培养贴壁细胞样品、培养悬浮细胞样品、各种食用油、各种保健食品、药品、药材以及其他的各种含有脂质成分的混合物等。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤a中涉及的生物样品提取方法应能够尽可能高回收率的提取所需检测的脂质成分包括固相萃取法、液液萃取提取法、蛋白沉淀法等。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤b中涉及的质谱仪为具有CID碎裂功能并同时具有高准确度的离子精确质量数测定功能的杂交质谱，包括HPLC/Q-TOF、HPLC/LTQ-Orbitrap以及HPLC/Q-Orbitrap等质谱联用仪。
5.如权利要求1b所述的脂质提取方法，其特征在于所述步骤b中所涉及的检测参数应该能够保证在该条件下能够高灵敏的检测到所需检测的脂质成分。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤c中所检测的脂质成分包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、心磷脂、神经酰胺、磷脂甘油、磷脂酰丝氨酸等。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤d中涉及的简易公式为附表1中的公式，用于快速筛选各脂质成分的诊断离子。
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