CN113834888B - 一种血液中4种神经酰胺的精准检测方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液中4种神经酰胺的精准检测方法和试剂盒，包括：(1)一种血液中4种神经酰胺的精准检测方法，步骤如下：血液样本加入内标后，经有机溶剂去除蛋白，上清液经特异性的固相萃取柱对神经酰胺进行富集和纯化，得到的纯化液用液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)分析，以保留时间和离子丰度比为定性依据，采用内标法建立校准曲线进行定量，实现对血液中4种神经酰胺浓度的精准检测。(2)一种血液中神经酰胺精准检测的试剂盒，包括特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、稀释液、沉淀液、活化液、平衡液、淋洗液1和2、萃取液、复溶液和质控样本。本发明可实现血液中Cer16、Cer18、Cer24和Cer24：1的精准定量检测，具有良好的精密度和准确度。

Description

一种血液中4种神经酰胺的精准检测方法和试剂盒
技术领域
本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种血液中4种神经酰胺的精准检测方法和试剂盒。
技术背景
神经酰胺是一种复杂的脂质，在细胞信号传导功能的实现中发挥着重要作用。神经酰胺可以参与介导或调节多种关键的细胞进程，如细胞膜完整性、细胞应激反应、炎症信号传导和细胞凋亡等。神经酰胺的血中浓度与动脉粥样硬化斑块形成以及多种疾病相关。MI Heart Ceramides是测量不良心血管事件风险的一种血液测试，其中血液神经酰胺是不稳定动脉粥样硬化斑块引起的不良心血管事件的预测因子。代谢障碍和血脂异常导致神经酰胺在不适合脂质储存的组织中积累。在代谢循环中神经酰胺浓度升高与动脉粥样硬化斑块的形成、缺血性心脏病、心肌梗死、高血压、中风、2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖有关。三种特定的神经酰胺Cer16、Cer18和Cer24:1已被确定与心血管疾病和胰岛素抵抗高度相关。而Cer16/Cer24、Cer18/Cer24和Cer24:1/Cer24的比值也与心血管疾病的发生密切相关。即使在调整了在年龄、性别、吸烟状况和血液生物标志物如低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、C反应蛋白(CRP)和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的情况下，血液神经酰胺浓度升高也会使发生不良心血管事件的风险更高。因此，精准检测血液中神经酰胺的浓度对预测患者不良心血管事件的风险具有重要意义。
LC-MS/MS是一种采用液相色谱分离质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。目前，已有文献报道应用LC-MS/MS测定血清中多种神经酰胺，但前处理方法多是异丙醇沉淀蛋白法。蛋白沉淀法可去除基质中的蛋白质以提取待测物，但待测物干扰物也会一并提取出来，对检测器造成污染。固相萃取法可有效去除待测物干扰物并进行富集，以降低对检测器灵敏度的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种临床可用的血液中神经酰胺的精准检测方法和试剂盒。该方法先用有机溶剂去除蛋白质，再采用特异性固相萃取材料，高效富集血液中的Cer16(d18:1/16:0)、Cer18(d18:1/18:0)、Cer24(d18:1/24:0)和Cer24：1(d18:1/24:1)，有效去除血液中基质的干扰，实现对4种神经酰胺的精准检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种血液中神经酰胺的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、稀释液、沉淀液、活化液、平衡液、淋洗液1和2、萃取液、复溶液和质控样本。
优选的所述神经酰胺为Cer16(d18:1/16:0)、Cer18(d18:1/18:0)、Cer24(d18:1/24:0)和Cer24：1(d18:1/24:1)。
优选的所述血液样本为血浆或血清。
优选的所述特异性固相萃取柱使用对神经酰胺类物质特异性吸附材料，特异性吸附材料以硅胶为基质，键合相结构为：
Figure BDA0003275422440000021
其中优选的，X为-O-，-NH-，-CONH-，-NHCONH-中的一种，R是C3～C18的正构烷基或苯基中的一种；固相萃取材料硅胶颗粒度为10μm-80μm，孔径为
Figure BDA0003275422440000022
优选的所述校准液为用异丙醇配制的8个浓度的Cer16(d18:1/16:0)、Cer18(d18:1/18:0)、Cer24(d18:1/24:0)和Cer24：1(d18:1/24:1)的混合溶液；其中，Cer16(d18:1/16:0)浓度范围为1～200μmol/L，Cer18(d18:1/18:0)浓度范围为0.2～40μmol/L，Cer24(d18:1/24:0)浓度范围为1.8～360μmol/L，Cer24：1(d18:1/24:1)浓度范围为0.8～160μmol/L。
优选的所述内标溶液为2～50μmol/L C16-d7(d18:1-d7/16:0)、1～20μmol/L C18-d7(d18:1-d7/18:0)、2～90μmol/L C24-d7(d18:1-d7/24:0)和1～40μmol/L C24:1-d7(d18:1-d7/24:1(15Z))的混合溶液。
优选的所述稀释液为PBS溶液或水。
优选的所述沉淀液、萃取液和复溶液为甲醇、乙腈、乙醇、三氯甲烷或异丙醇中的一种或几种。
优选的所述活化液和淋洗液2为甲醇、乙腈或乙醇。
优选的所述平衡液和淋洗液1为水和活化液的混合溶液，其体积比为0％～60％：100％～40％。
一种血液中神经酰胺的精准检测方法，包括以下步骤：
(1)血液样本和内标混合液混合，加入沉淀液，振荡5-20分钟，离心。
(2)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的血液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用萃取液洗脱，收集的洗脱液于40℃下氮气吹干，加入复溶液复溶；
(3)将步骤(2)得到的复溶液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中神经酰胺的含量。
优选的，步骤(3)中的色谱条件：色谱柱：Waters，UPLC BEH Phenyl；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：2μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵，水-乙腈(3:7，v/v)，(B)乙腈-异丙醇(8:2，v/v)溶液；梯度洗脱条件：
Figure BDA0003275422440000031
优选的，步骤(3)中的质谱条件：离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：550℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
Figure BDA0003275422440000032
本发明的有益效果：
1、本发明使用特异性吸附材料，对神经酰胺类化合物能够特异性富集纯化，从而降低对检测器灵敏度的要求；
2、本发明提供的提取方法，可有效去除杂质，实现对人体内4种神经酰胺的精准检测；
3、本发明提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，只有2.5min，有利于高通量测定临床样本；
4、本发明为首个基于液质方法开发的神经酰胺类检测试剂盒，可以同时检测Cer16(d18:1/16:0)、Cer18(d18:1/18:0)、Cer24(d18:1/24:0)和Cer24：1(d18:1/24:1)的含量，准确度高、特异性强，易于临床推广和应用。
附图说明
图1为血浆中Cer16和Cer16-d7的MRM色谱图。
图2为血浆中Cer18和Cer18-d7的MRM色谱图。
图3为血浆中Cer24和Cer24-d7的MRM色谱图。
图4为血浆中Cer24：1和Cer24：1-d7的MRM色谱图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：一种血液中神经酰胺的精准检测试剂盒
一种血液中神经酰胺的精准检测试剂盒，其组成见下表：
Figure BDA0003275422440000041
其中，校准液中各个溶液浓度见下表：
浓度μmol/L Cer16 Cer18 Cer24 Cer24：1
1 1.0 0.2 1.8 0.8
2 2.5 0.5 4.5 2.0
3 5.0 1.0 9.0 4.0
4 10 2.0 18 8.0
5 25 5.0 45 20
6 50 10 90 40
7 100 20 180 80
8 200 40 360 160
实施例2一种血浆中神经酰胺的精准检测方法
该发明的检测方法主要包括以下主要步骤：
1、基于试剂盒产品的神经酰胺提取过程
(1)200μL血浆样本和20μL内标混合液混合，加入400μL沉淀液，振荡5分钟，离心；
(2)特异性固相萃取柱(X为-CONH-，R是C8的正构烷基；固相萃取材料硅胶颗粒为50μm，孔径为
Figure BDA0003275422440000053
)用300μL活化液活化、300μL平衡液平衡，加入上清液样本后，用300μL淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终采用300μL萃取液洗脱，洗脱液于40℃氮气吹干，最终用100μL复溶液复溶。
2、液质分析条件
(1)检测设备：AB SCIEX Triple Quad4500MD液相色谱串联质谱仪
(2)色谱条件：
色谱柱：Waters，UPLC BEH Phenyl；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：2μL；
流动相：(A)5mmol/L甲酸铵，水-乙腈(3:7，v/v)，(B)乙腈-异丙醇(8:2，v/v)溶液；梯度洗脱条件：
Figure BDA0003275422440000051
(3)质谱条件：
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：550℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
Figure BDA0003275422440000052
3、检测结果计算
采用校准曲线法计算血浆中各神经酰胺的浓度。取20μL校准溶液加入180μL稀释液混合，按照步骤1中“基于试剂盒产品的神经酰胺提取过程”项进行样品处理后，进行液质分析。根据各物质峰面积As和相应内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)对浓度C进行权重线性回归，拟合校准曲线，权重为1/C2(C为浓度值，单位：μmol/L)。血浆中各神经酰胺同其内标测得的峰面积之比代入校准曲线，计算血清中各神经酰胺的浓度。
表1.LC-MS/MS法测定神经酰胺结果分析
Figure BDA0003275422440000061
实施例3一种血液中神经酰胺的精准检测方法的准确度和精密度
基于试剂盒的检测方法的准确度和精密度评价实施方案如下：
采用添加低、中、高3个浓度的混合血浆样本作为待测样本，对3个浓度样本每批次各6份进行检测，测定3个批次，测定实施过程同实施例2，分别计算准确度、批内CV和批间CV，结果显示如下表，显示该方法具有优异的准确度和精密度性能。
表2方法的准确度和精密度性能
Figure BDA0003275422440000062
实施例4特异性填料、C8、异丙醇蛋白沉淀法检测性能结构对比
1、特异性固相萃取柱制备、装填
对硅胶进行酸化、键合等处理得到特异性填料(所述特异性吸附填料的结构中，X为-CONH-，R是C8的正构烷基；固相萃取材料硅胶颗粒度为50μm，孔径为
Figure BDA0003275422440000072
)装填填料50mg置1mL柱管内，备用；
Figure BDA0003275422440000071
2、性能对比实施方案：
(1)使用特异性填料、C8的检测过程：
以低浓度质控样本，按照实施例2操作，特异性填料固相柱和C8固相萃取柱平行实验对比。
(2)异丙醇沉淀蛋白法的检测过程：
取200μL低浓度质控样本1.5mL的EP管中，加入20μL内标和400μL异丙醇，2000rpm振荡5分钟，15000g离心5min，取300μL氮气吹干，加入100μL 50％甲醇异丙醇复溶，进样量2μL。
3、检测结果：各检测过程平行制备6样本进行分析，4种化合物的峰面积响应见下表，结果显示特异性萃取填料对神经酰胺的富集能力和萃取性能稳定性优于C8固相萃取柱和蛋白沉淀法。
表3性能对比：Cer16的峰面积响应
Cer16 沉淀蛋白法 C8 特异性萃取填料
1 1.17E+05 1.05E+05 1.74E+04
2 1.33E+05 1.10E+05 1.72E+04
3 1.43E+05 9.70E+04 1.80E+04
4 1.34E+05 1.04E+05 1.79E+04
5 1.60E+05 1.07E+05 1.75E+04
6 1.21E+05 8.52E+04 1.82E+04
Average 1.34E+05 1.01E+05 1.77E+04
RSD％ 11.6 8.9 4.2
表4性能对比：Cer18的峰面积响应
Cer18 沉淀蛋白法 C8 特异性萃取填料
1 2.16E+04 1.40E+04 3.00E+03
2 2.03E+04 1.23E+04 2.97E+03
3 2.10E+04 1.51E+04 3.10E+03
4 2.15E+04 1.11E+04 3.20E+03
5 2.24E+04 1.37E+04 2.96E+03
6 2.37E+04 1.64E+04 2.90E+03
Average 2.18E+04 1.38E+04 3.02E+03
RSD％ 7.5 13.8 5.4
表5性能对比：Cer24的峰面积响应
Cer24 沉淀蛋白法 C8 特异性萃取填料
1 1.60E+05 4.21E+05 5.55E+05
2 1.77E+05 4.07E+05 6.06E+05
3 1.68E+05 3.84E+05 5.82E+05
4 1.82E+05 4.21E+05 5.79E+05
5 1.91E+05 3.76E+05 6.18E+05
6 2.03E+05 4.91E+05 6.28E+05
Average 1.80E+05 4.17E+05 5.95E+05
RSD％ 8.6 9.8 4.6
表6性能对比：Cer24：1的峰面积响应
Cer24:1 沉淀蛋白法 C8 特异性萃取填料
1 2.67E+05 1.22E+05 6.47E+04
2 2.35E+05 1.54E+05 6.56E+04
3 2.44E+05 1.73E+05 6.17E+04
4 2.33E+05 1.66E+05 6.22E+04
5 2.12E+05 1.84E+05 6.54E+04
6 2.61E+05 2.01E+05 6.64E+04
Average 2.42E+05 1.67E+05 6.43E+04
RSD％ 8.3 16.3 3.6
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血液中神经酰胺的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成包括：特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、稀释液、沉淀液、活化液、平衡液、淋洗液1、淋洗液2、萃取液、复溶液和质控样本；
所述神经酰胺为N-棕榈酰鞘氨醇(Cer16(d18:1/16:0))、N-硬脂酰神经鞘氨醇(Cer18(d18:1/18:0))、N-木质纤维素鞘氨醇(Cer24(d18:1/24:0))和N-神经酰鞘氨醇(Cer24：1(d18:1/24:1))；
所述血液的样本为血浆或血清；
所述特异性固相萃取柱使用对神经酰胺类物质的特异性吸附材料，所述特异性吸附材料以硅胶为基质，键合相结构为：
Figure 271261DEST_PATH_IMAGE001
其中X为-CONH-，R是C8的正构烷基；固相萃取材料硅胶颗粒度为50μm，孔径为80
Figure 226710DEST_PATH_IMAGE002
；
所述萃取液为甲醇、乙腈、乙醇、三氯甲烷或异丙醇中的一种或几种；
所述活化液和淋洗液2为甲醇、乙腈或乙醇；
所述平衡液和淋洗液1为水和活化液的混合溶液，其体积比为0％～60％：100％～40％。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准液为用异丙醇配制的8个浓度的Cer16(d18:1/16:0)、Cer18(d18:1/18:0)、Cer24(d18:1/24:0)和Cer24：1(d18:1/24:1)的混合溶液；其中，Cer16(d18:1/16:0)浓度范围为1～200μmol/L，Cer18(d18:1/18:0)浓度范围为0.2～40μmol/L，Cer24(d18:1/24:0)浓度范围为1.8～360μmol/L，Cer24：1(d18:1/24:1)浓度范围为0.8～160μmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标混合液为2～50μmol/L C16-d7(d18:1-d7/16:0)、1～20μmol/L C18-d7(d18:1-d7/18:0)、2～90μmol/L C24-d7(d18:1-d7/24:0)和1～40μmol/L C24:1-d7(d18:1-d7/24:1(15Z))。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为PBS溶液或水。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述沉淀液和复溶液为甲醇、乙腈、乙醇、三氯甲烷、异丙醇中的一种或几种。
6.一种使用权利要求1-5任一项所述试剂盒检测血液中神经酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液样本和内标混合液混合，加入沉淀液，振荡5-20分钟，离心；
(2)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的血液样本上清液，使用淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终用萃取液洗脱，收集的洗脱液于40℃下氮气吹干，加入复溶液复溶；
(3)将步骤(2)得到的复溶液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中神经酰胺的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的色谱条件：色谱柱：Waters，UPLC BEH Phenyl；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：2μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵，水-乙腈(3:7，v/v)，(B)乙腈-异丙醇(8:2，v/v)溶液；梯度洗脱条件：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
质谱条件：离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：550℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
Figure 425610DEST_PATH_IMAGE004
。
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