CN111521705A - 一种血清中胆汁酸的富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清中胆汁酸的富集方法，包括如下步骤：血清样品经过一定的预处理，然后经过填装特异性富集净化材料的固相萃取(SPE)小柱，通过优化制备过程中所用溶剂的配比及用量，得到富集净化的样品洗脱溶液，进行高效液相色谱‑串联质谱检测分析。特异性净化材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，利用苯基键合相与胆汁酸的甾体多元环平面疏水作用及n‑π作用，极性基团与胆汁酸的极性部分发生氢键和静电作用，来实现对血清中多种胆汁酸的特异性富集净化。本发明操作过程简单，样本处理干净，高效液相色谱‑串联质谱检测灵敏度高，选择性好，定量准确，具有广阔的应用价值。

Description

一种血清中胆汁酸的富集方法

技术领域

本发明属于临床质谱检测领域，具体地说是一种检测血清中胆汁酸的富集方法。

技术背景

胆汁酸由胆固醇代谢产生，根据合成途径，可以分为由胆固醇为原料直接合成的初级胆汁酸和代谢产生的次级胆汁酸。胆汁酸是胆汁的重要组成成分，是人体脂肪代谢的必须物质。胆汁酸不仅能够调节葡萄糖和脂代谢，还能与肠道菌群相互作用，具有重要的临床意义。正常情况下，大部分的胆汁酸都参与肠肝循环，体循环和尿液中含量很低，然而当出现肝胆疾病而致使胆汁酸摄取、分泌、运转功能受损时，肝内、血液以及尿液中胆汁酸水平显著升高。因此，胆汁酸浓度的升高可作为肝脏疾病的指标。近年来的研究发现，胆汁酸也具有细胞毒性，当胆汁酸在体内超过正常水平时，会引起肝损伤，胆汁淤积症，严重可诱发肝癌。然而，由于不同亚型的胆汁酸的毒性与其生化特征有关，使其在临床上具有不同的诊断意义，因此检测每一种亚型的胆汁酸在体内水平而非简单地定量测量总胆汁酸水平，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要意义。

目前临床上主要开展胆汁酸的检测方法包括电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法，以及液相色谱-串联质谱法等。电化学检测法只能测定总胆汁酸量，而不能分别测定每一种亚型胆汁酸。气相色谱法及气相色谱与质谱联用技术需要将样品进行衍生化、前处理耗时烦琐。高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足。液相色谱-串联质谱法利用液相色谱的高分离能力及质谱的高分辨能力，使得该方法应用范围广，灵敏度高、专属性强、能提供相对分子质量和结构信息，可同时检测不同亚型的胆汁酸，且在较高的准确度和精密度的前提下，能够实现分析时间短、高通量的检测。

普通的液相色谱-串联质谱检测血清中的胆汁酸时，其血清前处理多采用简单的甲醇或乙腈等有机试剂沉淀蛋白后取上清液直接进样分析，或上清液经吹干复溶后进样分析，血清样品中基质干扰较大，对色谱柱及质谱污染较为严重，大大降低了质谱检测的灵敏度。因此本发明针对胆汁酸的结构特点，设计开发一种对胆汁酸特异性的富集净化的固相萃取填料，当样品通过填装该特异性固相萃取填料的固相萃取柱时，胆汁酸被特异性保留，其他组分则透过吸附剂流出小柱，最后通过较强的洗脱液选择性的将胆汁酸洗脱下来，以达到富集纯化胆汁酸的目的，用于下一步的液相色谱串联质谱检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种对血清中胆汁酸的富集方法和检测方法。特异性固相萃取材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，利用苯基键合相与胆汁酸的甾体多元环平面疏水作用及n-π作用，极性基团与胆汁酸的极性部分发生氢键和静电作用，对血清中的胆汁酸进行特异性的富集净化，去除血清中基质的干扰，以实现简单、高效的前处理过程，并进行液相色谱-串联质谱的高灵敏度，高选择性，高准确性的检测。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种对血清中胆汁酸的富集方法和检测方法，包括如下步骤：

(1)血清样本预处理：取血清样品置于EP管中，加入同位素内标，混匀，加入与血清一定体积比的稀释液进行稀释血清，混匀；

(2)固相萃取柱的填装：将特异性固相萃取材料填装于柱管内；

(3)固相萃取过程：对步骤(2)所述固相萃取柱进行活化，平衡，上样，淋洗，洗脱，最后收集所有洗脱液；

(4)液相色谱串联质谱检测：将步骤(3)收集的洗脱液，氮气吹干，初始流动相复溶，复溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到血清中各胆汁酸与同位素内标峰面积的比值。

(5)校准曲线的建立：采用最小二乘法进行线性回归分析，并绘制校准曲线；

(6)样本中胆汁酸浓度的计算：将步骤(4)得到的样品中各胆汁酸与同位素内标峰面积的比值代入步骤(5)所得的校准曲线，计算样品中胆汁酸的含量。

优选地，步骤(1)中血清样本用量为50-500μL。

优选地，步骤(1)中同位素内标为氘代胆酸、氘代甘氨脱氧胆酸、氘代牛磺胆酸、氘代牛磺熊脱氧胆酸中的一种或几种，浓度为1μM-50μM，用量为5-50μL。

优选地，步骤(1)中稀释液为甲酸水溶液，甲酸浓度为0.05％-0.2％。

优选地，步骤(2)中特异性固相萃取材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，结构式如下：

优选地，步骤(2)中特异性固相萃取材料中X为Cl，Br，I，CN，NH₂中的一种；Y为O，NH，CH₂中的一种，键合相中X和Y基团的摩尔比为1:10-10:1。

优选地，步骤(2)中特异性固相萃取材料硅胶颗粒度为15μm-100μm，孔径为

比表面积150m²/g-400m²/g。

优选地，步骤(2)中固相萃取柱的规格为：填料50-500mg，柱管体积1-6mL。

优选地，步骤(3)的操作步骤为：先采用有机溶剂对固相萃取柱进行活化；再加入水进行平衡；将步骤(1)全部预处理样品上样后，加入有机溶剂和水混合液进行淋洗；最后用有机溶剂进行洗脱。

优选地，步骤(3)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种组成；有机溶剂与水混合液中，有机溶剂与水的体积比为0:100-30:100。

优选地，步骤(4)中氮气吹干时温度为30-60℃。

优选地，步骤(4)中高效液相色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱，规格为3μm，50*4.6mm；流动相A：含氨水的甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液的浓度为2-10mmol/L，氨水与甲酸铵水溶液的体积比为0.01％-0.1％；流动相B：甲醇和/或乙腈溶液，流动相流速0.3-1mL/min；梯度洗脱；柱温30-50℃；进样量：1-10uL。

优选地，步骤(4)中质谱条件为：

采用ESI离子源，负离子扫描；喷雾电压：-4500V；离子源温度：450-550℃；雾化气：45-65psi；辅助雾化气：45-65psi；气帘气：20-30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。

优选地，步骤(5)中绘制校准曲线的参数设置为：采用最小二乘法进行线性回归分析，权重设为1/x2。

本发明的有益效果：

(1)使用以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料的新型特异性固相萃取填料进行样本前处理，操作简单，能够去除基质效应，减少对色谱柱及质谱的污染，增加灵敏度和准确度。

(2)采用液相色谱串联质谱仪进行检测，可以同时定性并准确定量血清中多种胆汁酸。

(3)检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，有利于实现临床血清胆汁酸样本的高通量、准确检测。

附图说明

图1为标准品中胆汁酸检测结果色谱图，色谱峰分别为：1.石胆酸(LCA)、2.脱氧胆酸(DCA)、3.鹅脱氧胆酸(CDCA)、4.熊脱氧胆酸(UDCA)、5.胆酸(CA)、6.甘氨石胆酸(GLCA)、7.甘氨脱氧胆酸(GDCA)、8.甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、9.甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、10.甘氨胆酸(GCA)、11.牛磺石胆酸(TLCA)、12.牛磺脱氧胆酸(TDCA)、13.牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、14.牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、15.牛磺胆酸(TLCA)。

图2为人血清中胆汁酸检测结果色谱图，色谱峰标号同图1。

图3为脱氧胆酸的校准曲线；

图4为甘氨胆酸的校准曲线；

图5为牛磺熊脱氧胆酸的校准曲线。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

以下实施例中均以检测人体内常见的15种胆汁酸为例，分别为：石胆酸(LCA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、胆酸(CA)、甘氨石胆酸(GLCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TLCA)。

实施例1：对比普通苯基固相萃取柱及本发明特异性固相萃取柱的萃取效率。

(1)校准溶液的配置

校准工作液的配制：准确配制胆汁酸标准品储备液(10mg/mL)，用甲醇稀释得到中间储备液，采用隔点稀释法稀释中间储备液得到一系列校准溶液，备用；

(2)样本预处理：

样品组：取无胆汁酸的空白血清样本90μL，加入10μL胆汁酸校准溶液(浓度为系列校准溶液中任意浓度)，涡旋混匀，加入100μL 0.05％甲酸水溶液，涡旋混匀，平行处理12个样本；

对照组：取无胆汁酸的空白血清样本90μL，加入10μL甲醇溶液，涡旋混匀，加入100μL 0.05％甲酸水溶液，涡旋混匀，平行处理12个样本。

(3)装填固相萃取柱：装填本发明的特异性固相萃取填料(其中X为NH₂，Y为O，X和Y基团的摩尔比为1:2，填料硅胶颗粒度为30μm，孔径为

比表面积300m²/g)50mg置于1mL柱管内。

(4)固相萃取分离：将步骤(3)得到的装填本发明特异性固相萃取填料的固相萃取柱与同等规格的市售普通苯基固相萃取柱采用相同的固相萃取过程：先采用甲醇500μL活化；再加入水500μL平衡；将步骤(2)预处理样本全部上样，其中6个样品组样本和6个对照组样本上普通苯基固相萃取柱，6个样品组样本和6个对照组样本上本发明特异性固相萃取柱；加入纯水500μL淋洗一次，再加入5％甲醇水500μL淋洗一次；最后用乙腈1mL洗脱，收集全部的洗脱馏分，在对照组过SPE柱后的洗脱液中，分别加入10μL胆汁酸校准溶液(与样本组在预处理时加入浓度相同)，50℃氮气吹干，初始流动相复溶，待上样分析。

(5)高效液相色谱串联质谱检测：将步骤(4)待测样品复溶液上样检测，采用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，分别得到两种固相萃取柱样品组经萃取的峰面积与对照组未经萃取的峰面积。

高效液相色谱条件和质谱条件：

1)高效液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex，Gemini C18 3μm，50*4.6mm；流动相：(A)2mM甲酸铵水溶水溶液(含0.05％氨水)，(B)甲醇：乙腈＝7:3(v/v)，梯度洗脱见表1；柱温40℃，进样体积：1μL。

表1高效液相色谱梯度条件

2)质谱条件

采用ESI离子源，负离子扫描；喷雾电压：-4500V；离子源温度：450℃；雾化气：45psi；辅助雾化气：45psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)；胆汁酸的定量离子对、驻留时间、碰撞能量等见表2。

表2胆汁酸的质谱参数

(6)萃取效率的计算：

用6个样本的平均回收率表示，结果见表3。

表3普通苯基填料与本发明特异性填料固相萃取柱处理后的萃取效率

由表3对比可以看出，本发明的固相萃取材料的萃取回收率更高，且对每个亚型胆汁酸的萃取效率都能达到90％以上。

实施例2对比不同前处理方法定量下限的准确度

(1)校准溶液的配置

1)校准工作液的配制：与实施例1相同。

2)内标标准溶液的配制：准确配制甘氨脱氧胆酸同位素内标及牛磺胆酸同位素内标标准储备液(10mg/mL)，用甲醇稀释得到混合内标溶液，浓度为20μmol/L，备用；

3)校准溶液的配置：分别取步骤1)的系列校准溶液各10μL，加入无胆汁酸的空白血清90μL，涡旋混匀，备用。

(2)样本预处理

取10μL胆汁酸定量下限校准溶液(浓度为系列校准溶液中最低浓度)，加入无胆汁酸的空白血清样本90μL，涡旋混匀；与步骤(1)中3)配制的校准溶液同步处理，加入100μL0.05％甲酸水溶液，涡旋混匀。

(3)使用蛋白沉淀方法：在步骤(2)预处理样本中加入300μL乙腈溶液，涡旋混合5min，在4℃下，以15000g离心10min，取上清液直接进样。定量下限样本平行处理6个。

(4)使用本发明特异性填料固相萃取：

1)装填固相萃取柱：装填规格和过程与实施例1相同；

2)固相萃取过程：

采用甲醇500μL活化；再加入水500μL平衡；将步骤(2)预处理样本全部上样；加入纯水500μL淋洗一次，再加入5％甲醇水500μL淋洗一次；最后用乙腈1mL洗脱，收集全部的洗脱馏分，50℃氮气吹干，初始流动相复溶，待上样分析。定量下限样本平行处理6个。

(5)高效液相色谱-串联质谱法检测：

高效液相色谱条件和质谱条件与实施例1相同。

(6)计算定量下限的准确度，以6个样本平均回收率表示，结果见表4。

表4蛋白沉淀方法与本发明特异性填料固相萃取柱处理后定量下限的准确度

由表4对比可以看出，本发明的填料固相萃取的定量下限准确度要明显优于蛋白沉淀方法的定量下限准确度。

实施例3血清样本检测

(1)校准溶液的配置

与实施例2相同。

(2)样本预处理

1)校准曲线溶液的配置：取无胆汁酸的空白血清样本90μL，加入10μL胆汁酸系列校准溶液，加入10μL同位素内标溶液(同实施例2)，涡旋混匀，加入100μL 0.05％甲酸水溶液，涡旋混匀；

2)血清样本预处理：取100μL血清样品置于EP管中，加入10μL同位素内标溶液(同实施例2)，涡旋混匀，加入100μL 0.05％甲酸水溶液，涡旋混匀。

(3)装填固相萃取柱：装填规格和过程与实施例1相同。

(4)固相萃取过程：

采用甲醇500μL活化；再加入水500μL平衡；将步骤(2)预处理样本全部上样；加入纯水500μL淋洗一次，再加入5％甲醇水500μL淋洗一次；最后用乙腈1mL洗脱，收集全部的洗脱馏分，50℃氮气吹干，初始流动相复溶，待上样分析。

(5)高效液相色谱-串联质谱法检测：

高效液相色谱条件和质谱条件与实施例1相同。

(6)校准曲线的建立：采用最小二乘法进行线性回归分析，权重设为1/x²，并绘制校准曲线；部分标准曲线见附图3-5。

(7)样本中胆汁酸浓度的计算：将步骤(5)得到的样品中各胆汁酸与同位素内标峰面积的比值代入步骤(6)所得的校准曲线，计算血清样品中胆汁酸的含量。对120个正常人血清胆汁酸含量进行了测定，见表5(以120个人的平均值表示)。

表5血清胆汁酸测定结果(n＝120)

胆汁酸	血清浓度(μmol/L)
		LCA	0.03
DCA	0.59
		CDCA	0.85
UDCA	0.21
		CA	0.55
GLCA	0.02
		GDCA	0.39
GCDCA	1.38
		GUDCA	0.28
GCA	0.43
		TLCA	0.01
TDCA	0.04
		TCDCA	0.15
TUDCA	0.01
		TCA	0.05

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种血清中胆汁酸的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)血清样本预处理：取血清样品置于EP管中，加入同位素内标，混匀，加入与血清一定体积比的稀释液进行稀释血清，混匀；

(2)固相萃取柱的填装：将特异性固相萃取材料填装于柱管内；

(3)固相萃取过程：对步骤(2)所述固相萃取柱进行活化，平衡，上样，淋洗，洗脱，最后收集所有洗脱液；

(4)液相色谱串联质谱检测：将步骤(3)收集的洗脱液，氮气吹干，初始流动相复溶，复溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到血清中各胆汁酸与同位素内标峰面积的比值。

(5)校准曲线的建立：采用最小二乘法进行线性回归分析，并绘制校准曲线；

(6)样本中胆汁酸浓度的计算：将步骤(4)得到的样品中各胆汁酸与同位素内标峰面积的比值代入步骤(5)所得的校准曲线，计算样品中胆汁酸的含量。

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(1)中血清样本用量为50-500μL；同位素内标为氘代胆酸、氘代甘氨脱氧胆酸、氘代牛磺胆酸，氘代牛磺熊脱氧胆酸中的一种或几种；同位素内标浓度为1μM-50μM；同位素内标用量为5-50μL；稀释液为甲酸水溶液；稀释液的甲酸浓度为0.05％-0.2％。

3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(1)中是通过涡旋，震荡或超声进行混匀。

4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(2)中特异性固相萃取材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，结构式如下：

其中，X为Cl，Br，I，CN，NH₂中的一种；Y为O，NH，CH₂中的一种；键合相中X和Y基团的摩尔比为1:10-10:1。

5.根据权利要求4所述的富集方法，其特征在于，步骤(2)中特异性固相萃取材料硅胶颗粒度为15μm-100μm，孔径为

比表面积150m²/g-400m²/g。

6.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(2)中固相萃取柱的规格：填料50-500mg，柱管体积1-6mL。

7.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(3)的操作步骤为：先采用有机溶剂对固相萃取柱进行活化；再加入水进行平衡；将步骤(1)全部预处理样品上样后，加入有机溶剂和水混合液进行淋洗；最后用有机溶剂进行洗脱；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种组成；有机溶剂与水混合液中，有机溶剂与水的体积比为0:100-30:100。

8.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(4)中氮气吹干时温度为30-60℃。

9.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(4)中高效液相色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱，规格为3μm，50*4.6mm；流动相A：含氨水的甲酸铵水溶液，流动相B：甲醇和/或乙腈溶液；流动相流速0.3-1mL/min；梯度洗脱；柱温30-50℃；进样量：1-10uL；其中，甲酸铵水溶液的浓度为2-10mmol/L，氨水与甲酸铵水溶液的体积比为0.01％-0.1％；

步骤(4)中质谱条件：

采用ESI离子源，负离子扫描，喷雾电压：-4500V；离子源温度：450-550℃；雾化气：45-65psi；辅助雾化气：45-65psi；气帘气：20-30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。

10.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，步骤(5)中绘制校准曲线的参数设置为：采用最小二乘法进行线性回归分析，权重设为1/x²。

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