CN115521464B - 一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶及其制备方法和在检测类固醇激素药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境功能材料及其环境检测技术领域，公开了一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶及其制备方法和在检测类固醇激素药物中的应用。所述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的制备方法包括如下步骤：将硅胶放入甲醇中活化，以将其表面的羟基氧化并提高其比表面积，然后将苯甲酰基异硫氰酸酯为原料，DMF为溶剂，通过异氰酸酯与羟基反应合成异硫酰胺键连的苯环硅胶，得到所述的改性硅胶。本发明中的改性硅胶结合固相萃取柱装置可用于萃取水体环境中的类固醇激素药物如具有环戊烷多氢菲母核的甾体激素药物等，进行检测分析，萃取操作步骤成熟可控，萃取相与样品能稳定快速准确萃取分离于环境中，不仅萃取的操作步骤标准成熟，而且应用范围广泛。

Description

一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶及其制备方法和在检测类 固醇激素药物中的应用
技术领域
本发明属于环境功能材料及其环境检测技术领域，特别涉及一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶及其制备方法和在检测类固醇激素药物中的应用。
背景技术
类固醇激素，又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，如孕酮、乙酸甲地孕酮等。激素具有十分重要的生物价值，同时全面维持着动物个体生命活动体征。类固醇激素药物的发现与发展是药物化学学科发展的重要阶段。在药用的意义来看，例如天然的可的松可以起到良好的抗炎和抗过敏的效果；雌二醇和黄体酮可以治疗女性疾病而且可以达到避孕的效果；人工合成的类固醇激素也可用于改善代谢功能。对于系统性类固醇激素治疗方案中，特别是长期大剂量使用，会伴随着大量严重的不良反应，可能出现骨坏死、骨疾病等。精神异常，白内障、青光眼等颅内疾病。2019年，类固醇激素被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。同时通过脊椎动物的排放，造成严重的生态环境破坏。
类固醇激素排放至环境中会与环境性结合，会与土壤或者水环境中的沉淀物相结合吸附、降解、随水相流动移动，或者会构成激素之间的相互反应，其最终产物与中间产物都对生态环境有着严重的危害。但存在于不同环境中的激素含量普遍不高，对其进行检测需要对目标化合物进行富集、浓缩和净化、除杂等前处理操作。在检测萃取技术手段的选择中，目前市场中主要以固相萃取为主，最常见的是固相萃取柱，根据不同尾端官能团的作用对目标化合物进行富集吸附。水基质下，例如研究人员利用反相固相萃取柱、C-18固相萃取柱、石墨化炭黑吸附剂(Carbograph-1)固相萃取柱、混合模式阳离子交换的固相萃取柱、固相圆盘萃取(SPDE)等，分别在牛奶、地表水、废水、河水等多种水环境下具有良好的富集效果。固相萃取柱以方便操作，过水量大等优点被广泛应用，但其效果与表面化学结构有着决定性的关系。
因此，提供一种新型表面化学结构的硅胶固相萃取柱，稳定快速准确萃取环境中的类固醇激素药物具有重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶。
本发明的再一目的在于提供一种由上述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶制备而成的改性硅胶固相萃取柱。
本发明的又一目的在于提供一种由上述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶和改性硅胶固相萃取柱在检测类固醇激素药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)称量质量比为1:1～1:3的未改性硅胶与苯甲酰基异硫氰酸酯，将未改性硅胶在室温下浸泡于甲醇溶液中活化1～2h，无需干燥，得到预处理后的硅胶；
(2)将步骤(1)所得预处理后的硅胶加入到体积分数为2％～50％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，在温度为10～100℃的环境中搅拌反应10～48小时，得到改性硅胶溶液；
(3)将步骤(2)中得到的改性硅胶溶液加入丙酮，放入冷冻离心机中设置参数为2000-8000rpm，5～20℃，离心3～10min，倒出上清液，继续加入丙酮洗涤后，再放入冷冻离心机中以2000-8000rpm，5～20℃的参数离心3～10min，反复多次洗涤和离心直至硅胶洗涤干净或洗涤至无色；最后将其置于30～80℃条件下烘干，得到异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶。
步骤(1)中所述的硅胶为市售净化硅胶，每颗半径为20～100μm，优选为50μm；
步骤(1)中所述活化的时间为1.5h；
步骤(2)中所述的改性硅胶，具体是以DMF为溶剂，通过预处理后的硅胶表面羟基与甲酰基异硫氰酸酯中的异硫氰酸酯基自发反应生成异硫酰胺键连的尾链为苯环改性硅胶；
步骤(2)中所述的甲酰基异硫氰酸酯的DMF溶液的体积分数为10％；
步骤(2)中所述的搅拌反应的时间为10～48h，优选为24h；
步骤(2)中所述的温度优选为50℃；
步骤(3)中所述的烘干的温度为30～80℃，优选为60℃；
步骤(3)中所述的烘干的时间30min。
步骤(3)中冷冻干燥机中离心是采用低温条件可快速使固液分离且明显且减少丙酮的挥发。
一种由上述的制备方法制备得到的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶。
一种由上述的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶制成的改性硅胶固相萃取柱，所述改性硅胶固相萃取柱按照以下方法制备得到：称取50-500mg异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶，将筛板1、异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶、筛板2的顺序依次装入3mL或者6mL的固相萃取空柱中，筛板1的最小孔径为20μm，筛板2的最小孔径大于异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的粒径；且用1～5Mpa的压力或用手压将三者压至底部得到改性硅胶固相萃取柱。
所述筛板1、筛板2与固相萃取空柱的半径相同，配套使用；所述压力采用自动压片机实施；所述手压的力度以保证体均匀流过即可。
上述的改性硅胶固相萃取柱在检测类固醇激素药物中的应用，所述的类固醇激素药物为化学结构中是四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核的甾体激素药物。
所述的类固醇激素药物为孕酮，乙酸甲地孕酮、表雄酮中的至少一种。
所述检测类固醇激素药物具体包括如下步骤：
(A)样品制备：将待测样品用稀盐酸调节pH值至3.0～7.0，得到液相样品于2～8℃冷藏保存；
(B)活化和萃取：将改性硅胶固相萃取柱套用在固相萃取装置当中，依次用2～5mL甲醇、2～5mL的pH5.0纯水和2～5mL纯水润洗使其活化，然后将步骤(A)中得到的液相样品加入到活化后的改性硅胶固相萃取柱中，以0.2～2mL/min的流速富集浓缩目标物，再将改性硅胶固相萃取柱用抽真空泵以负压的形式将空气从柱子上部快速流过柱子，直至柱子内部的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶与筛板完全干燥；
(C)洗脱：用1～5mL pH7.0～9.0的甲醇溶液加入柱子中进行洗脱，过滤、得到洗脱液；
(D)将洗脱液在氮吹仪上吹干，加入5mL纯水复溶，利用液相色谱串联质谱对其进行检测；根据相应的类固醇激素药物标准品的浓度和液相色谱串联质谱的检测结果绘制的标准工作曲线，再根据待测样品的液相色谱串联质谱的检测结果，换算得到待测样品中类固醇激素药物的浓度或含量。
步骤(A)中所述的待测样品为地表水、地下水、生活废水或工业废水；所述pH值调节至5.0；
步骤(B)所述流速为1mL/min。
步骤(D)中所述的液相色谱串联质谱的条件如下：
色谱条件：色谱柱为2.1×100mm，1.9μm的C18柱，流动相A相为1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；
质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提供了一种改性硅胶，即将市售球型硅胶(如选用50μm)浸渍于甲醇溶液中，取出后加入苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液，通过硅胶表面羟基与异硫氰酸酯基自发反应生成异硫酰胺键连的尾链为苯环改性硅胶作为萃取材料。
2、本发明中的改性硅胶可用于萃取纯水、地表水、生活废水环境中的类固醇激素药物；其中，在活化、富集、洗脱的操作皆借助固相萃取柱的形式套用固相萃取装置进行，再收集洗脱液，再用液相色谱串联质谱仪检测。
3、本发明改性硅胶的制备方法简单，且引入新型稳定尾链基团与硅胶相连，提高整体新型硅胶吸附选择性和吸附强度，可以提高该材料对目标化合物的吸附量，同时该材料借用成熟的固相萃取柱的形式使用方便、易控、经济、环保，在环境检测应用中使用有机溶剂量小且操作简单。
4、本发明将萃取相固相萃取柱，在固相萃取柱的萃取环境中改性硅胶所其萃取功能的异硫酰胺结构和苯环，同时目标化合物在水中也为多环结构，因此萃取相与目标化合物通过相似相溶作用结合从而达到将目标化合物富集在萃取相上的目的；接着用解吸液将萃取相所富集到的目标化合物洗脱，然后用液质串联质谱进行检测分析；因此，利用本发明所述的方法对含多环脂肪烃化合物的甾体类固醇激素药物，进行检测分析，萃取的操作体系成熟，萃取相与样品易于分离。
5、本发明中选用硅胶作为固体基质，一方面是硅胶力学性能稳定、结构性能稳定、表面羟基稳定、比表面积大、可与多种结构进行定位反应、价格低，且可以选择硅胶粒径大小来选择合成不同比表面积的改性硅胶，对于存在于不同固液环境下的激素药物都能使用；另一方面是固相萃取柱简单方便操作，与其他萃取形式相比，利用固相萃取柱作为萃取相在水环境中不需要超声手段；此外，尾链是苯环的硅胶是一种利用相似相溶原理的经典萃取吸附原理，可对多种多环脂肪类的目标化合物进行吸附，从而将目标分析物吸附在萃取相上，使得该萃取相能快速萃取水环境中的类固醇激素药物。
附图说明
图1是实施例1无改性球型硅胶和改性硅胶的红外光谱图。
图2是实施例1异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶对目标化合物(表雄酮、孕酮、乙酸甲地孕酮)的吸附情况图，1390cm-1处出现C-N峰，在663cm-1、713cm-1处均为苯环上的C＝C峰，1446～1566cm-1之间出现多重峰均为苯环的C＝C峰。
图3是实施例1、实施例2类固醇激素药物孕酮色谱图。
图4是实施例1、实施例2类固醇激素药物乙酸甲地孕酮色谱图。
图5是实施例1、实施例3类固醇激素药物表雄酮色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中所涉及的无改性球型硅胶为市售硅胶，粒径为40～60μm。
实施例1
以粒径为50μm的无改性球型硅胶为市售硅胶为基质，制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶：
(1)硅胶预处理
将2g的50μm无改性球型硅胶为市售硅胶浸泡于甲醇溶液中活化1.5h，得到预处理后的硅胶；
(2)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶
取5mL苯甲酰基异硫氰酸酯加入至45mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中配置成体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液，将步骤(1)中得到的预处理后的硅胶放置100mL单口圆底烧瓶，加入到体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，在温度为50℃的环境中搅拌反应24小时，得到改性硅胶；(步骤(1)所述无改性球型硅胶和步骤(2)所述改性硅胶的红外光谱图如图1所示)
(3)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶后处理
将步骤(2)中得到的改性硅胶悬浮液，倒出上清溶液，留下深棕色粘稠性液体，加入10mL丙酮洗涤，将所有溶液与固体倒入50mL离心管内，放入冷冻离心机中设置参数为4000rpm离心5min，温度10℃，倒出上清液，继续加入10mL丙酮洗涤后，再放入冷冻离心机中以4000rpm的参数离心5min，反复5次直至硅胶洗涤干净或洗涤至无色。最后将其置于40℃的真空烘干箱内烘干30min，得到异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料。
(4)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱
将步骤(3)中得到的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料选取100mg，以筛板1(孔径为20μm)、填料、筛板2(孔径为20μm)的顺序依次装入6mL的固相萃取空柱中，用压片机采用1Mpa的压力将三者压至底部得到改性硅胶固相萃取柱。
(5)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对类固醇激素药物的吸附量
测定步骤(4)中制备的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对类固醇激素药物(表雄酮、孕酮、乙酸甲地孕酮)的吸附量，如图3所示为类固醇激素药物孕酮色谱图，如图4所示为类固醇激素药物乙酸甲地孕酮色谱图，如图5所示为类固醇激素药物表雄酮色谱图。
具体步骤如下：
①标准品的配制，用甲醇(色谱纯)为溶剂，配制孕酮和乙酸甲地孕酮100mg/L储备液并置于4℃保存；然后配制混合标准溶液(孕酮和乙酸甲地孕酮的质量比为1:1)，浓度依次为10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，用液相色谱串联质谱LC-MS/MS进行检测分析，根据其响应强度和浓度绘制标准工作曲线。Y为响应强度，X为浓度，标准品与待测样采用相同的检测条件。
标准工作曲线方程分别为：
表雄酮：Y＝4126.69X+0
孕酮：Y＝23262.0X+0
乙酸甲地孕酮：Y＝110923X+0
②固相萃取
1.样品制备：将1L的环境水样用滤纸过滤除去水中的悬浮物，接着用纯盐酸调节pH5.0，得到液相样品；
2.活化：将上述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱套用在固相萃取装置当中依次用甲醇、pH5.0的去离子水和去离子水润洗使其活化；
3.萃取：然后将步骤1得到的液相样品加入到步骤2活化后的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱中，以1mL/min的流速富集浓缩目标物，再将异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱用抽真空泵以负压的形式将空气从柱子上部快速流过柱子，直至柱子内部填料与筛板全部吹干；
4.洗脱：用1～5mL的pH7.0～9.0甲醇溶液加入柱子中进行洗脱，过滤、得到洗脱液；
5.复溶：将洗脱液在氮吹仪上吹干，加入5mL纯水复溶；
6.利用液质串联质谱(LC-MS/MS)进行检测，吸附量＝(初始浓度-萃取后浓度)×溶液体积/固相萃取材料含量。
上述步骤①和步骤6中的LC-MS/MS检测条件如下：
液相：SHIMADZU 20ADXR液相色谱仪，色谱柱为C18柱(2.1×100mm，1.9μm)，流动相A相为1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；
质谱：SHIMADZU LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶对类固醇激素药物的吸附量结果如表1所示。
表1改性硅胶对类固醇激素药物的吸附量结果(单位：ng·mg-1)
表雄酮 孕酮 乙酸甲地孕酮
硅胶 1022.59 3786.24 4025.63
改性硅胶 6822.21 13766.43 14301.05
另外，实验表明，异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶对目标化合物的吸附率高达99％以上。同时探索了该材料对目标化合物的吸附量，由图2可知随着加标浓度增加，吸附量也在增加，当浓度到达300ppb时，该材料对三种目标化合物的吸附达到饱和。
实施例2
以粒径为50μm的无改性球型硅胶为市售硅胶为基质，制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶：
(1)硅胶预处理
将2g的50μm无改性球型硅胶为市售硅胶浸泡于甲醇溶液中活化1.5h，得到预处理后的硅胶；
(2)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶
取5mL苯甲酰基异硫氰酸酯加入至45mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中配置成体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液，将步骤(1)中得到的活化后的硅胶放置100mL单口圆底烧瓶，加入到体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，在温度为50℃的环境中搅拌反应24小时，得到改性硅胶；
(3)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶后处理
将步骤(2)中得到的改性硅胶悬浮液，倒出上清溶液，留下深棕色粘稠性液体，加入10mL丙酮洗涤，将所有溶液与固体倒入50mL离心管内，放入冷冻离心机中设置参数为4000rpm离心5min，温度10℃，倒出上清液，继续加入10mL丙酮洗涤后，再放入冷冻离心机中以4000rpm的参数离心5min，反复5次直至新型硅胶洗涤干净或无色。最后将其置于50℃的真空烘干箱内烘干30min，得到异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料。
(4)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱
将步骤(3)中得到的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料选取100mg，以筛板1(孔径为20μm)、填料、筛板2(孔径为20μm)的顺序依次装入6ml的固相萃取空柱中，用压片机采用1Mpa的压力或用手压将三者压至底部得到改性硅胶固相萃取柱。
(5)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对孕酮和乙酸甲地孕酮的吸附情况
测定步骤(4)中制备的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对孕酮和乙酸甲地孕酮的吸附情况，如图3所示为类固醇激素药物孕酮色谱图，如图4所示为类固醇激素药物乙酸甲地孕酮色谱图。
具体步骤如下：
①标准品的配制，用甲醇(色谱纯)为溶剂，配制孕酮和乙酸甲地孕酮100mg/L储备液并置于4℃保存；然后配制混合标准溶液(孕酮和乙酸甲地孕酮的质量比为1:1)，浓度依次为10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，用LC-MS/MS进行检测分析，根据其响应强度和浓度绘制标准工作曲线。Y为响应强度，X为浓度，标准品与待测样采用相同的检测条件。
标准工作曲线方程分别为：
孕酮：Y＝23056.8X+0
乙酸甲地孕酮：Y＝109971X+0
②固相萃取
1.样品制备：将1L的环境水样用滤纸过滤除去水中的悬浮物，接着用稀盐酸调节pH5.0，得到液相样品；
2.活化：将上述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱套用在固相萃取装置当中依次用甲醇、pH5.0的水和去离子水润洗使其活化；
3.萃取：然后将步骤1得到的液相样品加入到步骤2活化后的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱中，以1mL/min的流速富集浓缩目标物，再将异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱用抽真空泵以负压的形式将空气从柱子上部快速流过柱子，直至柱子内部填料与筛板全部吹干；
4.洗脱：用1mL的pH7.0～9.0甲醇溶液加入柱子中进行洗脱，过滤、得到洗脱液；
5.复溶：将洗脱液在氮吹仪上吹干，加入5mL纯水复溶；
6.利用液质串联质谱(LC-MS/MS)进行检测，吸附量＝(初始浓度-萃取后浓度)×溶液体积/固相萃取材料含量。
上述步骤①和步骤6中的LC-MS/MS检测条件如下：
液相：SHIMADZU 20ADXR液相色谱仪，色谱柱为C18柱(2.1×100mm，1.9μm)，流动相A相为1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；
质谱：SHIMADZU LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
其他参数见表2，梯度洗脱程序见表3。
(3)结果：目标分析物(表4)的检出限、线性范围及回收率见表5(回收率＝(解吸后浓度×1)/(样品浓度×5)×100％)。
表2目标分析物定性、定量离子和质谱分析参数
表3梯度洗脱程序表
表4目标分析物
表5回收率
实施例3
以粒径为50μm的无改性球型硅胶为市售硅胶为基质，制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶：
(1)硅胶预处理
将2g的50μm无改性球型硅胶为市售硅胶浸泡于甲醇溶液中活化1.5h，得到预处理后的硅胶；
(2)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶
取5mL苯甲酰基异硫氰酸酯加入至45mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中配置成体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液，将步骤(1)中得到的活化后的硅胶放置100ml单口圆底烧瓶，加入到体积分数为10％的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，在温度为60℃的环境中搅拌反应24小时，得到改性硅胶；
(3)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶后处理
将步骤(2)中得到的改性硅胶悬浮液，倒出上清溶液，留下深棕色粘稠性液体，加入10mL丙酮洗涤，将所有溶液与固体倒入50mL离心管内，放入冷冻离心机中设置参数为4000rpm离心5min，温度10℃，倒出上清液，继续加入10mL丙酮洗涤后，再放入冷冻离心机中以4000rpm的参数离心5min，反复5次直至新型硅胶洗涤干净或无色。最后将其置于60℃的真空烘干箱内烘干30min，得到异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料。
(4)制备异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱
将步骤(3)中得到的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取粉末填料选取100mg，以筛板(孔径为20μm)、填料、筛板(孔径为20μm)的顺序依次装入6mL的固相萃取空柱中，用压片机采用1Mpa的压力或用手压将三者压至底部得到改性硅胶固相萃取柱。
(5)异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对表雄酮在生活废水中的吸附率
测定步骤(4)中制备的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱对类固醇激素药物在生活废水中的吸附率，如图5所示为类固醇激素药物表雄酮色谱图。
具体步骤如下：
①标准品的配制，用甲醇(色谱纯)为溶剂，配制表雄酮100mg/L储备液并置于4℃保存；然后配制混合标准溶液，浓度依次为10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，用LC-MS/MS进行检测分析，根据其响应强度和浓度绘制标准工作曲线。Y为响应强度，X为浓度，标准品与待测样采用相同的检测条件。
标准工作曲线方程分别为：
表雄酮：Y＝4100.06X+0
②固相萃取
1.样品制备：将1L的环境水样用滤纸过滤除去水中的悬浮物，接着用稀盐酸调节pH5.0，得到液相样品；
2.活化：将上述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱套用在固相萃取装置当中依次用甲醇、pH5.0的去离子水和去离子水润洗使其活化，；
3.萃取：然后将步骤1得到的液相样品加入到步骤2活化后的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱中，以1mL/min的流速富集浓缩目标物，再将异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶固相萃取柱用抽真空泵以负压的形式将空气从柱子上部快速流过柱子，直至柱子内部填料与筛板全部吹干；
4.洗脱：用1mL的pH9.0甲醇溶液加入柱子中进行洗脱，过滤、得到洗脱液；
5.复溶：将洗脱液在氮吹仪上吹干，加入5mL纯水复溶；
6.利用液质串联质谱(LC-MS/MS)进行检测，吸附量＝(初始浓度-萃取后浓度)×溶液体积/固相萃取材料含量。
上述步骤①和步骤6中的LC-MS/MS检测条件如下：
液相：SHIMADZU 20ADXR液相色谱仪，色谱柱为C18柱(2.1×100mm，1.9μm)，流动相A相为1％甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；
质谱：SHIMADZU LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
其他参数见表6，梯度洗脱程序见表7。
(6)结果分析：对样品进行定性分析和定量检测，并对检测结果进行分析。
本实验先根据步骤(5)中的标准品，按步骤(5)的LC-MS/MS检测条件进样分析，以此绘制标准曲线。再将待测废水样品进样分析，根据绘制的标准曲线计算得到样品中的类固醇激素药物的含量。
目标分析物即类固醇激素药物表雄酮(表8)的色谱如图5所示，目标分析物的检出限、线性范围及回收率(回收率＝(解吸后浓度×1)/(样品浓度×5)×100％)如表9所示。
表6目标分析物定性、定量离子和质谱分析参数
表7梯度洗脱程序表
表8目标分析物
表9回收率
生活废水 目标分析物 方法检出限/μg·L-1 R2 线性范围/μg·L-1 回收率/％
实施例3 表雄酮 0.19 0.998 10～500 68.54
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种改性硅胶固相萃取柱在检测类固醇激素药物中的应用，其特征在于：所述的类固醇激素药物为化学结构中是四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核的甾体激素药物；
所述改性硅胶固相萃取柱由异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶制成，所述异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的制备方法包括如下步骤：
（1）称量质量比为1:1～1:3的未改性硅胶与苯甲酰基异硫氰酸酯，将未改性硅胶在室温下浸泡于甲醇溶液中活化1～2h，无需干燥，得到预处理后的硅胶；
（2）将步骤（1）所得预处理后的硅胶加入到体积分数为2%～50%的苯甲酰基异硫氰酸酯的DMF溶液中，在温度为10~100℃的环境中搅拌反应10～48小时，得到改性硅胶溶液；
（3）将步骤（2）中得到的改性硅胶溶液加入丙酮，放入冷冻离心机中设置参数为2000-8000rpm，5~20℃，离心3～10min，倒出上清液，继续加入丙酮洗涤后，再放入冷冻离心机中以2000-8000rpm，5~20℃的参数离心3～10min，反复多次洗涤和离心直至硅胶洗涤干净或洗涤至无色；最后将其置于30～80℃条件下烘干，得到异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的类固醇激素药物为孕酮，乙酸甲地孕酮、表雄酮中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测类固醇激素药物具体包括如下步骤：
（A）样品制备：将待测样品用稀盐酸调节pH值至3.0~7.0，得到液相样品于2~8℃冷藏保存；
（B）活化和萃取：将改性硅胶固相萃取柱套用在固相萃取装置当中，依次用2~5mL甲醇、2~5mL的pH5.0纯水和2~5mL纯水润洗使其活化，然后将步骤（A）中得到的液相样品加入到活化后的改性硅胶固相萃取柱中，以0.2~2mL/min的流速富集浓缩目标物，再将改性硅胶固相萃取柱用抽真空泵以负压的形式将空气从柱子上部快速流过柱子，直至柱子内部的异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶与筛板完全干燥；
（C）洗脱：用1~5mL pH7.0~9.0的甲醇溶液加入柱子中进行洗脱，过滤、得到洗脱液；
（D）将洗脱液在氮吹仪上吹干，加入5mL纯水复溶，利用液相色谱串联质谱对其进行检测；根据相应的类固醇激素药物标准品的浓度和液相色谱串联质谱的检测结果绘制的标准工作曲线，再根据待测样品的液相色谱串联质谱的检测结果，换算得到待测样品中类固醇激素药物的浓度或含量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（A）中所述的待测样品为地表水、地下水、生活废水或工业废水；所述pH值调节至5.0；
步骤（B）所述流速为1mL/min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
步骤（D）中所述的液相色谱串联质谱的条件如下：
色谱条件：色谱柱为2.1×100mm，1.9μm的C18柱，流动相A相为1%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；
质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式和扫描方式分别设置为多反应检测(MRM)和正离子模式；其中雾化气流量、加热气流量和干燥气流量分别为3L/min、10L/min和10L/min；接口温度、脱溶剂温度、DL温度、加热块温度依次为300℃、526℃、250℃和400℃。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
步骤（1）中所述的硅胶为市售净化硅胶，每颗半径为20～100μm；
步骤（1）中所述活化的时间为1.5h；
步骤（2）中所述的甲酰基异硫氰酸酯的DMF溶液的体积分数为10%；
步骤（2）中所述的搅拌反应的时间为24h；
步骤（2）中所述的温度为50℃；
步骤（3）中所述的烘干的温度为60℃；
步骤（3）中所述的烘干的时间30min。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述改性硅胶固相萃取柱按照以下方法制备得到：称取50-500mg异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶，将筛板1、异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶、筛板2的顺序依次装入3mL或者6mL的固相萃取空柱中，筛板1的最小孔径为20μm，筛板2的最小孔径大于异硫氰酰胺苯甲酰基改性硅胶的粒径；且用1～5Mpa的压力或用手压将三者压至底部得到改性硅胶固相萃取柱。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述筛板1、筛板2与固相萃取空柱的半径相同，配套使用；所述压力采用自动压片机实施；所述手压的力度以保证体均匀流过即可。
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