CN110631875B - 一种选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于乙腈中得到提取液;将提取液与包含二氧化钛的材料相接触进行选择性吸附,将吸附后的材料与提取液分离;将材料用体积分数为(4‑10)%氨水‑(90‑96)%乙腈溶剂洗脱,得到磷脂的洗脱液;将洗脱后的材料用体积分数为(2‑10)%甲酸‑(90‑98)%甲醇溶剂洗脱,得到糖鞘脂的洗脱液。本方法发现了在无水低水含量体系中,二氧化钛对磷脂和糖鞘脂更高的分离能力。本方法对两种物质的选择性分离使得无需液相色谱分离,直接质谱就能检测到样品中的糖鞘脂,具有高选择性、低成本、快速等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于质谱的样品预处理方法,具体的是一种选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法。
背景技术
磷脂作为脂质化合物中的一个大类,在细胞生理功能和生物机体的正常运转中发挥着关键作用。许多恶性疾病与磷脂的代谢紊乱及相关代谢酶的活性改变有密切联系,如乳腺癌、子宫内膜、结肠癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。糖鞘脂是一类广泛分布在动物细胞膜表面的糖脂类物质,它在调控细胞识别、黏附、增殖以及凋亡等方面均有重要的生物学作用。
由于糖鞘脂和磷脂在同一质谱区段,且磷脂在组织中的含量高、电离效率高,极大程度的抑制了糖鞘脂的电离,使糖鞘脂的质谱检测,特别是直接质谱检测难度加大。
传统检测方法,从组织或细胞样本中进行糖鞘脂的提取后,可以分为使用正相色谱柱或反相色谱柱进行分离再联用质谱进行检测两条途径。在正相色谱柱分析中,提取糖鞘脂样品需将样品细胞或组织在一定比例的氯仿、甲醇、水,或者一定比例的异丙醇、己烷、水中进行超声破碎释放粗脂类,再在弱碱环境下进行皂化反应以除去甘油糖脂对结果的影响,进而使用氯仿、甲醇或Folch法提取分离糖鞘脂,最后进行LC-ESI-MS/MS研究。而对于反相色谱LC-ESI-MS/MS的研究途径,则需要通过亲水-亲脂平衡固相萃取柱(HLB)富集,使用丙酮-甲醇溶剂洗脱,再进行反相色谱柱进行LC-ESI-MS/MS研究。上述操作比较繁复。
目前鲜有报道能利用二氧化钛将磷脂类和糖鞘脂类有效选择性分离富集的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种步骤少、效率高的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法。
为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案为:
一种选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,包括下述的步骤:
S1.将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于乙腈中得到提取液;
S2.将S1得到的提取液与包含二氧化钛的材料相接触进行选择性吸附,将吸附后的材料与提取液分离;
S3.将S2得到的材料用体积分数为(4-10)%氨水-(90-96)%乙腈溶剂洗脱,得到磷脂的洗脱液;
S4.将经S3洗脱后的材料用体积分数为(2-10)%甲酸-(90-98)%甲醇溶剂洗脱,得到糖鞘脂的洗脱液。
进一步的,S3洗脱后的材料用乙腈洗涤后再用甲酸-甲醇溶剂洗脱。
进一步的,S3用6%氨水-94%乙腈溶剂洗脱。
进一步的,S4用5%甲酸-95%甲醇溶剂洗脱。
进一步的,所述氨水的氨含量为28wt%。
进一步的,所述包含二氧化钛的材料为二氧化钛、或包覆于其他材料的表面的二氧化钛、或含二氧化钛的涂层板。
进一步的,吸附-洗脱的形式包括SPE小柱固相萃取、SPME涂层纤维固相微萃取、固体颗粒分散固相萃取、萃取板或萃取薄膜搅拌萃取或萃取板印迹-微液结点解析。
进一步的,采用微液节点技术,包括下述步骤:
S1.将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于乙腈中得到样品液;
S2.将S1得到的样品液滴加在含二氧化钛的涂层板上;
S3.使用毛细管探针在含二氧化钛的涂层板表面进行萃取,然后将收集的提取物注入质谱进行检测,注射泵先泵入氨水-乙腈溶剂,将磷脂解析下来,而后泵入甲酸-甲醇溶剂,将糖鞘脂解析下来。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
为了分离磷脂和糖鞘脂,使它们在液相色谱质谱检测中分别具有最高灵敏度,或者无需色谱分离可直接对同一样品进行磷脂和糖鞘脂的质谱检测,本发明人试验了多种萃取材料和复合洗脱溶剂,最终选择了效果最佳的二氧化钛。二氧化钛对磷脂与糖鞘脂均有特异性吸附,所以对洗脱溶液的组成调控成为分离二者的关键。我们发现了在无水溶剂中或低水溶剂中洗脱二氧化钛上的两种脂质具有对两种脂质最高的分离能力。磷脂在二氧化钛的作用下已经完全和糖鞘脂分开,不抑制糖鞘脂的信号。因此,利用不同的精细优化的洗脱液以一定顺序对材料中两类物质进行分别洗脱可以得到对两种物质最高的选择性洗脱和最高的分离度。
总的来说,本发明方法利用二氧化钛材料对复杂生物样品中的磷脂与糖鞘脂进行选择性吸附、富集,然后使用精确优化了的不同洗脱溶剂和洗脱步骤进行磷脂和糖鞘脂的分步洗脱,实现复杂样品中磷脂和糖鞘脂的有效分离和纯化,无需液相色谱分离,直接质谱就能检测到样品中的糖鞘脂。
与目前广泛应用的糖鞘脂检测前处理方法相比,本发明方法体现出高选择性、低成本、快速等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中涉及到的分散固相萃取流程示意图。
图2为实施例1中涉及到优化条件时标准样品在上层清液中回收率的柱状图。(A)为标准品溶于不同水含量溶剂,达到静态萃取平衡后,上层清液中标准品回收率。(B)为标准品溶于不同甲酸含量甲醇溶剂,达到静态萃取平衡后,上层清液中标准品回收率。(C)为标准品溶于不同氨水含量甲醇溶剂,达到静态萃取平衡后,上层清液中标准品回收率。
图3为实施例2中涉及到磷脂和糖鞘脂在洗脱液中回收率的柱状图。(A)各种磷脂标准品与糖鞘脂GlcCer(d18:2/16:0)在6%氨水-94%乙腈(v/v)洗脱液中的回收率,图中数值表示各种磷脂与糖鞘脂回收率的比值。(B)各种磷脂标准品与糖鞘脂GlcCer(d18:2/16:0)在5%甲酸-95%甲醇(v/v)洗脱液中的回收率,图中数值表示糖鞘脂与各种磷脂回收率的比值。
图4为实施例3中涉及到大鼠脑组织提取液使用TiO2包裹SiO2材料分散固相萃取后6%氨水-94%乙腈(v/v)、5%甲酸-95%甲醇(v/v)洗脱液的分析结果。(A-1)5%甲酸-95%甲醇(v/v)洗脱液中糖鞘脂的色谱图,(A-2)大鼠脑组织提取液中糖鞘脂的色谱图,(A-3)浓缩15倍后大鼠脑组织提取液中糖鞘脂的色谱图。(B-1)6%氨水-94%乙腈(v/v)洗脱液中磷脂的色谱图,(B-2)大鼠脑组织提取液中磷脂的色谱图,(B-3)浓缩15倍后大鼠脑组织提取液中磷脂的色谱图。
图5为实施例3中涉及到的大鼠脑组织提取液中检测到的糖鞘脂二级质谱图。
图6为实施例4中涉及到的在线分离检测标准品混合溶液中磷脂和糖鞘脂的质谱分析结果。(A)为未处理的标准品混合溶液质谱图。(B)为标准品混合溶液萃取分离后6%氨水-94%乙腈(v/v)洗脱液质谱图。(C)为标准品混合溶液萃取分离后5%甲酸-95%甲醇(v/v)洗脱液质谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
在本发明一个具体实施例中,如图1所示,将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于纯乙腈溶剂中得到提取液,将提取液与二氧化钛材料相接触进行选择性吸附,将吸附后的材料与提取液分离,然后用6%氨水-94%乙腈(v/v)溶剂洗脱(第一步洗脱),得到纯磷脂的洗脱液;第一步洗脱后的二氧化钛用乙腈洗涤,洗去上一步操作时残余在材料上的氨水避免氨水对下一步洗脱的影响,再用5%甲酸-95%甲醇(v/v)溶剂洗脱,得到纯的糖鞘脂洗脱液。最终达到分步洗脱分离磷脂和糖鞘脂的目的。
上述洗脱剂所用氨水的氨含量为28wt%。
上述过程中不宜颠倒洗脱顺序。先使用氨水-乙腈溶剂进行洗脱,磷脂能选择性的分配到溶液相中,而GC仍然能全部富集到材料上。若先使用甲酸-甲醇溶剂进行洗脱会洗下来糖鞘脂的同时将磷脂带下来(如图2(A)中5%甲酸-95%甲醇洗脱液中磷脂和糖鞘脂标样的回收率所示),达不到将两者完全分离的目的。
当洗脱溶剂中含有水时(如图2(A)中各含水洗脱液的回收率所示),洗脱溶剂对糖鞘脂和磷脂的洗脱没有选择性,二者均会被洗脱下来,同样不能达到将二者分离的目的。
上述复杂生物样品可以是生物组织提取液、血浆、尿液、粪便等任何复杂生物样品。样品可通过液液萃取、固相萃取、直接稀释或氮吹复溶的方式溶解于乙腈环境中。
上述的二氧化钛材料,可以是各种形式的二氧化钛,如纳米颗粒、纤维、薄膜、微球、粉末、涂层等等。二氧化钛可包覆于其他材料的表面,如二氧化钛包裹二氧化硅材料,也可以是二氧化钛溶胶喷附在玻璃板或石英板上形成二氧化钛涂层。
上述与二氧化钛材料接触实现吸附-脱附的形式有多种选择,如SPE小柱固相萃取、SPME涂层纤维固相微萃取、固体颗粒分散固相萃取、萃取板或萃取薄膜搅拌萃取、萃取板印迹-微液结点解析等。
实施例中TiO2涂层板及TiO2包裹SiO2涂层板的制备,包括下述的步骤:
(1)石英板活化:采用1mol/L NaOH溶液浸泡超声石英板1h,洗涤数次至水呈中性。
(2)多孔硅胶的处理:多孔硅胶依次用蒸馏水、0.5%甲酸-水、蒸馏水和乙醇进行洗涤。然后将材料置于十二烷基硫酸钠(SDS)-水溶液中进行搅拌吸附。最后采用蒸馏水洗涤材料3次以除去表面多余的SDS。
(3)TiO2溶胶制备:配置水解液:0.1mol/L醋酸、1%水-99%甲醇(v/v)溶液。配置前驱液,钛酸四丁酯(1.7mL)、甲醇(3.3mL)、醋酸(60μL)。冰浴条件下搅拌,将5mL水解液缓慢滴加加入前驱液中,冰浴搅拌4h。取2mL上述TiO2溶胶加入到38mL甲醇中,混合均匀。
(4)TiO2包裹SiO2悬浊液制备:配置水解液:0.1mol/L醋酸、1%水-99%甲醇(v/v)溶液。配置前驱液,钛酸四丁酯(1.7mL)、甲醇(3.3mL)、醋酸(60μL)。冰浴条件下搅拌,将5mL水解液缓慢滴加加入前驱液中,冰浴搅拌1h。加入0.2g处理后的多孔硅胶,冰浴搅拌3h。取2mL上述TiO2包裹SiO2悬浊液加入到38mL甲醇中,混合均匀。
(5)涂层板制备:使用喷枪将稀释后的TiO2溶胶或TiO2包裹SiO2悬浊液(8ml)喷涂在活化后的石英板上。气压为0.15Mpa,距离为10cm。喷涂完成后,用甲醇清洗三遍。
实施例中TiO2包裹SiO2粉末材料的制备:配置前驱液,钛酸四丁酯(1.7mL)、甲醇(3.3mL)、醋酸(60μL)。冰浴条件下搅拌,将5mL水解液缓慢滴加加入前驱液中,冰浴搅拌1h。加入0.2g处理后的多孔硅胶,冰浴搅拌3h。悬浊液离心,去除上层清液,得到的复合微球经甲醇清洗3次后,置于烘箱中60℃干燥8h。
实施例中标准品溶剂制备:将磷脂混合标样主要包括PC(16:0/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:3/18:2)(色谱级,99.0%-99.9%),糖鞘脂glucosylceramide(d18:2/16:0)
(GlcCer(d18:2/16:0),98%),溶于乙腈中配成1μg/mL。储存于-20℃备用。
实施例中大鼠脑组织传统提取脂类步骤:使用冰冻切片机切取大鼠脑海马体区域组织(6mm×6.5mm×20μm),置于2mL离心管中,加入1440μL乙腈溶剂(0.54mg组织/mL乙腈),冰浴超声40min破碎释放脂类,4℃下16000r离心10min,取上层清液储存于-20℃待用。
实施例中分散固相萃取过程:将2mg商品二氧化钛纳米颗粒或TiO2包裹SiO2粉末材料加入300μL标准品混合溶液或组织提取溶液中,涡旋30分钟后,4℃下16000r离心5分钟去除上层清液。向吸附后的材料中加入1mL 6%氨水-94%乙腈(v/v)溶剂,涡旋45分钟后,4℃下16000r离心5分钟取上层清液(洗脱液1)浓缩至20μL进行LC-MS分析。重复上述步骤,将材料上残余的磷脂洗脱。向第一步洗脱后的材料中加入150μL乙腈溶液,涡旋3分钟后,4℃下16000r离心5分钟除去上层清液,重复两次。向乙腈洗涤后的材料中加入300μL 5%甲酸-95%甲醇(v/v)溶剂,涡旋45分钟后,4℃下16000r离心5分钟取上层清液(洗脱液2)浓缩至20μL进行LC-MS分析。
实施例中微液节点萃取过程:微液节点表面采样基本操作原理类似于微液滴萃取,萃取探针由两个同轴的毛细管组成(外毛细管尺寸251μm I.D./356μm O.D.,内毛细管尺寸100μm I.D./163μm O.D.),显微摄像机实时监测探头位置,萃取液用注射泵进行持续输送,其流速为5μL/min。并使用隔膜泵、真空控制箱为体系提供准确的真空度,使微液节点形成稳定液柱。使用带有10μL定量环的六通阀收集样品。
将标准品混合溶液滴加在涂层板上,并做好标记,然后将涂层板放置在滑台的水平面上,且通过软件调整平台X、Y轴位置,使毛细管探针移至标记处进行萃取,探针-表面距离固定为50μm。在每个点提取2min 31s后,切换六通阀(A位至B位),从而将在环中收集的提取物注入质谱进行检测。注射泵先泵6%氨水-94%乙腈(v/v)溶剂,将磷脂解析下来;而后泵5%甲酸-95%甲醇(v/v)溶剂,将糖鞘脂解析下来。
实施例中液相色谱分析条件:自动进样器温度设置4℃,进样量3μL。超高效液相色谱柱为ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×50mm,1.7μm,Waters Corporation,USA),柱温40℃,梯度洗脱程序为95%B,0.01–1.0min,95–0%B,1.0–4min,0%B,4.0–12min(检测洗脱液1时为4-18min);流速0.4mL/min,0-6min,0.6mL/min,6-12min(检测洗脱液1时为6-18min)。检测洗脱液2时使用的流动相:水相B为0.1%甲酸-纯水(v/v)溶液,有机相A为0.1%甲酸-乙腈(v/v)溶液;检测洗脱液1时使用的流动相:水相B为90%纯水-10%50mM醋酸铵缓冲盐(v/v)溶液,pH=4。有机相A为90%乙腈-10%50mM醋酸铵缓冲盐(v/v)溶液,pH=4。
实施例中质谱分析条件:CDL温度200℃,加热块温度200℃,雾化气体(N2)流量1.5L/min,干燥气体(N2)压力100kPa,离子阱压力1.8×10-5kPa,离子累积时间为56ms。检测器电压1.62kV。RP真空度85.0–92.0Pa,IT真空度1.8×10-2Pa,TOF真空度1.3×10-4Pa。MS在全扫描和自动多级碎片扫描模式下进行,m/z范围为100–1000。
以下通过实施例对本发明做进一步的介绍。
实施例1:标准样品中上样洗脱条件优化
将磷脂混合标样主要包括PC(16:0/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:3/18:2)(色谱级,99.0%-99.9%),糖鞘脂glucosylceramide(d18:2/16:0)(GlcCer(d18:2/16:0),98%),配成混合溶液1μg/mL。不同溶剂环境下,经过TiO2纳米颗粒分散固相萃取后对上层清液进行分析。结果如图2(A)所示,纯乙腈条件下上样效率最高,在样品相中的回收率为0,说明标准品全部被富集到了材料上。而当样品溶剂环境中含有水时,溶液中磷脂和糖鞘脂的含量都急剧增加,说明被富集到材料中的分析物急剧下降。故选择纯乙腈为上样溶液。另外,当纯乙腈中含有氨水时,磷脂能选择性的分配到溶液相中,而GC仍然能全部富集到材料上。由此可知,含有氨水的纯乙腈可以用来选择性的洗脱磷脂但仍然使糖鞘脂保留在材料上。而当纯乙腈中含有甲酸时,磷脂和糖鞘脂都不能分配到溶液中,只有当溶剂换为甲醇时,甲酸-甲醇溶液可以选择性的将糖鞘脂分配到溶液相中,而使大部分的磷脂仍保留在材料中。从图2(C)中可知,氨水含量为4%、6%、8%时,磷脂在溶液中均有较高的回收率,但氨水含量为6%时,各种磷脂回收率均可达到80%以上,故选6%氨水-94%乙腈为洗脱磷脂的最优条件。从图2(B)可知,甲酸含量为2%、5%、8%时,糖鞘脂均有高达90%的回收率,但在5%甲酸-95%甲醇条件下,糖鞘脂回收率高的同时磷脂相对其他条件回收率最低,故选择5%甲酸-95%甲醇为洗脱糖鞘脂的最优条件。说明在6%氨水-94%乙腈,5%甲酸-95%甲醇洗脱条件下,TiO2粉末能对磷脂和糖鞘脂进行较好的分离。
实施例2:TiO2包裹SiO2粉末材料对磷脂和糖鞘脂标准品的分离
配制磷脂及糖鞘脂的混合标准品溶液(1μL/mL),利用TiO2包裹SiO2材料对样品进行分散固相萃取,对6%氨水-乙腈洗脱液,5%甲酸-甲醇洗脱液进行LC-MS分析。结果如图3所示。从图3(A)可知,6%氨水-乙腈洗脱液中PC(16:0/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:3/18:2)的回收率均达到了50%以上,GlcCer(d18:2/16:0)(M+Na)的回收率仅为1.6%、没有检测到GlcCer(d18:2/16:0)(M+H)。该洗脱液中各磷脂回收率比糖鞘脂的高了33倍以上。从图3(B)可知,5%甲酸-甲醇洗脱液中GlcCer(d18:2/16:0)的回收率达到了45%以上,磷脂PC(16:0/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:3/18:2)的回收率均低于3%。GlcCer(d18:2/16:0)的回收率比PC(16:0/18:2)高15倍,比PC(16:0/18:1)、PC(18:3/18:2)高40倍以上。经过萃取后,磷脂和糖鞘脂达到了较好的分离。结合实施例1,说明种不同制备方法得到的材料对于磷脂和糖鞘脂均有明显的萃取分离效果。说明了本发明对于各类材料的普适性。
实施例3:利用TiO2包裹SiO2材料分离大鼠脑组织提取液中的磷脂和糖鞘脂并分别进行高效液相色谱-质谱检测
用有机溶剂提取组织中脂类物质溶于乙腈中,提取液直接进行LC-MS分析,提取液浓缩15倍后进行LC-MS分析,提取液用TiO2包裹SiO2材料对样品进行分散固相萃取,对6%氨水-94%乙腈洗脱液,5%甲酸-95%甲醇洗脱液进行LC-MS分析。如图4(A-2)所示,直接进行LC-MS分析的组织提取液,由于大量磷脂的干扰,其糖鞘脂的响应很低(信噪比为27-893),仅能检测出5种糖鞘脂。如图4(A-3)所示,浓缩后的组织提取液其糖鞘脂的色谱图有很严重的峰展宽,磷脂的干扰更为显著。如图4(A-1)所示,经过二氧化钛的选择性萃取后,在实际脑组织样中检测到了7种糖鞘脂,且信号的信噪比在708-2160之间。总体来说糖鞘脂的灵敏度增加了2-45倍。图4(B-1)为6%氨水-94%乙腈(v/v)洗脱液中磷脂的色谱图,图4(B-3)为浓缩15倍后大鼠脑组织提取液中磷脂的色谱图,二者中对应相同磷脂的响应强度是相近的,说明洗脱过程对磷脂的检测没有大的影响,图4(B-2)为大鼠脑组织提取液中磷脂的色谱图。糖鞘脂的MS/MS结果如图5所示。
实施例4:微液节点表面采样方法在线分离磷脂和糖鞘脂并分别进行直接质谱检测
配制标准品混合溶液(1μL/mL),滴加在TiO2包裹SiO2涂层板上。利用微液节点表面采样体系-质谱进行分析。注射泵以5μL/min流速推送6%氨水-94%乙腈(v/v)溶剂,解析磷脂,推送5%甲酸-95%甲醇(v/v)溶剂,解析糖鞘脂。2min 31s后切阀,通过液相泵将定量环中溶液直接推入质谱进行分析。标准品混合溶液及洗脱液质谱图如图6所示。标准品混合溶液直接进质谱检测,即使在糖鞘脂和磷脂含量相同的条件下,仍无法测得糖鞘脂信号。而利用二氧化钛选择性吸附并分步洗脱之后,在6%氨水-94%乙腈洗脱液中仅测到磷脂信号,在5%甲酸-95%甲醇洗脱液中仅测到糖鞘脂。且洗脱液的质谱图与标准品混合溶液相比,干扰信号更少。很好的说明了方法可以实现选择性分离糖鞘脂和磷脂,且对于糖鞘脂的直接质谱检测至关重要。
上述只是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上的限制。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰,均应落在本发明技术方案保护的范围内。
Claims (7)
1.一种选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,包括下述的步骤:
S1. 将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于乙腈中得到提取液;
S2. 将S1得到的提取液与包含二氧化钛的材料相接触进行选择性吸附,将吸附后的材料与提取液分离;
S3. 将S2得到的材料用体积分数为4~10%氨水-90~96%乙腈溶剂洗脱,得到磷脂的洗脱液;
S4. 将S3洗脱后的材料用乙腈洗涤后,用体积分数为2~10%甲酸-90~98%甲醇溶剂洗脱,得到糖鞘脂的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,S3用6%氨水-94%乙腈溶剂洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,S4用5%甲酸-95%甲醇溶剂洗脱。
4.根据权利要求1或2所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,所述氨水的氨含量为28wt%。
5.根据权利要求1或2所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,所述包含二氧化钛的材料为二氧化钛、或包覆于其他材料的表面的二氧化钛、或含二氧化钛的涂层板。
6.根据权利要求1或2所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,吸附-洗脱的形式包括SPE小柱固相萃取、SPME涂层纤维固相微萃取、固体颗粒分散固相萃取、萃取板或萃取薄膜搅拌萃取或萃取板印迹-微液结点解析。
7.根据权利要求1或2所述的选择性吸附并分步洗脱磷脂和糖鞘脂的方法,其特征在于,采用微液节点技术,包括下述步骤:
S1. 将含磷脂和糖鞘脂的复杂生物样品溶解于乙腈中得到样品液;
S2. 将S1得到的样品液滴加在含二氧化钛的涂层板上;
S3. 使用毛细管探针在含二氧化钛的涂层板表面进行萃取,然后将收集的提取物注入质谱进行检测,注射泵先泵入氨水-乙腈溶剂,将磷脂解析下来,而后泵入甲酸-甲醇溶剂,将糖鞘脂解析下来。
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