CN105911131B - 三文鱼中磷脂分子的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三文鱼中磷脂分子的检测方法，包括以下步骤：1)、样品前处理：将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声冰浴提取，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温干燥后，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；2)、富集和净化：先对固相萃取柱进行活化处理；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。采用本发明的方法能实现对三文鱼中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)两大类磷脂的结构鉴定和定量分析。

Description

三文鱼中磷脂分子的检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及三文鱼中磷脂分子的检测方法，具体指一种三文鱼中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)两大类磷脂的结构鉴定和定量分析方法。

背景技术

三文鱼是生长在挪威、美国和加拿大等高纬度地区的鲑科种类，属于冷水性的洄游鱼类。其肉质细嫩，口感鲜美，肉色一般呈红色或橘色，是鱼类中的珍品。三文鱼营养价值极高，富含脂溶性维他命A及D以及水溶性维他命B12及维他命B6，也是-3不饱和脂肪酸的重要来源，其蛋白质含量高，胆固醇和热量含量低，是全世界餐桌上的高档水产品之一。食用三文鱼能有效防治心脑血管疾病，缓解血管炎症和安抚神经功效，还可预防糖尿病等疾病，三文鱼的食用价值和保健价值，已被越来越多的人们所认识。

磷脂是一类含有磷酸的脂类。磷脂结构主要由甘油骨架、极性基团和不同长度和饱和度的脂肪酸链组成。根据磷脂极性基团不同，可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等类别。生物体中存在的磷脂种数以千计，结构多样、种类复杂，具有独特的化学结构。磷脂是维持细胞结构的重要组成部分，也是新陈代谢不可或缺的营养元素。磷脂还具备广泛的生物学功能，诸如活化细胞，维持代谢与荷尔蒙分泌均衡，增强人体免疫力等。实验证明，磷脂可以分解血脂、胆固醇，阻止多余脂肪在血管壁沉积，使血管循环顺畅，被誉为“血管清道夫”。高效的三文鱼中磷脂分子的检测方法将有利于深化三文鱼中磷脂的营养学研究，促进三文鱼为原料的产品开发。

常规磷脂提取方法主要为液液萃取和C18固相萃取，磷脂的特异性吸附较差，导致提取物中含有较多杂质。

传统磷脂检测方法包括高效液相色谱(HPLC)、核磁共振波谱(NMR)、荧光光谱(FLR)等，这些方法分析耗时长、灵敏度低。质谱技术已经成为当前磷脂研究的主流技术手段，基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱法已被证实是一种快速有效的分析手段，每个样品的分析可以控制在几秒钟以内。

建立基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱法，快速分析三文鱼肌肉组织中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺分子种，有利于深化三文鱼营养学认识。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、定性定量能力较强的三文鱼中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种三文鱼中磷脂分子的检测方法，包括以下步骤：

1)、样品前处理：

将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声(探头式超声)冰浴提取(提取时间为10～20分钟)，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；

所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温(≤10℃)干燥后(用氮气进行低温吹干)，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；

有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，三文鱼肉糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入纯水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；

所述有机溶剂Ⅱ为体积浓度≥30％(较佳为≥70％)的甲醇水溶液或甲醇；

2)、富集和净化：

先对固相萃取柱进行活化处理(通过使用有机溶剂水溶液实现活化)；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；

3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的改进：

所述步骤3)为：

将磷脂提取液与DHB基质等体积比混合后的所得物在点样板上点样，于空气中干燥结晶后进行质谱分析；正离子反射模式，加速电压20kV，离子萃取时间延迟450ns，扫描范围为450～1000m/z；质谱数据采集使用4000Series Explorer，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰。

备注说明：同位素校准属于常规方式，例如可由4000Series Explorer这个软件完成的，具体操作为选择Peaks选项，Peak Deisotoping选项，Adduct选择为H。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤1)中，以移取下相溶液后的离心所得物(即，包括上相溶液和固体)替代三文鱼肉糜，以机溶剂Ⅰ中的氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；将所有提取后所得的下相溶液合并后进行后续的干燥和复溶。

备注说明：离心后离心管内溶液上下分层，三文鱼肌肉组织样品则呈饼状居于两相中间。

甲醇、氯仿、水三者在一起的时候不会混溶，会分成上下两相，甲醇极性较强会与水混溶，因此在离心管中，氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相后，实际大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重复提取的时候只需要加入氯仿即可。即，重复提取时氯仿的体积用量＝机溶剂Ⅰ中的氯仿的体积用量。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤1)中超声条件为25kHz。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤2)中，有固相萃取柱填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料；

淋洗液为有机溶剂Ⅲ水溶液或水，有机溶剂Ⅲ水溶液中有机溶剂Ⅲ的体积浓度≤10％，有机溶剂Ⅲ为甲醇、乙腈；

洗脱液为有机溶剂Ⅳ水溶液或有机溶剂Ⅳ，有机溶剂Ⅳ水溶液中有机溶剂Ⅳ的体积浓度≥75％(较佳为≥90％)，有机溶剂Ⅳ为甲醇、乙腈。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤2)中，上样、淋洗和洗脱的流速均为0.2～2mL/min(优选流速为0.6mL/min)。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤3)中，在点样板上的点样量为0.5～1μL。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤1)中，用冷冻离心机离心为：于4℃、8000rpm离心15分钟。

作为本发明的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：

所述步骤1)中，三文鱼肉糜与复溶用的有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/1～2ml。

在本发明中，

步骤1)，将三文鱼去皮、去骨、去内脏后，所得的肌肉组织三文鱼肉。

所述步骤2)中，使用有机溶剂水溶液对固相萃取柱进行活化处理，可使用注射器将有机溶剂水溶液流经填料层，将流出液收集并丢弃，达到固相萃取柱活化与清洗的目的。

固相萃取柱包含空管，上下筛板，筛板中间填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料。本发明所用的二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料可按照发表于《Talanta》的Volume123,June 2014,Pages 233–240，篇名为“Solid-phase extraction approach forphospholipids profiling by titania-coated silica microspheres prior toreversed-phase liquid chromatography–evaporative light scattering detectionand tandem mass spectrometry analysis”的方法进行制备。二氧化钛：二氧化硅质量比为1/10，粒径为50～100um。例如具体为通过热水法合成，3.5g钛酸四丁酯溶解在14mL乙醇中，60℃下密封振荡。加入8g硅胶并搅拌至干，得到的固形物在100℃下熏蒸6小时后得到粗复合物，取1g粗复合物于反应釜中60℃维持5小时，最后将产物于500℃老化5小时，即得到二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料。

在本发明中，步骤1)复溶后过0.22μm的PTFE滤膜。

步骤2)中，脂质粗提物与作为填料的二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料的用量比一般为1ml/1～3g；活化处理时所用的有机溶剂水溶液为：甲醇、50％(体积)甲醇水溶液、乙腈。

该步骤2)具体为包括以下步骤：

A)填料活化：使用有机溶剂水溶液对填料层进行活化处理，使用3mL注射器将有机溶剂水溶液流经填料层，将流出液收集并丢弃，达到固相萃取柱活化与清洗的目的。

B)上样：取3mL注射器抽取适量样品溶液，注入固相萃取柱，目标组分被吸附在填料上，杂质直接随样品溶液流出固相萃取柱并丢弃。

C)淋洗：向固相萃取柱注入3mL淋洗液，目的是为了洗去与目标组分共吸附的杂质。

D)洗脱：向固相萃取柱加入1～3mL洗脱剂，收集洗脱液。

综上所述，本发明采用以二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料为填料的固相萃取柱对三文鱼中的磷脂进行选择性富集，经填料活化、上样、体积浓度≤10％的甲醇或乙腈水溶液淋洗、体积浓度≥75％的甲醇或乙腈水溶液洗脱步骤后，得到纯化的磷脂。本发明样品制备、填料活化、上样、淋洗和洗脱步骤，操作简便、简单易培训、定性定量能力较强、实用性强，适合实验室广泛使用。即，采用本发明的方法能准确获得三文鱼中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)两大类磷脂的含量，也能进行准确的结构鉴定。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1的上、下图分别为正离子模式下磷脂酰胆碱DMPC(14:0/14:0)和磷脂酰乙醇胺DPPE(15:0/15:0)标准品质谱图。上图：4700 Reflector Spec ＃1 MC[BP＝678.4，2741]；下图：4700 Reflector Spec ＃1 MC[BP＝686.4，462]。

图2是三文鱼肌肉组织脂质提取物正离子模式质谱图。图中，4700 ReflectorSpec ＃1 MC[BP＝806.4，1211]。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本发明的范围。

本发明中：

材料与试剂

磷脂酰胆碱DMPC(14:0/14:0)和磷脂酰乙醇胺DPPE(15:0/15:0)标准品：美国Avanti公司；甲醇、乙腈及甲酸：美国Sigma-Aldrich公司，色谱纯；2,5-二羟基苯甲酸(DHB)：美国Sigma-Aldrich公司，质谱级；挪威三文鱼购买自杭州物美超市，新鲜度佳。准确称取DMPC(14:0/14:0)、DPPE(15:0/15:0)标准品各0.01g，用甲醇/氯仿(1:1,v/v)溶解于10mL棕色容量瓶并定容，分别配置成1.0mg/ml的储备液至于4～6℃冷藏备用；称取30mgDHB溶解于70％甲醇水溶液并定容至1mL，备用。

仪器与设备

AB4800串联飞行时间质谱仪：美国Ab Sciex公司产品，配有基质辅助激光解吸离子源(MALDI)、200Hz三倍频Nd:YAG脉冲355nm激光及4000Series Explorer数据处理系统；Milliplus 2150超纯水处理系统：美国Millipore公司产品。

实施例1、一种三文鱼中磷脂分子的检测方法，依次进行以下步骤：

1)、样品前处理

取1.0g三文鱼肉洗净后研磨成糜作为均质后的三文鱼肌肉组织样品放入5mL离心管，加入18mL氯仿/甲醇混合液(1:2，v/v)后震荡混匀。探头式超声(25kHz)冰浴提取10分钟，完毕后向离心管加入12.5mL纯水并震荡混匀。混合物用冷冻离心机(美国ThermoScientific公司)于4℃以8000rpm离心15分钟，离心后离心管内溶液上下分层，三文鱼肌肉组织样品则呈饼状居于两相中间。用移液枪将下相溶液转移到另一个新的移液管，继续向上相和样品中加入6mL氯仿并重复上述操作提取两次。将三次提取的有机相合并，用氮气低温吹干，并用甲醇水溶液(甲醇的体积浓度为70％)1ml复溶；复溶后过0.22μm的PTFE滤膜，得脂质粗提物。

2)、富集和净化

固相萃取柱包含空管，上下筛板，筛板中间的固相萃取柱填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料(100mg)；

SPE柱使用前预先分别用3mL甲醇、50％甲醇水溶液、乙腈进行活化和平衡。用移液枪取脂质粗提物100μL后上样，并以0.6mL/min流速通过柱床。用10％乙腈3ml清洗SPE柱，弃去淋洗液后用90％乙腈1mL进行洗脱，收集洗脱液。

淋洗和洗脱时的流速均为0.6mL/min，所得的洗脱液为磷脂提取液。

3)、质谱检测

分别取100μL磷脂提取液和100μL DHB基质加入到1.5mL的离心管中，振荡混匀后静置；将0.5μL溶液点在MALDI点样板上，于空气中干燥结晶后进行质谱分析。正离子反射模式，加速电压20kV，离子萃取时间延迟450ns，扫描范围为450-1000m/z，激光能量可调整到高于建议阈值的5-10％。质谱数据采集使用4000Series Explorer v3.5.2(美国AB Sciex公司)，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰。

结果如下：

一、分别取6份预处理空白样品(即，磷脂提取液)，添加高中低3个水平的DMPC和DPPE标准溶液，进行方法学验证，每个加标水平下做6次平行，计算方法的日内精密度和回收率，连续测定5天，计算日间精密度。各化合物平均加标回收率在74％到83％之间，相对标准偏差<7％，日内和日间精密度的相对标准偏差≤8.5％。

表1、不同标准品浓度下基质辅助激光解吸质谱磷脂质组学方法的精密度与回收率

二、质谱检测结果如下：

共鉴定出磷脂分子种28种，其中信号最强为m/z 806.40，经鉴定是[PC38:6+H]⁺和[PE38:4+K]⁺的重叠。实验还发现，三文鱼中高不饱和磷脂种类丰富，如m/z 824.38([PC38:8+Na]⁺和[PE42:5+H]⁺)，832.41([PC40:7+H]⁺，[PC38:4+Na]⁺和[PE40:5+H]⁺)等。部分磷脂分子种更是达到了满不饱和度，如[PC42:11+H]⁺，其sn-1和sn-2上两条脂肪酸链分别为二十碳五烯酸链(EPA-)和二十二碳六烯酸链(DHA-)。

定量结果显示m/z 806.40([PC38:6+H]⁺和[PE38:4+K]⁺)的总量占了1/5以上，m/z826.41，852.38，856.40和878.39双链均为EPA或DHA链的磷脂占12.38％。实验结果表明，三文鱼磷脂种类丰富，多不饱和磷脂含量非常高。PC总量为98.2μg/g，PE总量为87.6μg/g。

备注说明：谱图经4000Series Explorer软件process→centroid后，得到各个峰的面积A。基于原理共价化合物在质谱离子化过程中离子化效率取决于其偶极电势，磷脂的偶极电势主要集中在其极性基团，而脂肪酸链的偶极电势可忽略不计，故同类磷脂的离子峰强度只与其浓度有关。已知标准品DMPC(14:0/14:0)的峰面积(A_DMPC)、浓度(C_DMPC)，及峰x的峰面积(A_x)，可计算峰x的浓度(C_x)为：

PC的总量为C＝C₁+C₂+……+C_n

同理根据标准品DPPE可计算各个PE分子的含量与总量。

表2、三文鱼中主要磷脂及其含量

验证实验1、将实施例1所用的三文鱼按照目前常规的液相色谱质谱法进行检测，所得结果为PC总量为101.3μg/g，PE总量为91.2μg/g。

部分的主要磷脂及其含量如表3所示。

表3

其余结果与表2基本无差异。

对比例1、将实施例1步骤2)中的二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料改为C18；重量不变；其余等同于实施例1。

所得结果如下：PC总量为61.9μg/g，PE总量为38.2μg/g。

部分的主要磷脂及其含量如表4所示。

表4

对比例2、将实施例1步骤2)中的淋洗液由“10％乙腈”改成“20％乙腈”。体积量不变；其余等同于实施例1。

所得结果如下：PC总量为51.3μg/g，PE总量为32.2μg/g。

部分的主要磷脂及其含量如表5所示。

表5

对比例3、将实施例1步骤2)中的洗脱液由“90％乙腈”改成“70％乙腈”，体积量不变，其余等同于实施例1。

所得结果如下：PC总量为63.3μg/g，PE总量为43.7μg/g。部分的主要磷脂及其含量如表6所示。

表6

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、样品前处理：

将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声冰浴提取，提取完毕后加入纯水并震荡混匀；

所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温干燥后，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；

有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，三文鱼肉糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入纯水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；

所述有机溶剂Ⅱ为体积浓度≥30％的甲醇水溶液或甲醇；

2)、富集和净化：

先对固相萃取柱进行活化处理；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；

固相萃取柱填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料；

淋洗液为10％乙腈；洗脱液为90％乙腈；

淋洗和洗脱时的流速均为0.6mL/min，3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析；

将磷脂提取液与DHB基质等体积比混合后的所得物在点样板上点样，于空气中干燥结晶后进行质谱分析；正离子反射模式，加速电压20kV，离子萃取时间延迟450ns，扫描范围为450～1000m/z；质谱数据采集使用4000Series Explorer，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰。

2.根据权利要求1所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：

所述步骤1)中，以移取下相溶液后的离心所得物替代三文鱼肉糜，以有机溶剂Ⅰ中的氯仿替代有机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；将所有提取后所得的下相溶液合并后进行后续的干燥和复溶。

3.根据权利要求1或2所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：

所述步骤1)中超声条件为25kHz。

4.根据权利要求1或2所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：

所述步骤3)中，在点样板上的点样量为0.5～1μL。

5.根据权利要求1或2所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：

所述步骤1)中，用冷冻离心机离心为：于4℃、8000rpm离心15分钟。

6.根据权利要求1或2所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：

所述步骤1)中，三文鱼肉糜与复溶用的有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/1～2ml。