CN106645373B - 一种磷脂的精确定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷脂的精确定量分析方法，从每类磷脂均选择若干个磷脂标品配制成混合标准溶液，采用衍生试剂进行轻标记得到内标溶液；待测样品中的磷脂经提取后，采用相应的稳定同位素衍生试剂进行重标记后，平行定量加入内标溶液后进行质谱分析；以所选择的磷脂标品的衍生物质荷比为横坐标，以其摩尔数相同的条件下的相对丰度为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；将待测样品中磷脂轻标记衍生物的质荷比MR代入校准曲线，计算R的相对丰度理论值I，而待测样品中磷脂衍生物的相对丰度测量值为IR，计算其摩尔数为(n)(IR)/I，得到待测样品中磷脂的含量。本发明可随意选择多个商品化的磷脂分子标品作为内标，准确性高，对不同碳链长度和不同双键数的磷脂分子定量误差小。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷脂的精确定量分析方法，属于分析检测领域。
背景技术
磷脂是一类含有磷酸基团的脂质，是脂类化合物的重要组成部分，是构成细胞膜的重要成分，能够对所有生物体的细胞膜结构和功能产生重要影响，并在生物信号传导方面发挥重要作用。磷脂有促进脂类代谢和转运、保证血管通畅及正常肝脏功能的作用，磷脂代谢与许多不同疾病如心血管疾病等密切相关，是重要的信号分子。通过了解磷脂化合物在生物体内的代谢情况，结合磷脂化合物的主要生理功能，进而可对磷脂化合物在生命活动中的作用进行全面深入地研究。
生物质谱技术是目前磷脂类化合物分析的核心工具。目前，鸟枪质谱技术可对脂质进行高灵敏度，高通量的定性分析，但此技术应用于复杂体系磷脂类化合物的定量分析，还存在许多问题。其中一个最主要的原因是进行磷脂分析时，分析的不是单独的某一个磷脂分子，而是复杂生物样品中数以百计的磷脂分子含量的变化。理论上，通过质谱定量任一化合物必须准确的比较它本身的峰强度和其稳定同位素内标化合物的峰强度，或者用该化合物的标准品做校准曲线来实现定量分析。然而，生物样品中磷脂分子不仅数量众多，结构也很复杂，不可能购买到数十个甚至数百个不同的磷脂同位素内标化合物去定量生物样品中数以百计的磷脂组分；且由于商品化的磷脂标准品价格高昂、种类有限，因此通过生物样品中所有磷脂分子的校准曲线来定量显然也十分困难。
而影响磷脂分子在质谱中的响应的因素很多：不同种类的磷脂分子因其自身结构(主要是极性头部)及溶液组成的差异而具有不同的离子化倾向，从而具有不同的质谱响应；即使是同类磷脂，其分子中双键数目及酰基链长不同，导致其在质谱检测中具有不同的离子化效率，从而也会表现出不同的响应。如果在进行基于质谱技术的磷脂定量分析时忽略了不同磷脂分子存在的质谱响应差异，将可能导致较大的定量误差。传统的基于质谱技术的磷脂定量方法，通常在每类磷脂中选择一个或者两个生物样品中不含有的磷脂化合物分子作为内标，来实现对生物样品中这类磷脂的定量分析，但是该方法的局限性在于，由于生物样品中存在的磷脂成分非常多，因此很难买到商品化的生物样品中所不含有的磷脂分子标准品来作为内标，更不用说购买到多个结构不同的生物样品中所不含有的磷脂标准品来作为内标进行精确定量分析了。多数情况下还需要自行合成生物样品中所不含有的磷脂分子来作为内标化合物，非常繁琐和费时。此外，如果受条件限制(需要找到生物样品中所不含有的磷脂分子来作为内标)，每类磷脂只能采用一种内标化合物来进行定量，由于即使是同类磷脂，其分子中双键数目及酰基链长不同，其在质谱检测中也会表现出截然不同的响应，因此会导致较大的定量误差且和磷脂内标的碳数和双键数相差越多，定量结果越不准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足而提供一种磷脂的精确定量分析方法，每类磷脂中可以随意选择多个商品化的磷脂分子作为内标，同时准确性高，对于不同碳链长度和不同双键数的磷脂分子定量误差小。
本发明为解决上述提出的技术问题，所采用的技术方案为：
一种磷脂的精确定量分析方法，包括如下步骤：
1)选取衍生试剂及其相应的稳定同位素衍生试剂；
2)从每类磷脂均选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品，配制成一类或多类磷脂的混合标准溶液，采用步骤1)所述衍生试剂进行轻标记后，得到磷脂标品轻标记衍生物的混合标准溶液，作为内标溶液；
3)待测样品中的磷脂经提取后，采用步骤1)所述相应的稳定同位素衍生试剂发生衍生化反应进行重标记后，平行定量加入步骤2)所得内标溶液，然后进行质谱分析采集质谱图；
4)对于每类磷脂，以步骤2)所选择的每一种磷脂标品轻标记衍生物的质荷比为横坐标，根据质谱图所得每类磷脂标品轻标记衍生物在摩尔数相同的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；
5)待测样品中磷脂所对应轻标记衍生物R的质荷比记为MR，将MR代入该类别磷脂的校准曲线，计算R的质谱相对丰度理论值I；根据质谱图所得待测样品中的磷脂重标记衍生物的相对丰度测量值为IR，计算待测样品中磷脂所对应衍生物的摩尔数nR＝(n)(IR)/I，即为待测样品中磷脂的摩尔数，进一步计算得到待测样品中磷脂的含量。
按上述方案，所述步骤2)中磷脂的混合标准溶液可以为一类或者多类磷脂的混合标准溶液，一般配制一个混合标准溶液即可，如配制成多个混合溶液就要分别进行衍生反应，当然可行，但较为繁琐。磷脂的混合标准溶液中磷脂的类别主要根据目标物来决定，例如如果分析的目标物中只有一类磷脂，那么可以选择这一类磷脂单独做混合标准溶液。
按上述方案，所述磷脂为六大类磷脂，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。
按上述方案，步骤1)中的化学衍生试剂及其相应的稳定同位素标记试剂均能与磷脂分子中的羟基或氨基等活性基团发生反应，从而对磷脂分子分别进行轻标记和重标记，产生物理和化学性质相同但分子量存在差异的磷脂衍生化产物。
按上述方案，所述步骤2)中从选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂时，至少选择一个具有较低碳数及较少双键数的磷脂标准品；至少选择一个具有中等碳数和中等双键数的磷脂标准品；及至少选择一个具有较高碳数和较多双键数的磷脂标准品。其中，所述较低碳数及较少双键数为小于待测样品中的磷脂的最小碳数和双键数；其中，较高碳数及较多双键数为大于待测样品中的磷脂的最大碳数和双键数；中等碳数和中等双键数介于较低碳数及较少双键数、较高数及较多双键数之间。这样能有效保证所得到的校准曲线的质荷比范围能覆盖实际待测样品中待测磷脂的质荷比范围，从而对具有不同质荷比的待测磷脂分子的质谱丰度值进行校正，校准由于碳链长度和不饱和度不同对磷脂定量产生的影响，实现复杂待测样品中存在的数以百计的磷脂化合物的精确定量分析。
按上述方案，所述混合标准溶液优选采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配制。
按上述方案，所述混合标准溶液中各磷脂的浓度优选在0.1-5nmol/mL范围内。
按上述方案，所述步骤3)中待测磷脂提取液优选通过液液萃取方法获得，待测样品为生物组织样品或生物体液样品。
按上述方案，若步骤2)混合标准溶液中，各类别的每种磷脂的摩尔数相同，则步骤4)中直接以步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值为纵坐标；若所述步骤2)混合标准溶液中，各类别的每种磷脂的摩尔数不相同，则步骤4)中需要将其步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值统一换算为摩尔数为n时所对应的相对丰度值，然后步骤4)中以摩尔数均为n的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标。以其中一类磷脂-磷脂酰乙醇胺PE为例，具体说明如下：
若步骤2)中磷脂酰乙醇胺选择标准品PE12:0-12:0，PE16:0-18:1和PE24:1-24:1配制混合标准溶液，进行衍生化反应以轻标记后作为内标，分别记为IS1，IS2和IS3。若IS1，IS2和IS3的摩尔数相同，均为n，质荷比m/z分别为M1，M2和M3，其在步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值分别为I1，I2和I3，则步骤4)中直接以I1，I2和I3为纵坐标，与之相对应的M1，M2和M3建立校准曲线；若IS1，IS2和IS3的摩尔数不同，分别为n1，n2和n3，质荷比m/z分别为M1，M2和M3，步骤3)中所采集质谱图中的相对丰度值分别为I1，I2和I3，则计算摩尔数为n1时，IS2和IS3所对应的相对丰度值分别为I2a和I3a，其中I2a＝I2(n1/n2)，I3a＝I3(n1/n3)，然后以I1，I2a和I3a为纵坐标，与之相对应的M1，M2和M3为横坐标，建立校准曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明能够实现复杂生物样品中存在的数以百计的磷脂化合物的精确定量分析，准确性、重复性良好，解决了传统磷脂质谱定量分析中，由于不同碳链长度和不同双键数的磷脂分子存在不同的质谱响应，从而定量误差较大的问题；
2、本发明提出的精确定量方法，每类磷脂中可以随意选择多个商品化的磷脂分子作为内标，来实现对生物样品中这类磷脂的定量分析，可操作性极强，方便快捷，有效克服了传统方法中需要选择生物样品中所不含有的磷脂分子来作为内标的限制。
附图说明
图1A：通过使用甲醇/氘代甲醇进行酸催化下的氢、氘交换反应实现三甲基硅烷化重氮甲烷对磷脂分子的轻、重标记原理图；
图1B：六类磷脂(磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA))结构图及其与三甲基硅烷化重氮甲烷反应产物结构图；
图2：以丙酮/氘带丙酮为衍生试剂对带氨基基团的磷脂分子(磷脂酰乙醇胺)进行轻、重标记原理图；
图3：磷脂精确定量分析方法步骤流程图；
图4A：甲基化衍生―轻标记、重标记PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1(0.5nmol/mL)质谱图及以甲基化衍生―轻标记PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1(0.5nmol/mL)质荷比为横坐标其质谱相对丰度值为纵坐标的校准曲线；
图4B：采用图4A校准曲线对甲基化衍生―重标记PC15:0-15:0，PC18:1-18:1和PC22:6-22:6(0.5nmol/mL)的相对丰度值进行校正后的质谱图；
图5：高血脂病人和对照组血浆中六类磷脂总量。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中用到的磷脂缩写说明：PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PS，磷脂酰丝氨酸；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；和PA，磷脂酸。磷脂分子结构中甘油骨架上脂肪酰基缩写说明：10:0，癸酸；12:0，月桂酸；14:0，肉豆蔻酸；15:0，十五烷酸；16:1，棕榈油酸；16:0，棕榈酸；18:3，亚麻酸；18:2，亚油酸；18:1，油酸；18:0，硬脂酸；19:0，十九烷酸；20:5，二十碳五烯酸；20:4，花生四烯酸；20:1，二十碳烯酸；20:0，花生酸；22:6，二十二碳六烯酸。
本发明中所涉及到的衍生化反应可以采用：
1)以三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSCHN2)作为衍生试剂，对磷脂分子进行化学衍生，通过使用甲醇/氘代甲醇进行酸催化下的氢、氘交换反应实现磷脂分子的轻、重标记。
三甲基硅烷化重氮甲烷与磷脂反应的原理如图1所示，TMSCHN2对磷脂分子上的羟基、氨基和羧基等基团进行甲基化反应，对于磷脂的重标记通过使用氘代甲醇进行酸催化下的氢、氘交换反应实现。
取100-200μL，0.1nmol-0.5nmol磷脂标准品溶液，加入300μL-600μL甲醇，700μL-1400μL无水乙醚，于10mL离心管中；加入10μL-50μL新鲜配制的1.5nM-5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL-200μL TMSCHN2(2mol/L-4mol/L)使溶液呈黄色；涡旋30s-60s后50℃-100℃水浴反应30min-60min；然后加入6μL-10μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL-2mL甲醇/20mM-40mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中。
对于从待测样品中提取的待测磷脂并用氮气吹干后，加入100-200μL乙腈溶液复溶，通过使用氘代甲醇进行酸催化下的氢、氘交换反应实现TMSCHN2对磷脂分子上的羟基、氨基和羧基等基团进行甲基化的重标记。
加入300μL-600μL氘带甲醇，700μL-1400μL无水乙醚，于10mL离心管中；加入10μL-50μL新鲜配制的1.5nM-5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL-200μL TMSCHN2(2mol/L-4mol/L)使溶液呈黄色；涡旋30s-60s后50℃-100℃水浴反应30min-60min；然后加入6μL-10μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL-2mL甲醇/20mM-40mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中。
2)以丙酮/氘带丙酮作为衍生试剂，可以对带氨基基团的磷脂分子，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸进行化学衍生，实现对带氨基基团的磷脂分子的轻、重标记，如图2所示。
取100μL-200μL，1nmol/mL-5nmol/mL的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸标准品溶液，100μL-200μL d0-丙酮和氰基硼氢化钠，NaBH3CN溶液(0.5μg/uL-2μg/uL)于5mL玻璃管中，30℃-50℃水浴反应30-60min；反应产物用氮气吹干后，溶于1mL-2mL氯仿中，在溶解的反应产物中加入1mL-2mL超纯水，涡旋后静置分层，弃去上层水相，反复5次，以完全去除反应物中的NaBH3CN；氯仿层用氮气吹干后重新溶解于甲醇/20-40mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中。
对于从待测实际样品中提取的待测磷脂氮气吹干后，用100μL-200μL乙腈溶液复溶，加入100μL-200μL d6-丙酮和氰基硼氢化钠，NaBH3CN溶液(0.5μg/uL-2μg/uL)于5mL玻璃管中，30℃-50℃水浴反应30-60min；反应产物用氮气吹干后,溶于1mL-2mL氯仿中，在溶解的反应产物中加入1mL-2mL超纯水，涡旋后静置分层，弃去上层水相，反复5次，以完全去除反应物中的NaBH3CN；氯仿层用氮气吹干后重新溶解于甲醇/20-40mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中。
本发明所述衍生试剂不只限于上述两种，只要能利用磷脂分子中特有的磷酸基，羟基，氨基等基团将磷脂化合物进行衍生化反应，并同时能实现轻/重标记的衍生化方法均可适用于本发明。
本发明所涉及到的质谱分析的条件可以采用如下两种，但不限于此，针对其他对磷脂进行轻/重标记的衍生化方法相对应的质谱分析方法均可使用。
1)以三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSCHN2)作为衍生试剂，对磷脂分子进行化学衍生，通过使用甲醇/氘代甲醇进行酸催化下的氢、氘交换反应，实现磷脂分子的轻、重标记的质谱分析条件为：质谱分析采用直接进样的方式，所用仪器为AB 4000 Qtrap MS/MS系统(Applied Biosystems,USA)，该仪器配有一电喷雾电离源和微量注射泵。离子源和质量分析器的电压参数：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(Collision Energy,CE)；扫描模式采用中性丢失扫描(NLS)或前体离子扫描模式(PIS)，见表1。扫描范围：350-1050m/z，反吹气27psi，离子源电压5400V，加热温度(TEM)540℃，辅助气49psi，进样速度：10μL/min。数据采集和处理采用AB SCIEX Analyst1.5 Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。由于经轻标记和重标记后的磷脂衍生化产物存在质量差，通过上述表1中所示不同的轻标记和重标记的扫描质量数，在质谱分析中能将轻标记的磷脂内标和重标记的待测样品中的磷脂分子分别鉴定出来。
表1对衍生反应(轻标记和重标记)后六类磷脂进行质谱分析的串联质谱参数
2)以丙酮/氘带丙酮作为衍生试剂，对磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸进行化学衍生，实现对带氨基基团的磷脂分子的轻、重标记的质谱分析条件为：质谱分析采用直接进样的方式，所用仪器为AB 4000Qtrap MS/MS系统(Applied Biosystems,USA)，所用离子源为ESI源。扫描方式分别为：未衍生磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸：正离子模式中性丢失扫描质量数分别为141和185Da；d0/d6-丙酮标记磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸：正离子模式双中性丢失扫描质量数分别为183/189和277/283。进样流速为10μL/min，反吹气27psi，离子源电压5400V，加热温度(TEM)540℃，辅助气49psi，去簇电压：117.67eV，碰撞能量：32.5eV。扫描所有谱图均在正离子模式下采集，扫描范围：m/z为400-900。数据采集和处理采用ABSCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。由于经轻标记和重标记后的磷脂衍生化产物存在质量差，通过不同的轻标记和重标记的扫描质量数，在质谱分析中能将轻标记的磷脂内标和重标记的样品中的磷脂分子分别鉴定出来。
下述实施例中质谱分析条件为美国Applied Biosystems公司4000Q-Trap质谱检测器。
实施例1
一种磷脂酰胆碱(PCs)的精确定量分析方法，包括如下步骤：
1)取100μL磷脂酰胆碱标准品溶液(0.5nmol/mL的PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1六种标准品混合溶液混合标准溶液，采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)作为溶剂配制(本实施例以此已知浓度的磷脂标品作为待测溶液，以验证定量方法的准确性)，加入300μL氘带甲醇，700μL无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色；涡旋30s后50℃-水浴反应30min；然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中；
2)取100μL磷脂酰胆碱标准品溶液(浓度均为0.5nmol/mL的PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1标准品混合溶液，混合标准溶液采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配制)，加入300μL甲醇，700μL无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色；涡旋30s后50℃-水浴反应30min，然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中，作为轻标记的内标溶液；
3)取步骤2)所得经过轻标记的内标溶液100μL与步骤1)所得经过重标记后待测溶液混合后直接进样进行质谱分析，质谱分析条件如下：
采用直接进样的方式，所用仪器为AB 4000Qtrap MS/MS系统(AppliedBiosystems,USA)，该仪器配有一电喷雾电离源和微量注射泵：离子源和质量分析器的电压参数：去簇能量(Declustering Potential,DP)：122.5，碎裂能量(Collision Energy,CE)：45.2；扫描模式采用前体离子扫描模式(PIS)，轻标记磷脂酰胆碱分子扫描质量数为198，重标记磷脂酰胆碱分子扫描质量数为200；扫描范围:350-1050m/z，反吹气27psi,离子源电压5400V,加热温度(TEM)540℃,辅助气49psi，进样速度:10μL/min；数据采集和处理采用ABSCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。
4)步骤2)所得经过轻标记的磷脂酰胆碱对应的衍生物的质荷比PC12:0-12:0637.4，PC16:0-18:1 775.6和PC24:1-24:1 979.8为横坐标，直接以步骤3)质谱分析得到的其相对丰度值为纵坐标(每种磷脂的摩尔数相同)，建立校准曲线(如图4A所示)；
5)将步骤1)磷脂酰胆碱标准品溶液中PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1的分子质量数换算成经过轻标记的衍生物质荷比，分别代入步骤4)所得校准曲线中(由于校准曲线是用轻标记的磷脂分子的质荷比和质谱相对丰度做的，因此需要将待测磷脂分子的质量数换算成其相应轻标记的质荷比，再带入校准方程进行计算其相对丰度理论值；此外由于轻标记和重标记后的磷脂分子的质谱相对丰度值是一致的，因此采用校准曲线计算出来的相对丰度理论值同时适用于轻标记和重标记的磷脂分子)，分别计算其相对丰度理论值I(如图4B所示)，然后结合步骤3)中所得重标记磷脂酰胆碱衍生物的相对丰度测量值IR，计算步骤1)磷脂酰胆碱标准品溶液中各磷脂的摩尔数nR＝(n)(IR)/I(其中，n为轻标记的各磷脂标品衍生物的摩尔数，实施例中为0.5nmol/mL)，进一步计算得到步骤1)磷脂酰胆碱标准品溶液中各磷脂的理论含量(见表2)，进而与其实际含量(0.5μM即0.5nmol/mL)相比对，以验证本发明的可行性与准确性，结果如表2所示。
作为比较，表2也给出了采用PC12:0-12:0和PC24:1-24:1两种轻标记的标准品做为内标溶液，以及仅以PC24:1-24:1轻标记的标准品做为内标溶液，分别进行校准，进而计算得到步骤1)磷脂酰胆碱标准品溶液中各磷脂的理论含量，并与其实际含量相比对。
表2定量方法准确性比较和验证
由表2可知，通过一种轻标记的标准品做为内标求得的磷脂酰胆碱计算值与实际值之间的差异较大，且碳数相差越多，定量结果越不准确。这是由于同类磷脂分子的碳链长度和脂肪酰基链的不饱和度都会影响每类磷脂分子的分子质量，而离子化效率和质谱响应受碳链长度和不饱和度的影响较大，因此本发明通过在每类磷脂中选择不同链长和双键数的磷脂标准品轻标记后作为内标，然后以其以质荷比为横坐标，对相对丰度值做校准曲线，一定程度上可校准由于碳链长度和不饱和度对磷脂定量产生的影响。
同时，表2表明，通过一种轻标记的标准品做为内标，较之添加一种内标定量结果的准确性显著提高。而本发明加入三种轻标记的标准品做为内标校准后，大多数理论计算值都与实际值较为符合，能获得较为精确的定量结果，且极大的增加了磷脂定量过程中内标物选择的范围和广度；仅仅对于PC22:6-22:6这种不饱和度过大的PC定量结果仍存在一些偏差，原因是所选择的内标双键数过少，没有涵盖待测PC分子中所含有的最大双键数。
实施例2
一种人血浆中六类磷脂的精确定量分析方法，包括如下步骤：
1)从人血浆样品中提取待检测磷脂；
i)样品准备：取40μL血浆加入900μL含4％甲酸的甲醇溶液于2mL离心管中，涡旋1min后，3000rps离心5min，取上层清液备用；
ii)柱子活化：取1mL HybridSPE柱(sigma-aldrich公司)，加入2mL甲醇活化萃取柱；
iii)上样：将步骤i)中配制的样品转移到固相萃取小柱中，流速控制为<5mL/min；
iv)淋洗：分别用1mL含1％甲酸的甲醇溶液和1mL甲醇淋洗，使固相萃取柱处于酸性环境中；
v)洗脱：先用6mL含5％氨水的甲醇溶液洗脱PC，PE，PS，PG，PI；再用6mL含20％氨水的甲醇溶液洗脱PA；将上述洗脱液用氮气吹干后作为待测样品，置于-80℃冰箱中待衍生化反应；
2)取1)中待测样品，加入100μL乙腈溶液复溶，加入300μL氘带甲醇，700μL L无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μLTMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色，涡旋30s后50℃水浴反应30min；然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中，作为待测溶液；
3)每类磷脂PC、PE、PS、PG、PI和PA中均选择三个不同碳链长度、不同双键数的商品化的磷脂标准品，具体选择PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1；PE12:0-12:0，PE16:0-18:1和PE24:1-24:1；PS12:0-12:0，PS16:0-18:1和PS24:1-24:1；PG12:0-12:0，PG16:0-18:1和PG24:1-24:1；PI12:0-12:0，PI16:0-18:1和PI24:1-24:1；PA12:0-12:0，PA16:0-18:1和PA24:1-24:1，混合后，均混合配制为混合标准溶液，浓度均为0.5nmol/mL，混合标准溶液采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配制；
取100μL 0.5nmol/mL的上述混合标准品溶液，加入300μL甲醇，700μL无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μLTMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色，涡旋30s后50℃水浴反应30min；然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中，作为内标溶液；
4)将步骤3)所得经过轻标记的内标溶液与步骤2)所得经过重标记后待测溶液混合后直接进样进行质谱分析，质谱分析条件如下：
质谱分析采用直接进样的方式，所用仪器为AB 4000Qtrap MS/MS系统(AppliedBiosystems,USA)，该仪器配有一电喷雾电离源和微量注射泵；离子源和质量分析器的电压参数：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(Collision Energy,CE)；扫描模式采用中性丢失扫描(NLS)或前体离子扫描模式(PIS)，见表1；扫描范围:350-1050m/z，反吹气27psi,离子源电压5400V,加热温度(TEM)540℃,辅助气49psi，进样速度：10μL/min；数据采集和处理采用AB SCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)；
5)步骤3)所得经过轻标记的每种磷脂对应的衍生物的质荷比为横坐标，直接以步骤4)质谱分析得到的其相对丰度值为纵坐标(每种磷脂的摩尔数相同)，建立每种类别磷脂的校准曲线；
6)步骤2)待测溶液中各磷脂经过轻标记的衍生物质荷比(如表3所示)分别代入步骤5)所得其对应类别的校准曲线中，分别计算其相对丰度理论值I，然后结合步骤4)中质谱分析所得重标记的磷脂分子衍生物的相对丰度测量值IR，计算步骤2)待测溶液中各磷脂的摩尔数nR＝(n)(IR)/I(其中，n为轻标记的各磷脂衍生物的摩尔数)，进一步计算得到步骤1)血浆中各磷脂的含量。
本实施例中的人血浆样品分别选择高血脂病人的血浆样品和普通正常人的血浆样品作为检测对象，结果如表3所示。
表3高血脂病人和对照组血浆中磷脂分子种类及含量
从磷脂总量上看，与正常对照相比，高血脂病人血浆中PC含量显著升高，PL总量显著升高，而PE，PA和PS的含量均显著降低，PI和PG无显著变化。通过对六类磷脂的不同磷脂分子种类进行分析，共定性定量了血浆中33种PC，25种PE，22种PG，15种PS，17种PI和，18种PA，其中具有显著差异的PLs分子种类有30种。与正常健康对照相比，高血脂病人血浆中有21种PL分子显著下调，9种PL分子显著上调。此外，从磷脂中脂肪酸组成看，高血脂病人血浆中的饱和脂肪酸含量为957.75μM，相比对照组的804.38μM，其含量明显上调；而单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量分别为146.42μM和1454.79μM，较之对照组的289.66μM和1704.09μM，显著下调。
实施例3
为验证磷脂精确定量分析结果的准确度和精密度，将实施例2中所得到的精确定量分析结果与下述高血脂组与对照组的相对定量分析结果进行了比较，包括如下步骤：
1)人血浆中六类磷脂的精确定量步骤同实施例2中的步骤1)至步骤5)；
2)高血脂组与对照组的相对定量分析步骤，包括如下步骤：
(1)分别从人血浆样品(高血脂组与对照组)中提取待检测磷脂，具体方法如下：
i)样品准备：取40μL血浆加入900μL含4％甲酸的甲醇溶液于2mL离心管中，涡旋1min后，3000rps离心5min，取上层清液备用；
ii)柱子活化：取1mL HybridSPE柱(sigma-aldrich公司)，加入2mL甲醇活化萃取柱；
iii)上样：将步骤i)中配制的样品转移到固相萃取小柱中，流速控制为<5mL/min；
iv)淋洗：分别用1mL含1％甲酸的甲醇溶液和1mL甲醇淋洗，使固相萃取柱处于酸性环境中；
v)洗脱：先用6mL含5％氨水的甲醇溶液洗脱PC，PE，PS，PG，PI；再用6mL含20％氨水的甲醇溶液洗脱PA；将上述洗脱液用氮气吹干后置于-80℃冰箱中待衍生化反应；
(2)取(1)中已提取的对照组样品，加入100μL乙腈溶液复溶，加入300μL甲醇，700μL无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色，涡旋30s后50℃水浴反应30min；然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中；
(3)取(1)中已提取的高血脂组样品，加入100μL乙腈溶液复溶，加入300μL氘带甲醇，700μL L无水乙醚，于10mL离心管中；然后加入10μL新鲜配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN2(2mol/L)使溶液呈黄色，涡旋30s后50℃水浴反应30min；然后加入6μL醋酸终止衍生化反应，与此同时，溶液由黄色变为无色；反应产物用氮气吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸铵(90/10,v/v)溶液中；
(4)将步骤(3)得的经过重标记的高血脂组样品，与步骤(2)得到的经过轻标记的对照组样品混合后直接进样进行质谱分析；然后，重标记衍生化高血脂组样本所测得的质谱丰度值与轻标记衍生化对照组样本所测得的质谱丰度值之比即为相对定量分析结果(表4)；
质谱分析条件为：质谱分析采用直接进样的方式，所用仪器为AB 4000 Qtrap MS/MS系统(Applied Biosystems,USA)，该仪器配有一电喷雾电离源和微量注射泵；离子源和质量分析器的电压参数：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(CollisionEnergy,CE)；扫描模式采用中性丢失扫描(NLS)或前体离子扫描模式(PIS)，见表1；扫描范围：350-1050m/z，反吹气27psi，离子源电压5400V，加热温度(TEM)540℃，辅助气49psi，进样速度：10μL/min。数据采集和处理采用AB SCIEX Analyst1.5 Software(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)；
3)将表3中所得到的精确定量结果换算成相对值，即高血脂精确定量值/对照组精确定量值(表4中对应于精确定量结果换算值)，并将换算值与步骤2)中相对定量所得到的检测值(表4中对应于相对定量结果)相比较，如表4所示。
表4高血脂病人和对照组血浆中磷脂分子相对定量结果与精确定量结果换算值比较
由表4可知：精确定量后的高血脂组含量与对照组含量的比值，同相对定量结果大多数都较为一致。虽然无论是精确定量方法还是相对定量方法都存在一些无法避免的误差，但是相较传统的内标法或外标法仍具有较大的优势，因此对生物样本中复杂磷脂类化合物的定量是非常有意义的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)选取衍生试剂及其相应的稳定同位素衍生试剂；
2)从每类磷脂均选择三个或大于三个的不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品，配制成一类或多类磷脂的混合标准溶液，采用步骤1)所述衍生试剂进行轻标记后，得到磷脂标品轻标记衍生物的混合标准溶液，作为内标溶液；
3)待测样品中的磷脂经提取后，采用步骤1)所述相应的稳定同位素衍生试剂发生衍生化反应进行重标记后，平行定量加入步骤2)所得内标溶液，然后进行质谱分析采集质谱图；
4)对于每类磷脂，以步骤2)所选择的每一种磷脂标品轻标记衍生物的质荷比为横坐标，根据质谱分析以每类磷脂标品轻标记衍生物在摩尔数均为n的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；
5)待测样品中磷脂所对应轻标记衍生物的质荷比记为MR，将MR代入该类别磷脂的校准曲线，计算其质谱相对丰度理论值I；根据质谱图所得待测样品中磷脂重标记衍生物的相对丰度测量值为IR，计算待测样品中磷脂所对应衍生物的摩尔数nR＝(n)(IR)/I，即为待测样品中磷脂的摩尔数，进一步计算得到待测样品中磷脂的含量。
2.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述磷脂为六大类磷脂，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酸。
3.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于步骤1)中的化学衍生试剂及其相应的稳定同位素标记试剂均能与磷脂分子中的活性基团发生反应，实现对磷脂分子分别进行轻标记和重标记。
4.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤2)中从每类磷脂选择三个或大于三个的不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品时，至少选择一个具有较低碳数及较少双键数的磷脂标准品，至少选择一个具有中等碳数和中等双键数的磷脂标准品，及至少选择一个具有较高碳数和较多双键数的磷脂标准品；其中，较低碳数及较少双键数为小于待测样品中的磷脂的最小碳数和双键数，较高碳数及较多双键数为大于待测样品中的磷脂的最大碳数和双键数，中等碳数和中等双键数介于较低碳数及较少双键数、较高数及较多双键数之间。
5.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤3)中待测样品中磷脂的提取方法为液液萃取法。
6.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述待测样品为生物组织样品或生物体液样品。
7.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于步骤2)混合标准溶液中，每类磷脂中每一种磷脂的摩尔数相同，步骤4)中直接以步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值为纵坐标。
8.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤2)中混合标准溶液中，每类磷脂中每一种磷脂的摩尔数不完全相同，步骤4)中需要将其步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值统一换算为摩尔数为n时所对应的相对丰度值，然后步骤4)中以摩尔数均为n的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标。
9.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤2)中混合标准溶液中，每类磷脂选择三种进行衍生化反应轻标记后作为内标，分别记为IS1，IS2和IS3，IS1，IS2和IS3的摩尔数均为n，质荷比m/z分别为M1，M2和M3，其在步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值分别为I1，I2和I3，步骤4)中直接以(M1，I1)、(M2，I2)和(M3，I3)三点建立校准曲线。
10.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤2)中混合标准溶液中，每类磷脂选择三种进行衍生化反应轻标记后作为内标，分别记为IS1，IS2和IS3，IS1，IS2和IS3的摩尔数分别为n1，n2和n3，质荷比m/z分别为M1，M2和M3，步骤3)中所采集质谱图中的相对丰度值分别为I1，I2和I3，则计算摩尔数为n1时，IS2和IS3所对应的相对丰度值分别为I2a和I3a，其中I2a＝I2(n1/n2)，I3a＝I3(n1/n3)，然后以(M1，I1)、(M2，I2a)和(M3，I3a)三点建立校准曲线。
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