CN109632938A - 聚多巴胺修饰的银纳米颗粒在质谱分析检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种AgNPs@PDA纳米颗粒及其制备方法以及在质谱分析检测中的应用。所述AgNPs@PDA纳米颗粒由多巴胺在碱性条件下还原AgNO3得到,其形态为球型。本发明扩展了MALDI质谱的应用范围,可以检测生物样本中低丰度的脂质以及代谢小分子;所述AgNPs@PDA纳米颗粒合成条件温和简便,无毒无害,在MALDI质谱测试中操作简单,在分析检测领域有很广阔的应用价值。本发明方法是一种简便高效的提高质谱检测能力的方法,可用于生物体MALDI质谱成像分析等。
Description
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域,具体涉及一种聚多巴胺修饰的银纳米颗粒(AgNPs@PDA)在质谱检测中的应用。
背景技术
基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationMass Spectrometry)简称MALDI质谱,是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationMass Spectrometry Imaging,简称MALDI MSI)是以MALDI为基础的成像技术,也是近年来发展的研究生物组织中成分分布的重要技术,能够对组织样品中内源性代谢小分子等成分及外源性药物分子等组分进行原位成像分析,具有无需标记、灵敏度高等优点。MALDI MSI目前已被广泛用于各类样品的检测分析中,特别是脂类物质的检测。然而,MALDI MSI在分析脂类物质及内源性小分子时面临着很多问题:1、在生物样本中,由于磷脂酰胆碱(PC)含量丰富,对其他低含量内源性小分子及脂质的信号会造成明显的信号抑制,导致其他低含量内源性小分子及脂质信号微弱或不能被检测;2、基质和待测物难以形成均匀的共结晶,产生质谱检测中的“甜点”效应,导致成像结果不够准确及不能重复。3、内源性小分子及脂质分子量范围从100Da到2000Da,在如此宽的质量范围内,如果没有内标进行实时校正,质谱很难给出高准确的质谱数据。
目前,为了解决PC对其它类脂质信号的抑制,有研究工作建议选择负离子模式的条件进行脂质检测(Min,Q.et al.Anal.Chem.2014,86(18),9122-30.);为了形成均一的基质与待测物的共结晶,有研究工作建议使用纳米材料作为基质对组织样品进行解析(Dufresne,M.et.al.Anal.Chem.2016,88(11),6018-6025.);为了解决质谱数据准确度的问题,现在一般在分析样品前,使用标准品通过外标法校准质谱,但是,实验表明该方法无法完全解决这一问题。以上的解决方案解决问题单一,均不够理想。
基质是MALDI MS技术的关键因素,我们发展了一种新的基质,同时克服MALDI MS技术在分析脂质时所面临的上述三个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)的新型基质AgNPs@PDA纳米颗粒。该基质可以同时应用于MALDI的正负离子模式检测,解决低丰度脂质的MALDI质谱分析问题。
本发明所述的AgNPs@PDA纳米颗粒为聚多巴胺修饰的银纳米颗粒,其形态为球形。
所述的AgNPs@PDA纳米颗粒是由多巴胺在碱性条件下还原AgNO3得到的。
具体的制备方法包括下述步骤:将多巴胺溶解在水中,调节pH值至7.0—8.5,然后将AgNO3溶液滴加到上述多巴胺溶液中进行反应。
若直接向多巴胺溶液中加入AgNO3,则容易出现珊瑚状Ag纳米材料,如图1a所示。
上述方法中,所述多巴胺和硝酸银的质量比可为5:1-20:1,如10:1。
所述AgNO3溶液中的溶剂为水。
所述AgNO3溶液中AgNO3的浓度可为0.005g/mL至0.02g/mL之间的任意浓度。
上述方法中,所述pH值可以为7.0—8.5的任一pH值,当pH值在7.8以下(如pH值在7.0—7.8)时,可以控制纳米颗粒为球形。
上述方法中,所述反应的反应时间在10min以上,可为10min-72h,如24h。
上述方法中,所述反应的反应温度可为20-100摄氏度之间任意温度,如60摄氏度。
本发明的再一个目的是提供上述AgNPs@PDA纳米颗粒的应用。
本发明所提供的AgNPs@PDA纳米颗粒的应用包括以下方面:
1、AgNPs@PDA纳米颗粒作为基质辅助激光解吸电离质谱中基质的应用;
2、AgNPs@PDA纳米颗粒作为基质辅助激光解吸电离质谱成像中的基质的应用;
3、AgNPs@PDA纳米颗粒作为基质辅助激光解吸电离质谱校准标准品的应用。
上述应用中,所述基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)中的待测物质的分子量为100-2000Da。
上述应用中,所述基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)中的待测物质可为代谢小分子或者低丰度脂质、脂肪酸类化合物中的任意一种。
所述小分子代谢物具体可选自牛磺酸、葡萄糖、肌酸、肌酸磷酰丝氨酸、磷酸丝氨酸、油酰胺等物质中的至少一种。
所述低丰度脂质具体可选自磷脂酸(PA)、糖基化神经酰胺(HexCer)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、硫苷脂(ST)等物质中的至少一种。
所述脂肪酸类化合物可选自硬脂酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等物质中至少一种。
上述应用中,所述基质辅助激光解吸电离质谱还可用于检测下述体系:细胞组织样本(如鼠脑脂质萃取液)、体液、化学反应混合物等。
上述的应用中,所述基质辅助激光解吸电离质谱还可用于对待测物质进行质谱成像,如待测样品为组织切片时,可将AgNPs@PDA基质分散液喷涂在组织样品表面,然后进行质谱成像分析。
上述的应用中,溶解基质的溶剂原则上与质谱后续分析兼容即可,通常可以是水、甲醇、乙醇或乙腈等,包括它们的互溶体系,具体溶剂可为乙腈/水(80/20,v/v)的混合溶剂;基质溶液的浓度没有限定,可上至饱和溶液,如2mg/mL。
本发明还提供了聚多巴胺修饰的银纳米颗粒(AgNPs@PDA)作为基质辅助激光解吸电离质谱校准标准品的应用。
本发明用易于制备的AgNPs@PDA纳米颗粒在紫外激光(355nm)照射下产生基质效应,解吸电离脂质和代谢小分子样品。该材料具有广泛的光吸收性质,并且由于聚多巴胺对硝酸银也有还原性,在AgNPs@PDA表面可以进一步形成直径5-10nm的AgNPs层,这种双层的纳米颗粒能够协同作用,更好地解吸电离待测物。此外,AgNPs@PDA表面正电荷和PDA的多羟基结构可以和待测物之间形成氢键相互作用和电荷相互作用,增强对含羟基化合物和带负电化合物的解吸电离能力。上述性质使得此种材料具有吸附含羟基化合物和带负电化合物样品的能力并在激光照射条件下完成样品的解吸和离子化,能检测多种不同的小分子和脂质。
本发明制备的AgNPs@PDA纳米颗粒可替代传统的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和9-氨基吖啶(9-AA)等有机小分子基质,获得高分辨的被测物质的分子离子峰,减少了有机小分子基质峰干扰,信噪比高,并且可以在正负离子检测模式下均可被采用。所述AgNPs@PDA纳米颗粒合成条件温和简便,无毒无害,在MALDI MSI测试中操作简单,在分析检测领域有很广阔的应用价值。该方法是一种简便高效的提高质谱检测能力的方法,可用于生物体的MALDI MSI分析等。
附图说明
图1为本发明制备的AgNPs@PDA样品的透射电镜照片。
图2为本发明实施例2使用AgNPs@PDA作为基质对PA(18:0/18:0)进行检测的高分辨质谱图。
图3为本发明实施例3使用AgNPs@PDA和DHB作为基质在正离子模式下对鼠脑匀浆萃取液进行检测的高分辨质谱图。
图4为本发明实施例4使用AgNPs@PDA和9-AA作为基质在负离子模式下对鼠脑匀浆萃取液进行检测的高分辨质谱图。
图5为本发明实施例5使用AgNPs@PDA作为基质检测小鼠鼠脑切片高分辨质谱图。
图6为本发明实施例5使用AgNPs@PDA作为基质检测小鼠鼠脑切片高分辨质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此,凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例所用质谱仪为Bruker公司Solarix 9.4T高分辨质谱仪,氮分子激光,波长355nm;
使用AgNPs@PDA自身的银簇峰校正仪器。
实施例1、制备AgNPs@PDA纳米颗粒
称取0.4g多巴胺溶于盛有25mL水的圆底烧瓶中,调节pH值到7.8。
配制0.01g/mL硝酸银溶液(溶剂为水),缓慢滴加4mL至圆底烧瓶中,60℃反应24小时收集样品,即获得AgNPs@PDA纳米颗粒。若不采用滴加的方式,得到的AgNPs为珊瑚状材料,如图1a所示。
所制备的AgNPs@PDA纳米颗粒的透射电镜图如图1b,1c所示,从图中可以看出,AgNPs@PDA颗粒呈球形,直径在85-110nm之间,聚多巴胺厚度在6.5nm左右,聚多巴胺表面附着3-5nm的AgNPs,能够清晰看到银的晶格线。
AgNPs@PDA纳米颗粒在水和甲醇、乙腈等溶剂中分散性好,能够均匀的铺展于不锈钢靶面,同时也可以通过喷雾的方式均匀地铺展于组织表面,符合作为基质的要求。由于其良好的分散性,能够使用喷涂装置喷涂于组织表面,用于组织成像。
实施例2、使用AgNPs@PDA作为MALDI基质检测PA(18:0/18:0),示例用AgNPs@PDA自身的银簇峰校正仪器。
基质分散液:称取实施例1制备的AgNPs@PDA颗粒2mg溶于1mL乙腈/水(80/20,v/v)中,超声分散20min。
配制浓度为10-3M的磷脂酸PA(18:0/18:0)标准品溶液。
将基质分散液和配制好的标准品溶液按照1:1的体积比混匀,取2μL点于MALDI不锈钢靶面,室温晾干;送入质谱仪进行分析。
质谱条件为:配备有9.4T超导磁体Bruker solariX质谱仪,激光波长355nm,激光能量为75%,激光斑点大小为50μm,脉冲频率150Hz,分辨率在200m/z时为200000。
检测结果如图2所示,从图中可以看出,以AgNPs@PDA作为基质可以很有效的使PA(18:0/18:0)离子化,得到信噪比很好的谱图。
质谱质量轴校准过程:利用Ag的团簇峰:363.74336Da、365.74550Da、404.77042Da、406.77014Da、579.55656Da、581.55660Da、968.15941Da、970.15889Da和972.15590Da与理论值363.74094Da、365.74061Da、404.76749Da、406.76716Da、579.55079Da、581.55046Da、968.14428Da、970.14394Da和972.14360Da进行质量校准,校准前PA(18:0/18:0)钠盐标准品M+Na+质荷比749.51621Da的质量偏差为12ppm,校准后质荷比749.50705Da的质量偏差为0ppm,校准方法可靠。
实施例3、使用AgNPs@PDA作为基质在正离子模式下检测小鼠鼠脑脂质萃取液
基质分散液配制方法参照实施例2。
脂质萃取:配制小鼠鼠脑匀浆液(200mg/mL),取50μL匀浆液加入450μL甲醇,涡旋1min,静置5min,再涡旋1min,置于离心机内离心10min(1000g,4℃)。收集上清,氮气吹干,200μL甲醇重溶。
将基质溶液与重溶的脂质萃取液按照1:1(v/v)进行混合,之后取2μL用移液器点样于MALDI不锈钢靶面,室温晾干,送入质谱仪进行分析。
质谱条件为:配备有9.4T超导磁体Bruker solariX质谱仪,激光波长355nm,激光能量为75%,激光斑点大小为50μm,脉冲频率150Hz,分辨率在200m/z时为200000。
在正离子模式下进行检测,检测结果如图3a所示,可以看出检测的脂质种类多,一些低丰度脂质(PA,HexCer,ST等)能够检测出信号而避免了磷脂酰胆碱(PC)的干扰。
使用传统2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作为基质对小鼠鼠脑脂质萃取液在正离子模式下进行质谱检测,检测结果如图3b所示,可以看出,其检测的主要为PC类物质。
实验结果表明,制备的AgNPs@PDA基质可以有效地克服PC对其它类脂质检测的影响。
实施例4、使用AgNPs@PDA作为基质在负离子模式下检测小鼠鼠脑脂质萃取液
基质分散液配制方法参照实施例2。
脂质萃取方法参照实施例3。
将基质溶液与重溶的脂质萃取液按照1:1(v/v)进行混合,之后取2μL用移液器点样于MALDI不锈钢靶面,室温晾干。送入质谱进行分析。
质谱条件为:配备有9.4T超导磁体Bruker solariX质谱仪,激光波长355nm,激光能量为75%,激光斑点大小为50μm,脉冲频率150Hz,分辨率在200m/z时为200000。
在负离子模式下进行检测,检测结果如图4a所示,可以看到检测的脂质种类多,无背景干扰。
使用负离子模式下常用的9-氨基吖啶(9-AA)作为基质对小鼠鼠脑脂质萃取液在负离子模式下进行质谱检测,检测结果如图4b所示,可以看出,其检测的主要为ST类物质。
实验结果表明,制备的AgNPs@PDA基质能够更加有效地分析多类脂质。
实施例5、使用AgNPs@PDA作为基质对小鼠鼠脑进行质谱成像。
基质分散液配制方法参照实施例2。
将小鼠用CO2窒息处死,快速取出鼠脑,液氮冷冻,利用切片机在-18℃下切片,切片厚度为10μm并放置于ITO玻璃片上,将玻璃片放置在真空干燥器中干燥1h,用电喷雾基质喷涂装置将基质喷涂在组织表面,喷涂后,将玻璃片再次放置于真空干燥器中干燥1h,干燥后的组织切片可用于MALDIIMS分析。
利用MALDI-FT质谱对组织切片进行成像分析;
质谱条件为:
质谱仪:配备有9.4T超导磁体Bruker solariX质谱仪,激光波长355nm,激光能量为75%,激光斑点大小为50μm,脉冲频率150Hz,激光光栅步长为120μm(极限分辨率20μm),每个像素采集1张谱图,质量检测范围是:100Da-1350Da。
其结果如图5、图6,成像图能够明显区分鼠脑的各亚区域,说明合成的AgNPs@PDA具有良好的分散性。成像检测到了两种FA(脂肪酸),3种CPA(环状磷脂酸),4种CDP-DG(胞苷二磷酸二酰基甘油脂),19种LPA(溶血磷脂酸)和PA(磷脂酸),12种LPE(溶血磷脂酰乙醇胺)和PE(磷脂酰乙醇胺),7种PC(磷脂酰胆碱),6种PS(磷脂酰丝氨酸),1种Cer(神经酰胺),2种DG(二酰基甘油脂),1种MG(单酰基甘油脂),8种PIP(磷脂酰肌醇磷酸酯),3种PI(磷脂酰肌醇),5种SM(鞘磷脂),8种ST(硫苷脂),18种HexCer(糖基化神经酰胺)以及4种代谢小分子(磷酸、牛磺酸、葡萄糖、磷酸丝氨酸)。实验结果表明AgNPs@PDA纳米颗粒作为基质用于质谱成像具有优异的性能,分散性好,喷涂均匀,成像结果准确且重复性好。
Claims (10)
1.一种制备AgNPs@PDA纳米颗粒的方法,其特征在于:所述AgNPs@PDA纳米颗粒为聚多巴胺修饰的银纳米颗粒,是由多巴胺在碱性条件下还原AgNO3得到的。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法包括下述步骤:将多巴胺溶解在水中,调节pH值至7.0—8.5,然后将AgNO3溶液滴加到所述多巴胺的溶液中进行还原反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述多巴胺和硝酸银的质量比为5:1-20:1;所述还原的温度为20-100℃;所述还原的时间为10min以上,优选10min-72h。
4.权利要求1-3中任一项所述方法制备得到的AgNPs@PDA纳米颗粒。
5.权利要求4所述的AgNPs@PDA纳米颗粒在下述至少一种中的应用:
1)作为基质辅助激光解吸电离质谱中的基质的应用;
2)作为基质辅助激光解吸电离质谱成像中的基质的应用;
3)作为基质辅助激光解吸电离质谱校准标准品的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质的分子量为100Da-2000 Da。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于:所述基质辅助激光解析质谱中的待测物质为代谢小分子、低丰度脂质、脂肪酸类化合物中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述小分子代谢物选自牛磺酸、葡萄糖、肌酸、肌酸磷酰丝氨酸、磷酸丝氨酸、油酰胺中的至少一种;
所述低丰度脂质选自磷脂酸、糖基化神经酰胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺中的至少一种;
所述脂肪酸类化合物选自硬脂酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸中的至少一种。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的应用,其特征在于:所述基质辅助激光解吸电离质谱用于检测下述体系:细胞组织样本、体液、化学反应混合物。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的应用,其特征在于:所述基质辅助激光解吸电离质谱用于对待测物质进行质谱成像。
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