CN105074471B - 通过直接maldi/ms检测干液斑中化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用质谱分析方式来测定干液斑中化合物的方法，提供了一种通过没有任何消解步骤或液体萃取步骤的干液斑MALDI‑MS分析方法，用来检测和/或量化存在于血液中的至少一种成分。本发明的方法允许进一步分析干液斑内至少一种成分的物理分布。

Description

通过直接MALDI/MS检测干液斑中化合物的方法
技术领域
本发明涉及存在于生物体液中至少一种化合物的检测方法，尤其涉及存在于干液斑中至少一种化合物的检测和/或鉴定方法。本发明还涉及一种用于分析干液斑中化合物空间分布的方法。本申请描述了用于干液斑分析的新方法。
背景技术
液体分析目前主要在液态样本上进行。这样的液态样本不便于运输，而且分子化合物的完整性不能长期保持。为了便于运输和更长时间的保存，液体可以在合适的载体上进行干燥。例如，干血纸片法(或DBS)是最小血液取样技术，其包括滴加至少一个小血滴到纸载体上。通常，该纸载体被特别设计为能够吸收小血滴以用于进一步分析。在送入分析实验室之前，血斑允许在室温下风干几个小时。少量的血液样本和试样的易于处理造就了DBS取样技术的成功。此外，它允许简化存储和廉价运输。它的成功始于20世纪60年代，那时罗伯特·盖斯瑞(Robert Guthrie)博士开发出来了用于苯丙酮尿症检测的化验。从那以后，“Guthrie卡”已在新生婴儿筛查中被全世界采用。利用纤维素载体血液取样(用少量血液的微创技术)的优点是特别适合于儿科患者，但对于临床前及临床研究(3R原则：减少，替代和优化)同样有吸引力。目前，干斑取样技术的使用被推广到其他生物体液，如血清，血浆或尿液。
例如，新生儿筛查和药理活性都采用质谱(或MS)技术用于干血斑分析。直到最近，在液体介质中萃取和分离的几个步骤仍然是必要的；导致在MS分析可进行之前有一个较长时间的样本制备。取自干血斑样本的少许(分析物)的液体萃取通常使用水溶剂或有机溶剂的混合物进行，接着是液相色谱(LC)分离。由于液体萃取的步骤和/或分离的步骤存在，样本被污染和/或存在于样本中的化合物被破坏可能在这些步骤当中的一个步骤中发生。为了规避这些样本制备和操作的问题，而这在诊断和制药领域中极为重要，新的、直接的技术发展起来了(综述见Déglon et al.,2012[Anal Bioanal Chem 2012,402:2485-2498])。技术的发展主要集中在通过直接洗脱(例如在线液体萃取)或直接解吸/电离进行DBS快速分析。后一方法是最快的解决方案(无需预处理)，特别适合于高通量的干液斑分析。在这样的背景下，提出了一些从不同的基本电离技术发展而来的敞开式MS方法：解吸电喷雾电离(DESI)和电喷雾电离(ESI)中的纸喷雾电离(PSI)，气体放电电离(GDI)中的实时直接分析(DART)和电子电离(EI)中的常压热解吸化学电离(APTDCI)。
这些MS方法用来分析不同的干液斑，但出现了主要的限制。例如，干血斑中的分析物分布可能受到几种因素的影响，如血斑大小、红细胞压积水平和扩散性质(色层效应)。通过直接解吸/电离的分析物化验，可能会被这些因素所影响。分析物分布成像是指导这些分析物化验的有效方法。然而，干血斑中的分析物分布成像(在上述MS方法中)已经完成。放射自显影的灵敏度和分辨率都还不足以进行可靠的分析。因此，由于成像方法的低灵敏度和/或低分辨率，分析干液斑样本的直接解吸/电离方法会受到限制，从而导致分析物检测不够精确。样品制备和随后的分析仍然是基本问题，其限制了这些方法在干液斑分析领域的应用。
因此，需要一种简单、快速且可靠但无需预处理的方法来检测存在于干液斑中的化合物。此外，还需要一种不使用特定标签，允许存在于干液斑中化合物成像，同时具有高灵敏度和高质量分辨率，而对生物污染物不太敏感的MS方法。
发明内容
因此在这个背景下，本发明的目的是通过提供一种检测存在于液体样本中至少一种化合物的方法，至少部分地解决目前现有技术中存在的问题，优选地，该方法没有液体萃取步骤，最终通过印迹步骤，其可以保持存在于干液斑中化合物的空间分布，并允许通过分子成像工具进一步测定它们的空间分布。
根据本发明的一个方面，提供了一种检测存在于生物体液中至少一种化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a，在载体上提供至少一个干液斑；
步骤b，固定在所述载体上的所述干液斑的至少一部分到导电表面上；
步骤c，提供紫外光吸收化合物的水溶液或有机溶液；
步骤d，将所述紫外光吸收化合物沉积到固定在所述导电表面上的所述载体上干液斑的至少一部分上；
步骤e，使载体上所述干液斑的至少一个区域经受基质辅助激光解吸/电离过程以产生离子；
步骤f，用质谱仪分析仪获取所述离子的全扫描模式质谱，和
步骤g，通过分析所述全扫描模式质谱确定至少一种化合物的存在。
该方法允许存在于干液斑中至少一种化合物快速且可靠的检测和可视化，而不需要在通过MS分析之前的任何预处理步骤。本发明发明人发现通过MALDI质谱，载体上干液斑的直接分析克服了现有技术的局限性。本发明申请人发现可以简单且快速地分析存在于液体样本中的化合物，而不需要任何液体萃取和分离步骤，这是有利的，因为样品能够制备得更快以及没有存在于干液斑中化合物的液体萃取步骤，避免了化合物潜在的污染和/或降解。换句话说，本发明的方法不包括存在于干液斑中化合物的任何液体萃取和分离步骤。至少一滴液体沉积在载体上后，载体上的干液斑至少一部分被固定在导电表面上，没有任何干液斑的消解或液体萃取步骤。
在另一实施例中，本发明涉及用于检测液体中至少一种化合物的方法，其中执行了转移存在于干液斑中至少一种化合物到膜的进一步步骤。因此，在提供至少一个干液斑到载体上后，所述方法包括以下步骤：
·转移来自于干液斑的至少一种化合物到膜上，
·固定所述膜的至少一部分到导电表面上。
由于原始纸载体的厚度问题，通过MALDI质谱的干液斑直接分析可能承受某些应用和/或化合物的挑战。所提出的间接方法可以通过转移至少一种化合物到较薄的载体上解决这个问题，如纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜。此实施例可以克服厚度问题，而干液斑上待分析的化合物的空间定位被保存在膜上。
在一个优选实施例中，本发明涉及一种用于进一步测定干液斑内化合物空间分布的方法，该方法包括进一步的步骤：
·获得存在于干液斑内在至少2个区域离子的完整扫描模式质谱，相对于第二区域，第一区域更靠近所述干液斑的中心，
·对应于在所述干液斑区域内待检测的至少一种化合物计算出的质量电荷比，选择精确质量电荷比(m/z)，
·确定干液斑内所述化合物的空间分布。
这种优选的实施例允许化合物的存在与其在干液斑内的空间分布相关联。这是有利的，因为存在于干燥液斑中心和外围区域化合物的位置的显著差异可能会影响质谱(MS)化验结果。化合物分布研究有助于指导和优化局部解吸/电离质谱的发展。此外，这种优选的实施例允许干液斑中所选择的化合物的性质、浓度和空间位置相关联。
优选地，使用根据本发明所述方法待分析的化合物是在液体中的化合物，其计算出的质量电荷比在100到1500m/z之间。
事实上，当化合物质量电荷比在100到1500m/z之间时，根据本发明所述的方法特别有效。利用本发明所述的方法，基于测量的精确质量电荷比，这些化合物可以容易且快速地在液体样本中被鉴定。
本发明被独立权利要求所限定。从属权利要求限定有利的实施例。
附图说明
下面通过参考附图以举例的方式更详细地解释本发明的上述和其他方面。附图中：
图1示出根据本发明的一个方面在干血斑上进行直接MALDI质谱实验的示意图。
图2示出干血斑脂的MALDI FT-ICR质谱：(a)57.75–1500m/z区域的平均质谱；(b)350-550m/z区域的放大视图；(c)550-750m/z区域的放大视图；(d)750-950m/z区域的放大视图。质谱注释(1-35)对应于表1中的脂质分布。
图3示出干血斑中两种小药物化合物的MALDI FT-ICR质谱：(a)示出右美沙芬(500，100和20picomol/L)[M+H]+离子在248–287m/z区域的平均质谱；(b)示出胺碘酮(500和100picomol/L)[M+H]+离子在628–656m/z区域的平均质谱。
图4示出在纤维素载体上的干血斑，转移了的PVDF膜和通过在膜上执行本发明所述方法的质谱：(a)干血斑的光学图像；(b)用氨基黑10B染色的转移了的膜的光学图像；(c)200–1400m/z区域的平均质谱；(d)750-800m/z区域的放大视图。质谱注释(14-23)对应于表1中的脂质分布。
图5示出由本发明所述方法执行的纤维素载体上的干血斑和质谱：(a)干血斑的光学图像；(b)由干血斑右半边的分析获得的平均MALDI FT-ICR质谱；(c)至(f)是4种不同化合物的离子图像。
这些图既非按比例也非匀称地绘制。一般地，相同的组成部分由图中相同的附图标记表示。
具体实施方式
这里的基质辅助激光解吸电离(MALDI)和解吸，要理解的是，MALDI是基于激光能力解吸来自表面的分析物分子的软电离技术(以激光解吸电离(LDI)为基础的技术)。通过持续时间短的强烈激光脉冲，使用基质来辅助样本部分消融。基础的MALDI需要两个步骤(Hoffmann and Stroobant 2007[In Mass Spectrometry:Principles andApplications,John Wiley&Sons Ltd])。在第一个步骤中，待分析的样本与基质溶液混合，并将混合物干燥，得到“分析物掺杂的基质晶体”。第二个步骤发生在激光脉冲引起基质晶体加热、升华和消解的质谱仪源内部。分析物分子被夹带进入基质羽流中，并被离子化，然后被转移(完整的气相离子)进入质谱仪。MALDI源主要用于与飞行时间质量分析仪(MALDI-TOF)联合，但也可以与四极杆离子阱飞行(MALDI-QIT-TOF)质谱仪、傅里叶变换离子回旋共振(MALDI-FT-ICR)质谱仪、线性离子阱轨道阱(MALDI LTQ Orbitrap)质谱仪以及四极杆轨道阱(MALDI-LTQ-Orbitrap)质谱仪耦合。
直到最近，MALDI完全是真空离子源，这里离子在质谱仪的真空系统内部形成(＜10-3Torr，托)。随着气压MALDI(AP-MALDI)的发明，电离可以在标准大气压下发生。这两个源的电离过程相似，但它们可以通过一些不同特征区分。例如，AP-MALDI是软电离技术；离子在高源压下(高至几个Torr)显示出较少的碎片化。同时，AP-MALDI源提供的优势是在质谱仪外部允许高通量筛查。然而AP-MALDI不如常规MALDI敏感。离子还可以在低于大气压(～3.5Torr)下产生：这是常规MALDI和AP-MALDI之间的中间情况。这种在中间气压下的方法提供了良好敏感性(MALDI)和软电离(AP-MALDI)之间的折中方案。
高质量分辨分析仪，如FT-ICR，允许精确质量的测定。质量精度通常用百万分之几(ppm)表达，并且从已知的单一同位素质量指出仪器响应的偏差。FT-ICR仪器可以提供最高的质量精度(<1ppm)。复杂样本中未知的小化合物鉴定需要测定化合物的精确质量。基于此信息，可能(或理论)的元素组成被计算出来。小质量误差容限有助于减少候选公式的数量，甚至可以找到未知化合物的正确分子式。精确质量项是用来限定实验测量的质量，而确切的质量限定实际计算出的值。在质谱分析中，单一同位素质量通常用来计算化合物的精确质量；其考虑各组成元素最丰富的同位素的精确质量。质谱仪测量质量电荷比，m/z。
这里的生物体液应理解为人或动物的任何体液，包括但不限于，血液，血清，血浆，尿，唾液或胆汁。
这里的载体上的干液斑，应理解为生物体液样本被滴加到任何一种吸水性纤维素载体上的取样。该载体可以是专门制造的纸，其按照共识标准的要求(良好的均匀吸收特性)验证。对于某些需要生物体液成分分离的程序，载体也可以是任何色谱纸，如用于快速诊断测试那些(带状纸)。
这里的质谱，应理解为当离子(通常是束)根据现有离子种类的质量电荷比(m/z)分离时获得的图谱。这是m/z相对于测量到的丰度信息的图形表达(Price 1991[J Am SocMass Spectrom,2,336-348])。
这里的全扫描模式，应理解为一种描述质谱仪操作的方法，其中的离子流被记录在整个质谱上。
这里的峰，应理解为代表图谱内检测的离子的信号强度。
这里的电离，应理解为从中性原子或分子中产生离子的过程(Price 1991[J AmSoc Mass Spectrom,2,336-348])。
这里的区域，应理解为代表样本(即干血斑)待分析的部分，所述部分足够大，以在MALDI之后获得至少一个质谱。区域可以大体上是圆形，其直径在1到15毫米之间。当至少一种化合物从干液斑被转移到膜上时，区域是指已被转移到该膜上的干液斑的相应区域。
这里的质量电荷比，m/z，应理解为离子质量除以离子带电荷数形成的无量纲量(Price 1991[J Am Soc Mass Spectrom,2,336-348])。
根据本发明的第一方面，提供了一种检测存在于生物体液中至少一种化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a，在载体上提供至少一个干液斑；
步骤b，固定在所述载体上的所述干液斑的至少一部分到导电表面上；
步骤c，提供紫外光吸收化合物的水溶液或有机溶液；
步骤d，将所述紫外光吸收化合物沉积到固定在所述导电表面上所述载体上干液斑的至少一部分上；
步骤e，使载体上所述干液斑的至少一个区域经受基质辅助激光解吸/电离过程以产生离子；
步骤f，用质谱仪分析仪获取所述离子的全扫描模式质谱，和
步骤g，通过分析全扫描模式质谱确定至少一种化合物的存在。
液体样本可由新生婴儿、儿童、成人或动物提供。当液体样本是血液时，它可以通过例如带血针的刺刺破脚跟收集。获得的液体滴沉积在载体上。但另外，多个液体斑可能沉积在一个载体上，每一个液体斑与其它液体斑在空间上分离。载体可以是任何一种允许液体在其上均匀干燥的载体。例如，载体可以是滤纸，纤维素纸，“Guthrie卡”或Whatman 903纸。在另一实施例中，液体必须浸透载体的两面。在又一实施例中，载体可以是任何一种色谱纸，其允许液体成分分离。例如，载体可以是用于快速诊断试验的色谱纸带。在室温下，液体斑沉积之后风干需要的时间典型为2个小时。该载体可储存在密封的信封里，或防止污染的容器中。在-20℃和23℃之间的温度下，干液斑可以至少储存几个星期到几个月的时间，这取决于待分析的化合物的性质。在一个优选实施例中，干液斑为干血斑。
在另一实施例中，在载体上提供至少一个干液斑的步骤包括以下步骤：
·提供液体样本，
·沉积至少一个所述液体样本的液滴到至少一个载体上，从而在载体上形成至少一个干液斑。
载体上干液斑的表面可以具有在几毫米到几十毫米之间的直径。例如，当单个液滴沉积时，干液斑的直径可以在5到20毫米之间。这样的干液斑直径可以通过任何具有均匀成分，均一厚度、流量和吸收的纤维素基质得到，如那些市售的(例如Whatman 903卡或Whatman FTA DMPK卡)。在另一实施例中，载体上干液斑的表面可以有几毫米的宽度和几厘米的长度。这样的干液斑的大小，可以在色谱分离步骤后，通过任何色谱的纤维素载体得到。
然后，载体上的干液斑或印迹膜的至少一部分固定在导电表面上。例如，载体上干液斑或印迹膜仅有一部分可以从载体剪下并固定在导电表面上。例如，至少有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％载体上的干液斑表面可以从载体剪下然后被固定在导电表面上。例如，载体的穿孔样本可直接印在导电表面上。在一个优选实施例中，当干液斑至少有一部分固定在导电表面时，固定部分包括至少干液斑的中心区域和外围区域(干液斑一般大体上呈圆盘状，这意味着该固定部分包括扇形，其被干液斑的2倍半径和周长所界定)。利用这样的结构，可以分析干液斑内或多或少在外围的区域。
在另一实施例中，在固定到导电表面之前，存在于干液斑中的至少一种化合物可以转移到膜上。在所述方法中，在载体上提供至少一个干液斑后，所述方法的步骤(b)包括：
·转移源于干液斑的至少一种化合物到膜上，
·在导电表面上固定所述膜的至少一部分。
该技术是基于压力印迹方法以转移来自干液斑中的化合物到膜的表面。膜可以定义为适合将进一步分析的生物化合物转移到其上的任何固定化载体材料。膜可以是，但不限于，硝酸纤维素，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚乙烯或尼龙载体。印迹可以通过预先用溶剂润湿膜辅助，溶剂可以是丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇或它们的混合物，但不限于它们。也可以通过热辅助印迹。印迹可以手动操作或采用(热)印记装置。
载体上干液斑或印迹膜上的部分可以采用双面导电胶带固定在导电表面，例如双面导电碳胶带。导电表面提供导电平面表面，以增强电离过程，并避免静电电荷影响离子束形成。导电表面可以包括塑料、玻璃和金属；表面可能以各种方式呈现导电性，包括但不限于，碳粒子，碳纤维和金属颗粒。例如，导电表面可以在包括铟锡氧化物(ITO)镀膜玻璃片，不锈钢板或镀金板中选定，其常见尺寸范围从25毫米×75毫米(玻璃面)到81毫米×123毫米(板)。
紫外光吸收化合物指的是在MALDI-MS中使用的材料，其用来准备用于分析的样本(也被称为基质，或基质溶液)。这种材料是至少一种溶于有机溶剂和/或水的紫外光吸收化合物。沉积在样本上的紫外光吸收化合物的水或有机溶液吸收来自激光的能量，并将其转移到样本上以解吸，挥发和电离存在于载体上干液斑中的化合物，从而产生在接下来要在质谱仪中分析的样本的离子，以得到关于存在于干液斑中化合物的信息。换句话说，紫外光吸收化合物可以是任何化合物，其借助于MALDI方法允许存在于干液斑中的至少一种化合物(或印迹在膜上的至少一种化合物)进一步电离，挥发和解析。
所用的紫外光吸收化合物溶解于水，或至少一种有机溶剂，或至少一种有机溶剂和水的混合物。例如，有机溶剂可以是，但不限于，乙腈，丙酮，氯仿，异丙醇，乙醇，甲醇，四氢呋喃和这些溶剂的混合物。典型的基质溶液可包括在溶剂中浓度为5-30mg/ml的基质，其与待分析的目标化合物亲和。在一个优选实施例中，基质添加剂如柠檬酸铵，岩藻糖，精胺或亚精胺可抑制不良反应。
在一个优选实施例中，可以将酸加入到溶解的紫外吸收化合物中以增强电离。例如，酸可以是体积分数最佳为0.05-1％的甲酸，三氟乙酸或磷酸，或浓度范围最佳为0.01–0.2mol/L的醋酸或盐酸。
至少一种溶解的紫外光吸收化合物沉积在包括固定在导电表面的干液斑或印迹膜的载体的至少一部分上。溶解的吸收紫外线的化合物的沉积可以通过手动喷雾器，自动喷雾器(如自动喷嘴或压电雾化)，气动喷雾器或其混合的紫外吸收化合物的蒸发进行。溶解的吸收紫外光化合物沉积后，就形成了包括存在于干液体斑或印迹膜中的化合物和溶解的紫外光基质的混合物。
在一个优选实施例中，溶解的紫外光吸收化合物，在包括干液斑或印迹膜的载体上沉积为均匀层。由干液斑或印迹膜中的化合物所以及紫外光基质组成的混合物的至少一部分，通过MALDI解析和电离。紫外光吸收化合物吸收激光能量并转移能量到在干液斑中待解析的化合物上，让其挥发和电离，从而产生接下来要分析的离子。
化合物检测和/或鉴定的最后一步，是通过质谱仪分析仪，获得完整干液斑化合物离子的全扫描模式质谱进行的。全扫描模式质谱可以是在干液斑区域或印迹膜区域的不同位置所获得的几个全扫描模式质谱的平均。
数据获取是根据制造商的具体建议设置模式(正或负)，质量范围，激光强度和频率，每频谱的数量以及质谱仪的任何其他参数后，由质谱仪采集软件所控制。然后使用质谱仪分析软件进行数据分析；质谱是平滑的，基线被减掉且质谱的峰值是手动或自动挑选的。对于成像，首先记录光学图像。数据采集和分析由特定的MS成像软件控制，可为整个样本平均质谱的每个信号创建离子密度图。
在一个优选实施例中，通过对应的存在于所述干液斑中至少一种化合物的计算出的质量电荷比(m/z)，选择至少一种具有精确质量电荷比的离子进行存在于液体中至少一种化合物的测定。采用这样的步骤，单一或多重已知化合物的存在可以在单个质谱内分析。本领域中熟练的操作人员可以参考本领域熟知的分子表或基于网络的数据库找到已知化合物的精确质量。
在一个优选实施例中，分析的最后步骤，即离子质谱采集，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS)，飞行时间质谱仪(TOF-MS)，四极杆离子阱飞行时间质谱仪(QIT-TOF-MS)，四极杆轨道阱质谱仪(Q-Orbitrap MS)或线性离子阱轨道阱质谱仪(LTQOrbitrap MS)进行。在一个优选实施例中，使用高分辨仪(RT-MS，ICR或Orbitrap)。FT-MS可以提供高分辨率，大质量范围，高灵敏度和用于测定小分子身份的精确质量。
在一个更优选实施例中，待检测的化合物是质量电荷比值低于或等于15000m/z的化合物，优选地，在100到1500m/z之间。当化合物计算出的质量电荷比值小于或等于1500m/z时，如果质谱仪的精度足够(<1ppm)，是可以通过精确质量鉴定的。
在一个优选实施例中，待测化合物可在以下集合中选择，该集合包括核苷酸，氨基酸，有机酸，糖类，脂类，尿素，肌醇，所述化合物存在于身体代谢物，候选药物和试验性药物中。在一个更优选的实施例中，待检测化合物是来自于选定的体液代谢组(尿液代谢组，血浆代谢组，血液代谢组，血清代谢组，唾液代谢组，胆汁代谢组)的化合物，并在更优选的实施例中待检测的化合物是来自于血液代谢组的化合物。代谢组可以定义为生物样本中发现的完整的小分子代谢物集合。体液代谢组可以包括内源性化合物和外源性化合物。例如，待分析和/或鉴定的内源性化合物可以在包括以下化合物的集合中选择：核苷酸(例如单、二和三磷酸核糖核苷酸：腺苷单磷酸，三磷酸腺苷，三磷酸腺苷，二磷酸尿苷)，氨基酸(例如L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-蛋氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸L-谷氨酰胺)，有机酸(例如苯甲酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，丙二酸，尿酸，琥珀酸)，碳水化合物(例如D-果糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-吡喃葡萄糖，N-乙酰基-D-葡糖胺)，脂类(例如胆固醇，游离脂肪酸，甘油磷脂，鞘脂，类固醇，糖脂，二酰基甘油和三酰基甘油)，尿素，或肌醇。例如，待分析和/或待检测的外源性化合物可以从以下集合中选择，该集合包括候选药物(例如，药物的临床前研究期间)，药物分子(临床研究或治疗药物监测期间)，如右美沙芬或胺碘酮。
图2示出通过本发明所述方在正离子模式下在干血斑上获得的脂质分布图的例子。血红素b和磷脂酰胆碱的品种占平均质量谱的主导地位。表1列出了样本中检测到的脂质类的非详尽的不同种类。表1表示记录于在干燥血斑正离子模式下的质谱中检测到的峰值分布。分布是在与文献数据比较的基础上进行的。使用的缩写是：CH，胆固醇；LPC，溶血磷脂酰胆碱；PC，卵磷脂；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SM，鞘磷脂；TAG，甘油三酯。
表1:在干血斑区域中检测到的化合物的非详尽的列表。
分子种类 m/z测量值
1 369.34801
2 518.32653
3 520.33404
4 522.36076
5 524.36347
6 534.30498
7 546.35966
8 557.15604
9 560.31139
10 703.57955
11 725.55982
12 738.45646
13 740.48319
14 758.57001
15 760.59193
16 762.58503
17 780.55659
18 782.56410
19 784.58121
20 786.59353
21 788.61065
22 796.53504
23 798.54255
24 804.55068
25 806.57260
26 808.58011
27 810.60683
28 820.52432
29 822.54624
30 824.56336
31 828.54477
32 832.57900
33 837.67943
34 879.58264
35 TAG C18/18/18:2 906.21124
Heme b(血红素b) 617.18506
正如我们所看到的，磷脂(溶血磷脂胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸)，鞘脂类(鞘磷脂)，三酰甘油和胆固醇是观察到的主要品种。血浆脂质已被证明是若干疾病的潜在生物标志物，如类风湿关节炎(Fuchs et al.,2005[ClinicalBiochemistry 38,925-933])或心血管疾病(Stübiger et al.,2012[Atherosclerosis224,177-186])。本发明是一种有前途的技术，可以用于干燥血斑脂质分布的临床筛查，以评估疾病状态和/或治疗前或治疗后的疾病活动。
图3示出2个小药物分子的平均谱。右美沙芬是一种镇咳药(C18H25NO，单一同位素中性质量为271.19361)，胺碘酮(C25H29I2NO3，单一同位素中性质量为645.02368)是用于各种类型心律失常的抗心律失常药。右美沙芬[M+H+]离子(测量出的质量为272.20012m/z)和胺碘酮[M+H+]离子(测量出的质量为646.03071m/z)用星号指定。
图4示出其中化合物已被转移到PVDF膜上(图4b)的干血斑(图4a)。PVDF膜已在甲醇中预湿10秒，然后应用到干血斑2分钟；化合物在180℃时用铁转移。膜用氨基黑10B(0.1％的甲醇与水的比例为45:55)染色30秒，并在蒸馏水冲洗两次(30秒)。氨基黑10B用于给蛋白质和/或脂质染色。750-800m/z区域的放大视图显示某些脂质类。质谱注释(14-23)对应于表1中的脂质分布。
在一个优选实施例中，校准混合物沉积在载体上的干液斑或印迹膜所固定的导电表面；且紫外光吸收化合物沉积在校准混合物的至少一部分或载体上干液斑的至少一部分。紫外吸光化合物可以与所制备的沉积在干液斑样本上的化合物相同。校准混合物可以采用已知的质量电荷比自制，或采用市售预包装(例如来自Sigma，Bruker，AB SCIEX)化合物的混合物。校准混合物被用来校准质谱装置。校准混合物的选择与待分析和/或鉴定的化合物的性质有关。例如，当待鉴定和/或待分析的化合物具有100到1500m/z之间的计算出的质量电荷比时，校准混合物包括或由计算出的质量电荷比在100到1500m/z之间的化合物组成。可以使用标准小分子，肽或两者的混合物。
本实施例中，该方法的结果有很大的改善，这是因为待分析的样本和校准混合物是在相同的条件下制备的。因为样本分析极大地依赖于测量的精度，通过具有使用相同方法制备的已知的校准混合物，样本允许可靠地校准质量分析仪的m/z刻度。
相应的，在一个更优选实施例中，该方法包括以下步骤：
·使校准混合物的至少一个区域经受基质辅助激光解吸电离以产生校准离子，
·用质谱分析仪获取校准离子的全扫描质谱，
·利用所述校准离子的质谱来校准质谱仪的m/z刻度，
其中后两步在使载体上的干液斑或印迹膜的至少一个区域经受MALDI以产生离子的步骤之前或之后进行。
换句话说，解吸/电离的步骤和对应存在于校准化合物获得校准离子质谱的步骤，在包括干液斑和紫外光吸收化合物的混合物的载体上进行的类似步骤之前或之后进行。在该实施例中，MALDI装置和/或MS装置通过外部校准方法校准，大大改善了存在于干液斑中化合物的分析。
在一个优选实施例中，校准也可利用在液体中大量存在的已知质量电荷比的内部分子进行，如血液中的血红素分子(C34H32FeN4O4,，单一同位素中性质量为616.177298)。此校准是在采集数据后，通过质谱仪数据分析软件所提供的内部校准方法完成。
在本发明所述方法更优选的实施例中，紫外光吸收化合物是在一个化合物集合内选择的晶体基质，该化合物集合包括：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)；二羟基苯甲酸(DHB)的异构体；反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)；烟酸；吡啶酸(PA)；反式-3-甲氧基-4-羟基肉桂酸(阿魏酸)；2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)；2,6-二羟基苯乙酮(DHA)；3-羟基吡啶甲酸(HPA)；3氨基喹啉；反式-3-吲哚丙烯酸(IAA)；地蒽酚(DIT)；1,8,9-三羟基蒽；2-(4-羟基苯基偶氮)-苯甲酸(HABA)；6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)；3-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶(AMNP)；5-氨基-1-萘酚(5,1-ANL)；5-羟基-1-萘酚(5,1-HNL)；或以上化合物的混合物。
紫外光吸收化合物也可以包含于固体离子基质中，这可以从酸性结晶基质的混合物获得，酸性结晶基质例如CHCA，SA或具有不同碱基如同苯胺或N，N-二甲基苯胺的DHB，紫外光吸收化合物或包含于液体离子基质中，例如CHCA/2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶，4硝基苯甲醇(NBA)。卟啉类基质(例如10,15,20-四(五氟苯基)卟啉，F20TTP)或无机基质(细金属或金属氧化物的甘油悬浮液)，也可以使用。
在一个优选实施例中，本发明进一步提供了一种用于测定在干液斑或印迹膜中至少一种化合物空间分布的方法，所述方法还包括进一步的步骤：
·获得存在于干液斑内在至少2个区域离子的完整扫描模式质谱，相对于第二区域，第一区域更靠近所述干液斑的中心，
·对应于在所述干液斑区域内待检测的至少一种化合物计算出的质量电荷比，选择精确质量电荷比(m/z)，
·确定干液斑内至少一种化合物的空间分布。
在该实施例中，可以测定在干液斑或印迹膜上的至少一种化合物的空间位置。MALDI MS产生存在于载体上干液斑中化合物的离子质谱，其可以与载体内化合物的空间分布相关联。
一种或多种化合物的物理位置，通过直接解吸进行分析时可能具有显著的相关性。结果表明，当血液在纤维素载体采样时，血液中存在的化合物的色谱迁移可能与几个因素(红细胞压积，血斑体积或扩散特性)相关。因此，需要一个只有几个步骤的快速方法，其允许存在于载体上或滴加到印迹膜上干液斑中的至少一种化合物的空间分布分析。本发明提出，通过在载体上或滴加到印迹膜上干液斑中成像的定位步骤，以指导直接检测分析。因此，一种或多种化合物的检测和可视化，很容易通过这种没有任何化合物预选的单一方法实现。当执行液体样本沉积在色谱纸上和在色谱纸上进行分离液体样本的步骤时，分析可以在干液斑样本的限定部分进行(例如将其限定在分子量的特定范围)。在这种情况下，中心区域位于色谱纸的中央，第二区域靠近色谱纸的边缘。
化合物的空间分布可以在纤维素载体上的干液斑内通过FT-ICR MS成像记录。这样成像的例子可以在图5(c)至图5(f)上看到。在丙酮/水(0.1％TFA)中的CHCA基质溶液(5mg/ml)，溶质溶液体积比为7:3，通过喷雾(ImagePrep,Bruker Daltonic)应用。配备9.4特斯拉磁(Bruker Daltonics)的FT-ICR，SolariX在正离子模式下运行。正如所看到的，示出了4种不同化合物的空间分布：(c)感兴趣的化合物单一分布在中心区域；(d)感兴趣的化合物还分布在外围区域；(e)感兴趣的化合物单一分布在外围区域；(f)感兴趣的化合物均匀分布。
对于成像，首先记录光学图像。数据采集和分析由特定的MS成像软件控制；为存在于整个样本平均质谱的每个信号生成了离子密度图。根据本发明所述的方法，通过使用大气压下的扫描探针MALDI成像源(AP-SMALD)和具有气动喷雾器的基质应用方法可以达到5μm的空间分辨率。因此，成像可以通过在同一时间结合精确的质量分析和更高的空间分辨率进行。
在一个更优选的实施例中或另一实施例中，本发明提供了一种方法，其中所述方法在至少2个不同的干液斑上进行。这至少2个不同的干液斑，可以收集于同一个人或动物的体液样本，或收集于在不同时间(即治疗前和治疗后)同一个人或动物的体液样本，或收集于来自不同的人或动物的体液样本，以比较这两个人或两个动物中的化合物的分析和/或鉴定。用这种方法，可以测定多个载体上的多个干液斑内或来自于多个干液斑的印迹膜内的至少一种化合物的空间分布。
因此，在一个更优选实施例中，该方法包括提供至少2个干液斑，其中获得全扫描模式质谱的步骤是在所提供的每个不同干液斑的至少两个区域上实现的，所述方法还包括步骤：
·在所提供的不同干液斑之间比较至少一种待检测化合物的空间分布。
例子
来自于纤维素载体上干血斑样本的脂质的检测(表1，图2)
提供人类的血斑，并将其沉积到纤维素载体上(Whatman 903)。
从纤维素载体切下其上的干血斑样本，并使用双面碳导电胶带(SPI提供)将其固定在导电的ITO镀膜玻璃片(Bruker Daltonics)上。校准混合物(Peptide CalibrationStandard II,Bruker Daltonics)沉积在纤维素载体上的干血斑样品附近并将其风干。
紫外光吸收化合物是2,5—DHB。DHB被溶解在浓度为20mg/ml的甲醇/0.2％TFA中(溶质溶剂体积比为50:50)。溶解的DHB使用ImagePrep装置(Bruker Daltonics)喷雾。
喷雾过程是多步骤过程：第一步包括功率为25±30％，12个溶解的DHB的喷雾循环(刻度从0％到最大功率的100％且可以进行功率调节，这意味着在这种情况下喷雾功率可在0％到55％之间变化)，接着在每喷雾循环之间进行50秒的干燥。这一步接下来是一个30秒的干燥步骤。然后，三个随后的步骤在喷雾功率为25±30％时实施，并随之增加喷雾循环次数(步骤2：8循环到12循环，步骤3：16循环到32循坏和步骤4：36循环到60循环)。每一个完成的干燥阶段之间的循环数也在增加(步骤2每隔两个循坏，步骤3每隔四个循坏，步骤4每隔6个循坏)。
在紫外光吸收化合物沉积并干燥后，将ITO镀膜玻璃片装入MALDI-FT-ICR装置(SolariX 9.4 T,Bruker Daltonics)。样品在正模式下通过功率为25％，频率为1000赫兹的激光电离。质量范围设置在57.75到1500m/z之间。四级杆1质量设置在650m/z，并累积30质谱的平均。在这些条件下，外部校准导致质量精度在0.15ppm以内。DHB的两个二聚物([2DHB-2H2O+H]+and[2DHB-H2O+Na]+)和两个三聚物([3DHB-3H2O+H]+和[3DHB-2H2O+Na]+)以及血红素b和缓激肽1-7肽(Peptide Calibration Standard II,Bruker Daltonics)被用作外部校准。质谱通过DataAnalysis 4.0软件进行分析。将源于基质或纤维素载体的峰减去平均质谱。在与文献数据比较的基础上，提出了脂质峰的分布。
利用本发明的方法，存在于血液代谢产物中的至少35种脂质被鉴定(识别)。
从纤维素载体上的干血斑样本中检测外源性的小药物化合物(图3)
右美沙芬和胺碘酮的储备液(1mmol/L)在水和水-甲醇(溶质溶剂体积比为1:1)中分别制备。用空白全血稀释储存液到500，100和20pmol/L的浓度以制备工作溶液。将血液工作溶液(25μl)的部分用移液管滴加到Whatman903纤维素纸上并让其在室温下干燥3小时。然后，将干血斑样本用含干燥剂的密封塑料袋密封并储存在-20℃的温度下，直到用来分析。
从纤维素载体切下其上的干血斑样品，并使用双面碳导电胶带(SPI s提供)将其固定在导电的ITO镀膜玻璃片(Bruker Daltonics)上。
紫外光吸收化合物是CHCA。CHCA被溶解在浓度为5mg/ml的乙腈/0.2％TFA中(溶质溶剂体积比70:30)。溶解的CHCA用ImagePrep装置(Bruker Daltonics)喷雾。
喷雾过程是一个多步骤过程：第一步包括功率为20±20％，12个溶解的DHB的喷雾循环(刻度从0％到最大功率的100％且可以进行功率调节，这意味着在这种情况下喷雾功率可在0％到55％之间变化)，接着在每喷雾循环之间进行20秒的干燥。然后，三个随后的步骤分别在喷雾功率为22±22％,19±19％和20±20％时实施，并随之增加循环次数(步骤2：6循环到18循环，步骤3：12循环到40循坏和步骤4：30循环到60循环)。每一个完成的干燥阶段之间的循环数也在增加(步骤2每隔两个循坏，步骤3每隔四个循坏，步骤4每隔6个循坏)。
在紫外光吸收化合物沉积并干燥后，将ITO镀膜玻璃片装入MALDI-FT-ICR装置(SolariX 9.4 T,Bruker Daltonics)。样品在正模式下通过功率为50％，频率为1000赫兹的激光电离。质量范围设置在200到800m/z之间。四级杆1质量设置在300m/z，并累积15质谱的平均。在这些条件下，外部校准导致质量精度在1ppm以内。CHCA的一个单体([CHCA+Na]+)，三聚物([2CHCA-H2O+H]+,[2CHCA+H]+and[2CHCA+Na]+)和一个三聚物([3CHCA+Na]+)被用作外部校准。质谱通过DataAnalysis 4.0软件进行分析。正如所看到的，小药物化合物的检测根据本发明所述的方法在干血斑上进行，导致了药物化合物的存在性快速且可靠的分析。
以上用特定实施例描述了本发明，但这只是为了说明本发明而不应解释为对本发明的限定。更一般地，本领域技术人员将会理解，本发明并不被在上文中所特别展示和/或描述的内容所限定。
权利要求中的附图标记不限制其保护范围。
动词“包括”，“包含”，“具有”、“由……组成”，或任何其他的变体，以及它们各自的变化，不排除被包含的因素之外的其他因素的存在。
不定冠词和定冠词的使用不限定数量。
本发明还可描述如下：本发明提供了一种通过没有任何消解步骤或液体萃取步骤的干液斑MALDI-MS分析，用于存在于生物体液中至少一种分子化合物的检测和/或定量的方法，其允许进一步分析干液斑内至少一种分子的物理分布。

Claims (15)

1.一种检测存在于液体中的至少一种化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a，在载体上提供至少一个干液斑；
步骤b，固定所述载体上的所述干液斑的至少一部分到导电表面上；
步骤c，提供紫外光吸收化合物的水溶液或有机溶液；
步骤d，将所述紫外光吸收化合物沉积到固定在所述导电表面上所述载体上干液斑的至少一部分上；
步骤e，使载体上所述干液斑的至少一个区域经受基质辅助激光解吸电离过程来产生离子；
步骤f，用质谱仪分析仪获取所述离子的全扫描模式质谱，和
步骤g，通过分析所述全扫描模式质谱确定至少一种化合物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b包括：
·转移来自于干液斑的至少一种化合物到膜上，
·固定所述膜的至少一部分到导电表面上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述在载体上提供干液斑的步骤包括以下几步：
·提供生物液体样本，
·沉积所述液体样本的至少一个液滴到至少一个载体上，从而在载体上至少形成一个干液斑。
4.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，步骤g是这样执行的：通过对应于存在于干液斑区域中至少一种化合物的至少一个计算出的质量电荷比(m/z)，选择至少一个精确质量电荷比(m/z)。
5.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，获取所述离子的全扫描模式质谱的步骤是这样执行的：采用傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、飞行时间质谱仪、四级杆离子阱飞行时间质谱仪、四极杆轨道阱质谱仪、线性离子阱轨道阱质谱仪来进行。
6.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，待检测的化合物是计算出的质量电荷比低于或等于1500m/z的化合物。
7.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，将校准化合物沉积在导体表面，并且溶解的所述紫外光吸收化合物在所述步骤e之前沉积在所述校准混合物的至少一部分上。
8.根据权利要求7所述的方法，其包括：
步骤h，使所述校准混合物的至少一个区域经受基质辅助激光解吸电离来产生校准离子，
步骤i，用质谱分析仪获取所述校准离子的全扫描质谱，
步骤j，利用所述校准离子的质谱来校准所述质谱仪的m/z刻度，
其中步骤i和步骤j可在步骤e之前或之后进行。
9.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，所述紫外光吸收化合物是在一个化合物集合内选择，该化合物集合包括：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)；二羟基苯甲酸(DHB)的异构体；反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)；烟酸；吡啶酸(PA)；反式-3-甲氧基-4-羟基肉桂酸(阿魏酸)；2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)；2,6-二羟基苯乙酮(DHA)；3-羟基吡啶甲酸(HPA)；3氨基喹啉；反式-3-吲哚丙烯酸(IAA)；地蒽酚(DIT)；1,8,9-三羟基蒽；2-(4-羟基苯基偶氮)-苯甲酸(HABA)；6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)；3-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶(AMNP)；5-氨基-1-萘酚(5,1-ANL)；5-羟基-1-萘酚(5,1-HNL)；或以上化合物的混合物。
10.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，步骤c的溶液进一步包括酸，该酸选自如下的集合，该集合包括：体积分数最优为0.05-1％的甲酸，三氟乙酸或磷酸，浓度范围最优为0.01–0.2mol/L的醋酸或盐酸。
11.根据上述权利要求1或2所述的方法，所述方法包括：
步骤k，获取存在于干液斑内在至少2个区域离子的完整扫描模式质谱，相对于第二区域，第一区域更靠近所述干液斑的中心，
步骤l，对应于在所述干液斑区域内待检测的至少一种化合物计算出的质量电荷比，选择精确质量电荷比(m/z)，
步骤m，确定所述干液斑内的所述至少一种化合物的空间分布。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，提供至少两个干液斑所述步骤k是在所提供的每个不同干液斑的至少两个区域上实现的，所述方法还包括步骤：
步骤n，在所提供的不同干液斑之间比较待检测的至少一种化合物的空间分布。
13.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，所述导电表面在如下集合中选择：铟锡氧化物(ITO)镀膜玻璃片，不锈钢板或镀金板。
14.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法的步骤d通过所述溶解的紫外光吸收化合物的喷雾实现，其喷雾采用手动喷雾器、自动喷雾器、气动喷雾器或上述装置混合使用。
15.根据上述权利要求1或2所述的方法，其中，待检测的化合物在如下的化合物集合中选择：核苷酸，氨基酸，有机酸，糖类，脂类，尿素，肌醇，所述化合物存在于体内代谢组以及候选药物和试验性药物中。
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