CN103520243A

CN103520243A - 一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊及其制备方法

Info

Publication number: CN103520243A
Application number: CN201310493403.XA
Authority: CN
Inventors: 敬思群; 王侠
Original assignee: XINJIANG DAOLANG JUJUBE INDUSTRY Co Ltd; Xinjiang University
Current assignee: XINJIANG DAOLANG JUJUBE INDUSTRY Co Ltd; Xinjiang University
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-10-21
Also published as: CN103520243B

Abstract

本发明公开一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊及其制备方法。采用以超临界二氧化碳萃取得到的新疆昆仑雪菊油树脂和经反相硅胶色谱制得的红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，采用反相硅胶纯化得到的cAMP粗品，制备的环磷酸腺苷纯度达到了44.69%，超临界二氧化碳萃取制备获得新疆昆仑雪菊油树脂，以雪菊油树脂为基质，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，采用环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、5％的蜂蜡和4％的大豆磷脂，经配伍后制备的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊不仅具有安全无毒、性质稳定等优点，还具有降血压、抗氧化等保健功效和很好的抗菌消炎作用，具有广泛的应用价值。

Description

一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及功能性软胶囊制备技术领域,具体的，本发明涉及一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊及其制备的技术领域。

背景技术

环磷酸腺苷 (Cyclic Adenosine3′,5′monoposphate，英文缩写为cAMP)，化学式为C₁₀H₁₂N₅O₆P，摩尔质量为329.206g/mol，简称环腺苷酸。cAMP是生物界普通存在的一种生物活性物质，是核苷酸的衍生物，含量一般极微，具有第二信使作用，参与广泛的生理生化过程的调节。cAMP是很多酶催化反应的调节剂，可调节细胞内一系列酶的活性，对蛋白质的生物合成也具有调节控制作用，可参与细胞的功能调节。cAMP的胞内浓度越高越有利于缓解心脏内心肌、横纹肌、骨骼肌的疲劳程度。目前，国内外对其生理活性、作用机理进行了大量研究，涉及疾病治疗、信号表达、基因复制等方面。基础医学研究证明，至少有40多种重大疾病包括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞、牛皮癣和心源性休克等与 cAMP有关。Mulieri LA等研究了cAMP对免疫系统的影响，发现在兔子的腹膜巨噬细胞中，高浓度的cAMP明显抑制过氧化物的产生，证明环磷酸腺苷可以在医疗上抑制过氧化物的过度产生。

新疆昆仑雪菊(Kunlun Chrysanthemum)又名血菊，学名为两色雪菊(Coreopsis tinctoria)，属菊科雪菊属一年生草本植物，是目前新疆唯一与雪莲齐名且具有独特功效的稀有高寒野生植物，具有极高的药用价值。昆仑雪菊在人日常生活中多被当做茶饮用，有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效，长期饮用能明显降低血压、血脂，这表明昆仑雪菊很有希望成为治疗三高、心血管等疾病的一味中草药。雪菊油树脂的主要成分有精油、辛辣成分、色素、树脂及一些非挥发性的油脂和多糖类化合物。雪菊油树脂的香气丰富，口感丰满，具有抗菌、抗氧化等功能，是雪菊中一类重要的生物活性物质，含有丰富的亚油酸和亚麻酸，具有祛痰、止咳、驱风、解热、抗菌消炎、血管环舒张、降血脂、降血压等生理功效。

现有技术表明，软胶囊是继片剂、针剂后发展起来的一种剂型，是近年来越来越受到人们的青睐的一种制剂，与其他剂型相比具有很多优点。软胶囊能将油状药物、药物溶液或药物混悬液、糊状物甚至药物粉末定量压注并包封于胶膜内，形成大小、形状各异的密封胶囊。由于软胶囊具有崩解快、起效快、服用和携带方便，快速溶解释放药物，防止药物氧化、分解，掩盖药物不良嗅味，防止挥发性成分挥发等优点，广受人们喜爱，在方便服用者的同时，也增加了产品市场竞争力，取得较好的社会效益和经济效益。目前还未见报道有关综合利用环磷酸腺苷与雪菊油树脂作为主要原料，利用现代软胶囊制备技术制备相关产品及工艺技术方面研究，开展此领域相关研究制备环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊具有重要的现实意义和作用。

发明内容

针对国内外未有环磷酸腺苷与雪菊油树脂联用报道，进而未见制备相应的复合软胶囊报道的研究现状。本发明提供一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊及其制备方法，获得环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊制备的最佳工艺条件，制备的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊富含有多种活性成分，具有理想的保健作用，且软胶囊中的环磷酸腺苷在胃液中不易失活，具有重要的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

本发明采用以超临界二氧化碳萃取得到的新疆昆仑雪菊油树脂和经反相硅胶色谱制得的红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，采用反相硅胶纯化得到的cAMP粗品，制备的环磷酸腺苷纯度达到了44.69%，以超临界二氧化碳萃取制备获得新疆昆仑雪菊油树脂，以雪菊油树脂为基质，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，采用环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊中，含有环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％和壁材1%，其中壁材中，0.4%的明胶、0.2%的甘油和0.4%的水，经配伍后制备的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊不仅具有安全无毒、性质稳定等优点，还具有降血压、抗氧化等保健功效和很好的抗菌消炎作用，具有广泛的应用价值。

本发明具体提供了一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备方法，具体制备方法步骤如下：

（1）环磷酸腺苷的制备：采用反相硅胶纯化制备获得环磷酸腺苷，环磷酸腺苷纯度达到了44.69%。

（2）雪菊油树脂的制备：以超临界二氧化碳萃取制备获得新疆昆仑雪菊油树脂。

（3）以步骤（2）制备的新疆昆仑雪菊油树脂和步骤（1）制备的红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，以雪菊油树脂为基质，以红枣环磷酸腺苷为辅料，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，采用环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％，制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液；以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，明胶、甘油、水分别按重量比0.4%、0.2%和0.4%的比例配比。

（4）按照上述步骤提供的原料，精确称取雪菊油树脂与蜂蜡，混匀，加热至70℃左右使蜂蜡完全熔融，搅拌冷却至35℃以下，加入以溶解好的大豆卵磷脂，搅拌，加入环磷酸腺苷粉，搅拌均匀，胶体磨研磨均匀，抽真空消去气泡，制备获得环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液，备用。

（5）以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，取明胶、甘油、水按重量比1:0.4:1的比例，即分别将0.4%的明胶、0.2%的甘油和0.4%的水加入水浴式化胶罐，搅拌、熔融，保温1h，抽真空无明显气泡，80目筛网过滤放入胶桶保温≥60℃，静置2～6h；采用软胶囊压制机，填入上述物料，压制出软胶囊，并在湿度为20%的室温条件下吹干，制备获得环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊。

本发明具体提供环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊，通过以雪菊油树脂为基质，以红枣环磷酸腺苷为辅料，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，通过制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液后，采用以明胶、甘油、水作为壁材制备软胶囊；具体以环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％，制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液；以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，明胶、甘油、水分别按重量比0.4%、0.2%和0.4%的比例配比。

进一步，本发明提供环磷酸腺苷的制备方法，具体制备方法步骤如下：

（1）采用超声辅助提取，称取经粉碎过60目筛的次等枣粉，在超声功率为160W、超声时间为12min、枣粉与水按g: mL计料液比为1:12的条件下超声辅助提取，取出后放入80℃的水浴中继续回流提取2.5h。

（2）离心：将步骤（1）中制取的物料置于离心机在3500r/min（条件下离心15min，取上清液，测定上清液中cAMP含量达到497μg/g。

（3）去除多糖：在步骤（2）制取的上清液中加入三倍体积的无水乙醇，沉淀红枣多糖，置于离心机在3500r/min条件下离心15min，取上清液。

（4）过反相硅胶柱吸附：将步骤（3）制备的上清液浓缩到原体积的1/5后按照上样液流速为1mL/min、上样液浓度为70ug/mL、上样液PH为6，过反相硅胶柱子吸附，依次用水、60%的甲醇进行洗脱，洗脱液流速为3mL/min。

（5）旋蒸浓缩：将步骤（4）得到的洗脱液进行浓缩，浓缩温度40℃，转速60rpm。

（6）冷冻干燥：将步骤（5）制取的浓缩液进行冷冻干燥，得到纯化后的cAMP，纯度达到44.69%，过100目筛，备用。

进一步，本发明提供雪菊油树脂的制备方法，具体制备方法步骤如下：

称取过60目筛的雪菊粉，采用超临界CO₂流体萃取工艺，萃取时间为100min、萃取温度为45℃、萃取压力为20Mpa，采用夹带剂为无水乙醇的用量为150mL 、CO₂流量为20L/h的条件下超临界CO₂流体萃取，萃取率达到18.42%过虑，制备获得雪菊油树脂。

本发明采用反相硅胶纯化得到的cAMP粗品的纯度达到了44.69%，与现有技术研究结果相比，纯度有了显著提高。本发明使用纯度为44.69%的环磷酸腺苷与雪菊油树脂进行配伍制备的复合软胶囊，更具有环磷酸腺苷的功能特性。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

（1）本发明提供环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊，采用以超临界二氧化碳萃取得到的新疆昆仑雪菊油树脂和经反相硅胶色谱制得的红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，经配伍后制备的复合软胶囊不仅具有安全无毒、性质稳定等优点，通过定性和胃模拟实验结果表明，本发明提供的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊含有多种活性成分，具有理想的保健作用，且软胶囊中的环磷酸腺苷在胃液中不易失活。还具有降血压、抗氧化等保健功效和很好的抗菌消炎作用。

（2）本发明将环磷酸腺苷与雪菊油树脂进行配伍制备的复合软胶囊不仅具有明显的降血压、抗氧化等保健功能，还具有很好的抗菌消炎作用，更有利于身体健康，具有很高的开发和利用价值。

附图说明：

图1为环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备工艺流程图。

图2为环磷酸腺苷的清除羟自由基(OH·)的能力显示图。

图3为环磷酸腺苷清除DPPH·的能力显示图。

图4为混悬液胃模拟实验结果图，图中，a为胃模拟前的cAMP含量测定图，b胃模拟后的cAMP含量测定图。

图5为叶黄素对照品的液相色谱图。

图6为软胶囊样品1的液相色谱图。

图7为软胶囊样品2的液相色谱图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比。

采用的主要原辅材料及相关试剂材料：大豆卵磷脂：北京美亚斯磷脂技术有限公司；胃蛋白酶：上海蓝季科技发展有限公司；明胶（药用级）：温州梅林正广和有限公司；蜂蜡（药用级）：北京逾世纪科技有限公司；cAMP标准品（色谱纯、纯度为99%）：美国sigma公司；反相硅胶（ODS C18反相硅胶，50目）：加拿大Silicycle公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、青霉、黑曲霉：通过公众渠道获取；甲醇（色谱纯）；甲醇（分析纯）；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒，邻二氮菲、2,2-二苯基-1-苦味酰苯肼(DPPH)、Vc、FeSO4、磷酸二氢钾、碘化钾、三氯甲烷、正己烷、双氧水等均为分析纯。

采用的主要仪器设备：匀浆机（金坛市医疗仪器厂）；高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；FD-1-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SW-CJ-2FD洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；QP2010气相色谱-质谱联用仪（上海-恒科技有限公司）；GMSX-280手提式压力蒸汽消毒器（北京市永光明医疗仪器厂）；512GD紫外-可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；H-1微型混合器（上海康禾光电仪器有限公司）等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊的制备

一、环磷酸腺苷的制备

1、工艺流程：参见附图1，本发明环磷酸腺苷的制备工艺流程采用：次等栆粉→称取样品→加入溶剂水→搅拌均匀→超声辅助提取→离心→上清液→多糖沉淀→浓缩→过反相硅胶柱吸附→水洗→用甲醇洗脱→旋蒸浓缩→冷冻干燥→cAMP。

2、操作要点

（2）离心：将步骤（1）中制取的物料置于离心机在3500r/min条件下离心15min，取上清液，测定上清液中cAMP含量达到497μg/g。

二、雪菊油树脂的制备

1.工艺流程：参见附图1，本发明雪菊油树脂的制备工艺流程采用：雪菊粉→称取样品→加入溶剂→搅拌均匀→超临界CO2流体萃取→收集油树脂→旋蒸乙醇→雪菊油树脂。

2.操作要点：称取过60目筛的雪菊粉，采用超临界CO₂流体萃取工艺，萃取时间为100min、萃取温度为45℃、萃取压力为20Mpa，采用夹带剂为无水乙醇的用量为150mL 、CO₂流量为20L/h的条件下超临界CO₂流体萃取，萃取率达到18.42%过虑，制备获得雪菊油树脂。

三、环磷酸腺苷与雪菊油树脂混悬液生产技术路线

参见附图1，以上述步骤制备的新疆昆仑雪菊油树脂和红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，以雪菊油树脂为基质，以红枣环磷酸腺苷为辅料，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，采用环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％，制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液；分别以0.4%的明胶、0.2%的甘油和0.4%的水作为制备软胶囊的壁材。

参见附图1，按照上述步骤提供的原料，精确称取雪菊油树脂与蜂蜡，混匀，加热至70℃左右使蜂蜡完全熔融，搅拌冷却至35℃以下，加入以溶解好的大豆卵磷脂，搅拌，加入环磷酸腺苷粉，搅拌均匀，胶体磨研磨均匀，抽真空消去气泡，制备获得环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液，备用。

四、环磷酸腺苷与雪菊油树脂软胶囊生产技术路线

参见附图1，以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，取明胶、甘油、水按重量比1:0.4:1的比例加入水浴式化胶罐，搅拌、熔融，保温1h，抽真空无明显气泡，80目筛网过滤放入胶桶保温≥60℃，静置2～6h；采用用软胶囊压制机，填入上述物料，压制出软胶囊，并在湿度为20%的室温条件下吹干，获得环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊。

实施例二：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊制备

参见附图1：配方：制备500g混合液中，拟定的环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊的最佳配方为：环磷酸腺苷粉60g、雪菊油树脂395g、蜂蜡25g、大豆卵磷脂20g和1 g壁材料。

制法：精确称取雪菊油树脂与蜂蜡，混匀，加热至70℃左右使蜂蜡完全熔融，搅拌冷却至35℃以下，加入以溶解好的大豆卵磷脂，搅拌，加入环磷酸腺苷粉，搅拌均匀，胶体磨研磨均匀，抽真空消去气泡，备用；按照闻茂等人的软胶囊制法工艺做壁材，壁材取明胶、甘油、水按1:0.4:1的比例加入水浴式化胶罐，搅拌、熔融，保温1h，抽真空无明显气泡，80目筛网过滤放入胶桶保温(≥60℃)，静置2～6h。用软胶囊压制机，填入上述物料，压制出软胶囊。在湿度为20%的室温条件下吹干。

获得环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊的最佳工艺配方：环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，蜂蜡5%，大豆磷脂4%。

采用雪菊油树脂作为混悬基质，5%蜂蜡作为助悬剂，4%大豆卵磷脂作为湿润剂，环磷酸腺苷干粉碎度在100目以下时，混合液质均稳定，放置考察一个星期，混合液均不分层。采用上述工艺所制得的环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊，完全符合2010年版《中国药典》的规定，工艺稳定，质量可控，适合于工业生产。

实施例三：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的原辅料的配比

一、环磷酸腺苷与雪菊油树脂配比的选择

取过筛后的环磷酸腺苷粉，按照以下配比，研磨研匀，比较内容物状态，同时观察药液流动性、稳定性，分布均匀性，取环磷酸腺苷粉与雪菊油树脂分别按1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5和1:7的比例混匀，观察药液的流动性和均一性。环磷酸腺苷与雪菊油树脂配比的选择结果见表1

表1：环磷酸腺苷粉与雪菊油树脂配比的试验结果

Figure 201310493403X100002DEST_PATH_IMAGE001

由表:1可知，当环磷酸腺苷与雪菊油树脂的比例为1:6.5时药液粘稠度适中，流动性好，药物分布均匀，符合软胶囊灌装要求，故环磷酸腺苷与雪菊油树脂的最佳配比确定为1:6.5。

辅料的选择：为了保证大规模工业化生产，软胶囊混悬介质的药物与辅料混合时必须具有适当的流动性，同时也必须具备良好的物理稳定性。目前，最常用的混悬基质是植物油或者植物油加PEG或非离子表面活性剂等。当PEG在胶囊壳内作为基质时，会吸收胶壳的水分，引起胶囊中的内容物重量增重大概10％左右，并产生囊壳老化、变硬及药物成分迁移到胶壳外等等不良问题。一般植物油是软胶囊中最适合的基质，且雪菊油树脂含有丰富的亚油酸和亚麻酸，具有降血压、降血脂等功效，因此选择雪菊油树脂作为基质。

二、湿润剂和助悬剂的选择及用量

以流动性，切断性，沉降比为考核指标选择合适的湿润剂和助悬剂及其最佳用量。

1、流动性：以药勺取适量混合液，药勺与水平面成450角，肉眼观察混合液从药勺上滴下的情况。

2、切断性：混合液即将滴完时，液滴很快收缩，而不呈长丝状。

3、沉降比：已准备好的混合液置于离心试管中，量取液面高度(h₁)，以500r/min离心25min后，油/固分层，测量混悬液固体高度(h₂)，沉降比=h₂ / h₁×100％。

通过试验，湿润剂和助悬剂的选择结果见表2。根据混悬液的沉降公式(Stock's公式)，增加介质粘度，或减小粒径，均可减小沉降速度，从而提高混悬液的稳定性。预试结果显示，环磷酸腺苷与雪菊油树脂混合，环磷酸腺苷很快沉积，流动性较差，难以起到理想的效果，因此要选用合适的助悬剂和湿润剂。

蜂蜡为软胶囊中常用的助悬剂，大豆卵磷脂为优良的乳化剂和湿润剂，实验结果证明，配合使用助悬剂与湿润剂较单一使用效果更好。因此我们选用蜂蜡作助悬剂，大豆卵磷脂作湿润剂进行试验，结果见表2。

表2 助悬剂和湿润剂的选择结果

蜂蜡	大豆卵磷脂	流动性	切断行	沉降比
					3	1	_	_	70%
3	2	+	+	83%
					5	3	++	++	92%
5	4	++	++	100%
					6	4	+	++	100%

注：“一”表示差，“+”表示好，“++”表示很好。

由实验结果可知：蜂蜡用量为5.0％，大豆卵磷脂用量为4.0％时，制备得的混合液的流动性、切断性及稳定性最佳。因此，确定该比例为助悬剂和湿润剂的最佳比例。

实施例四：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊混悬液的定性分析

一、试管预试法：将环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊混悬液置于洁净试管中，加入检测试剂观察反应现象。

二、圆型滤纸层析法(PPC)：取直径20厘米的圆形滤纸一张，画成8瓣，在距圆心1厘米处点样，1-8瓣分别点检液，待溶剂挥散后，于圆心处穿一纸芯，将滤纸夹于两个培养皿中间，以95%的乙醇展开，待溶剂展至近边缘时，取出滤纸，溶剂挥发后，再按虚线将圆形滤纸剪成8瓣，各瓣喷不同的显色剂。

三、环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊混悬液的定性试验结果

表3 混悬液化学成分试管法的定性检测结果

Figure 201310493403X100002DEST_PATH_IMAGE003

注：++ 为正反应明显，+为有正反应，-为无反应。

表4 软胶囊化学成分纸层析的定性检测结果

Figure 201310493403X100002DEST_PATH_IMAGE005

注：“+”表示试验结果为阳性，“-” 表示试验结果为阴性

由表3、4可知，初步推测环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊中含有多种活性成分，试验中检出氨基酸、蛋白质、糖、酚类、有机酸、黄酮类、挥发油、蒽醌类和强心苷，而香豆精类和生物碱等物质在试验中未检出。试验结果表明，环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的营养成分丰富，含有多种起保健作用的活性成分，具有很大的开发与研究价值。

实施例五：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊混悬液的体外胃模拟实验

一、软胶囊混悬液的体外胃模拟实验

首先测软胶囊混悬液中的环磷酸腺苷含量，然后分别取0.05g混悬液置于三角瓶中，各加入点活力单位为(1:3000)的胃蛋白酶，再加pH值为1.4的0.05mol HCl-KCl缓冲液30m1，在37℃条件下恒温摇床上保温3h后再测混悬液的环磷酸腺苷含量，将前后两次的环磷酸腺苷含量进行比较，同时做平行试验。

二、混悬液体外胃模拟实验结果

正常人体的肠道的PH为7左右，在中性PH范围内，所以在肠道内没必要担心环磷酸腺苷的活性失活问题，但是正常人体的胃液的PH为0.8~1.6，酸性比较大，所以我们通过模拟胃液来研究cAMP在胃液中活性稳定性问题。由图5可知，胃模拟前后混悬液的cAMP含量的差别极微，可以忽略不计，表明胃液对混悬液中的cAMP的活性无影响。

参见附图4，定性和胃模拟实验结果表明：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊含有多种活性成分，具有理想的保健作用，且软胶囊中的环磷酸腺苷在胃液中不易失活。

实施例六：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊叶黄素含量测定

采用高效液相色谱法测定软胶囊中叶黄素含量。

（1）液相色谱条件：色谱柱为Ultimate AQ-C18（4.6×250 mm；5μm)；流动相：V(乙腈)-V(甲醇)=95：5，流动相经过0.45μm的微孔滤膜过滤和超声波脱气处理；流速0.8 mL/min，检测波长446 nm，进样量为5μL。

（2）标准溶液的配制：用电子天平（精确至0.0001g）称取0.0118g的叶黄素对照品，用95%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，则所配母液浓度为212.4mg/mL，待用。用移液管分别从上述配制好的母液中移取0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 mL置于25 mL容量瓶中，用95％的乙醇稀释至刻度，摇匀。以上述条件下，进样5μL，以峰面积（Y）对溶度（C）作图，得到回归方程为：y=55623x-2012，r=0.9995，线性范围为2.58~10.21 μ/mL。

（3）样品的提取：准确称取样品软胶囊13.9mg，置于50mL烧杯中，再用95%乙醇洗入25mL容量瓶中，使之溶解并稀释至刻度。过0.45μm滤膜，待仪器稳定后，上液相测定，结果见图5、图6和图7，图5为叶黄素对照品的液相色谱图，图6和图7为软胶囊样品的液相色谱图。

参见附图5至图7可知，通过计算得到环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊中叶黄素的含量为116 μg/g。

实施例七：环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的质量指标

按照上述实施例制备的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊应符合以下感官要求、理化指标、微生物指标及营养成分指标。具体见表5、6、7、8.

表5 感官要求

项目	指标
		性状	软胶囊
气味	本品特有气味
		滋味	本品特有滋味
色泽	本品特有色泽

表6 理化指标

项目	指标
		铅（以Pb计，mg/kg） ≤	0.1
砷（以As计，mg/kg） ≤	0.1
		酸价（KOH），mg/g ≤	16.0
过氧化值，g/100g ≤	16.5

表7 微生物指标

表8 营养成分指标

项目	指标
		水分及挥发物，% ≤	0.3
环磷酸腺苷，g/g ≥	0.05
		总黄酮含量（以芦丁计），mg/100g ≥	34.9
亚油酸，g/100g ≥	30
		亚麻酸，g/100g ≥	10
叶黄素， ug/g ≥	116

实施例八：环磷酸腺苷抗氧化活性研究

（1）试剂的配制

分别配制浓度为0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL的纯化前粗cAMP溶液和纯化后粗cAMP溶液待用，用去离子水配制浓度分别为0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL的Vc溶液。

（2）cAMP清除羟自由基(OH·)能力的测定

在10mL的具塞试管中分别加入4mL pH7.4磷酸钠缓冲液，1.5mL 5mmol/L邻二氮菲溶液充分混匀。再加入1mL 7.5mmol/L FeSO₄溶液，立即混匀。分别加入（1）中浓度的样品1mL混匀。加1.5mL双蒸水补充体积，然后加入1.0mL 1%H₂O₂溶液，于37℃水浴保温60min。在536nm处测定吸光度。做三个平行样，并以抗坏血酸（Vc）为阳性对照。

清除率%=[（A加药-A损伤）/（A未损-A损伤）] ×100

其中，A加药：加入试样和双氧水后测得的吸光度；A损伤：加入双氧水而不加试样的吸光度；A未损：不加试样和双氧水时测得的吸光度。

参见附图2可知，纯化后粗cAMP和纯化前粗cAMP均具有清除OH·能力，但纯化后粗cAMP能力更强，且随着浓度的增加，其清除自由基能力逐渐增强。实验所得IC50值分别为：纯化前粗cAMP 22.30×10^-4 mg/mL、纯化后粗cAMP 5.24×10^-4 mg/mL、Vc 2.46×10^-4 mg/mL。说明cAMP的纯度对其清除自由基能力影响较显著，纯化后粗cAMP的OH·自由基清除能力接近于维生素C。

（3）cAMP清除DPPH·能力的测定

在25mL的具塞试管中分别精确加入2mL （1）中浓度的样品，然后分别加入2mL 2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液，摇匀后静置30分钟，在 517nm处测定吸光值，空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液作空白调零，并以抗坏血酸（Vc）为阳性对照。根据下式计算清除率：

清除率%=〔Ac –（Ai–Aj）/Ac〕×100

其中，Ai：样品液与DPPH· 溶液混合液吸光度；Aj：样品液的吸光度；Ac：DPPH 溶液与各提取试剂的混合液的吸光度。

由附图3可知，与纯化前粗cAMP相比，纯化后粗cAMP清除DPPH·的能力较强，且随着浓度的增大，DPPH·清除能力逐渐增强。实验所得IC₅₀值分别为：纯化前粗cAMP 1.69mg/mL、纯化后粗cAMP 1.59 mg/mL、Vc 1.55 mg/mL，纯化后粗cAMP的DPPH·清除能力随着浓度的增加更接近于维生素C。

（4）cAMP总还原力的测定

操作方法按总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒说明书进行。同时做三个平行样，并以抗坏血酸（Vc）为阳性对照。

试剂1：60mL×1瓶；试剂2：每支粉剂加入蒸馏水120mL充分溶解；试剂3应用液：用前取贮备液用稀释液以1:19稀释，现用现配；试剂4：12mL×1瓶；试剂5：12mL×1瓶。

表9 T-AOC

总抗氧化能力（U/mg样液）=（ODU-ODC）/0.01÷30×N÷Cprot

其中，ODU：测定管吸光度值；ODC：对照管吸光度值；N：反应体系稀释倍数（反应液总体积 / 取样体积）；Cprot：待测样液浓度（mg/mL）。

通过T-AOC测定试剂盒法得到的实验数据计算出总抗氧化能力分别为纯化前粗cAMP 8.88活力单位/mg、纯化后的粗cAMP 19.12活力单位/mg、Vc 26.7活力单位/mg。说明cAMP的总还原力与其纯度成正比。

实施例：雪菊油树脂的成分分析

（1）雪菊油树脂理化指标测定

酸值参照GB/T5530-2005酸值的测定方法测定，过氧化值参照GB/T5538-2005过氧化值的测定方法测定，皂化值参照GB/T5534-2008动植物油脂皂化值的测定方法测定，不皂化物参照GB/T35.2-2008动植物油不皂化物的测定方法测，碘值参照GB/T5532-2008动植物油脂碘值的测定方法测定。

（2）雪菊油树脂成分的测定

采用超临界流体萃取油树脂。所得油树脂用无水硫酸钠脱水，过滤后量取体积。取适量油树脂用正己烷溶解稀释为体积分数0.1％用于气相色谱-质谱联用分析。样品测定前置于一25℃下密封贮存。

采用气相色谱-质谱联用（GC-MS，QP2010）进行成分分析。

GC条件：色谱柱为RTX一50石英毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；载气为高纯氦(99.999％)；柱流量1mL/min；不分流进样；进样口温度220℃；传输线温度210℃；进样量1μL。程序升温，柱温40℃(1min)[10℃/min]200℃(3 min)。

MS条件：电离方式EI，电子能量70 eV，发射电流100mA，离子源温度200℃，质量扫描范围(m/z)50～350，溶剂延迟4min。C₈～C₂₂系列正烷烃均以体积分数0.1％用正己烷溶解，与上述GC条件一样进样测定。

对雪菊油树脂分离，检测，对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得质谱图，将其经计算机WILEY7.LIB威利标准谱库数据系统分析处理，确定样品的组成。定量结果以GC的峰面积计算，按峰面积归一画法计算各组分相对百分含量。雪菊油树脂被GC分离的各成分用下面的线性升温公式计算其KI值[31]：

式中：n一正烷烃的碳原子数；

一被测物质x的保留时间，min；

一碳原子数相差为1的正烷烃的保留时间（

<

），min。

（3）雪菊油树脂总黄酮含量测定

标准曲线的绘制：将芦丁于120℃下减压干燥至恒重，准确称取芦丁标准样品12 mg，用80％乙醇溶解，定容于100mL，得浓度为0.1200 mg/mL芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于25mL具塞比色管中，用80％乙醇溶液补充至12.5 mI，加入5％NaNO₂溶液0.7 mL，摇匀，放置5 min后，加入10％AI(NO₃)₃溶液0.7mL，摇匀，放置6 min后再加入1 mol/LNaOH溶液5.0mL，再用80％乙醇定容至刻度，摇匀，以上述试剂为为空白对照，10 min后用1 cm比色皿于510 nm波长处测定吸光度A。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到的回归方程为：y=9.2738x-0.0042，R2 =0.9996，在0.009~0.048mg/mL范围内呈良好的线性关系。

总黄酮测定：取样品5.0 mL，用80%乙醇定容至50mL，作为样液。取样液2.0mL于25mL具塞比色管中按照上述方法测量吸光度，计算出提取液中总黄酮含量T。总黄酮含量计算公式如下：

其中：T—雪菊油树脂总黄酮含量（mg/mL）（以芦丁计）

C—经回归方程计算得出的总黄酮含量（mg/mL）

V1—样品体积（mL）

V2—样品定容后的体积（mL）

V3—取定容后样液的体积（mL）

V4—具塞比色管的定容体积（mL）

经上述测定后得知，雪菊油树脂中总黄酮含量为8.84 mg/mL。

表10雪菊油树脂的理化指标

酸值、碘值、过氧化值、皂化值是油脂的重要的性能指标，通过酸值等的测定可以了解油脂的质量。一般来讲，油脂精油中游离酸的含量很小，但若加工不当或贮存时间过长，油脂精油成分分解、水解或氧化，都会使其游离酸的含量增大，香料品质下降。

本实验所得雪菊油树脂的不皂化物含量为0.48%，表明其不皂化物含量较低。雪菊油树脂酸值为90（mgKOH/g），碘值为107.69（g/100g），过氧化值为76（meq/kg）表明其含游离脂肪酸程度低，油脂质量较高。雪菊油树脂皂化值为132.8（mg/g），以棕榈油199.5（mg/g）为参考，皂化值较低，油脂质量较好。

雪菊油树脂成分的测定结果见表11。

表11雪菊油树脂GC/MS 分析结果

由表11可知，雪菊油树脂中包含了脂肪酸类、醇类、烃类化合物，但脂肪酸类成分占大多数，其中不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸的相对含量最高，达45.9%。由此可知，雪菊油树脂中含有丰富的亚油酸和亚麻酸。

Claims

1.一种环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下：

（1）环磷酸腺苷的制备：采用反相硅胶纯化制备获得环磷酸腺苷，环磷酸腺苷纯度达到了44.69%；

（2）雪菊油树脂的制备：以超临界二氧化碳萃取制备获得新疆昆仑雪菊油树脂；

（3）以步骤（2）制备的新疆昆仑雪菊油树脂和步骤（1）制备的红枣环磷酸腺苷为基础有效成分，以雪菊油树脂为基质，以红枣环磷酸腺苷为辅料，添加大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，采用环磷酸腺苷和雪菊油树脂的配比为1:6.5，环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％，制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液；以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，明胶、甘油、水分别按重量比0.4%、0.2%和0.4%的比例配比；

（4）按照上述步骤提供的原料，精确称取雪菊油树脂与蜂蜡，混匀，加热至70℃左右使蜂蜡完全熔融，搅拌冷却至35℃以下，加入以溶解好的大豆卵磷脂，搅拌，加入环磷酸腺苷粉，搅拌均匀，胶体磨研磨均匀，抽真空消去气泡，制备获得环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液，备用；

（5）以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，取明胶、甘油、水按重量比1:0.4:1的比例，即分别将0.4%的明胶、0.2%的甘油和0.4%的水加入水浴式化胶罐，搅拌、熔融，保温1h，抽真空无明显气泡，80目筛网过滤放入胶桶保温≥60℃，静置2～6h；采用用软胶囊压制机，填入上述物料，压制出软胶囊，并在湿度为20%的室温条件下吹干，获得环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊。

2.如权利要求1所述的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备方法，其特征在于，所述的环磷酸腺苷的制备方法具体步骤如下：

（1）采用超声辅助提取，精密称取一定量的经粉碎过60目筛的次等枣粉，在超声功率为160W、超声时间为12min、枣粉与水按g: mL计料液比为1:12的条件下超声辅助提取，取出后放入80℃的水浴中继续回流提取2.5h；

（2）离心：将步骤（1）中制取的物料置于离心机在3500r/min条件下离心15min，取上清液，测定上清液中cAMP含量达到497μg/g；

（3）去除多糖：在步骤（2）制取的上清液中加入三倍体积的无水乙醇，沉淀红枣多糖，置于离心机在3500r/min条件下离心15min，取上清液；

（4）过反相硅胶柱吸附：将步骤（3）制备的上清液浓缩到原体积的1/5后按照上样液流速为1mL/min、上样液浓度为70ug/mL、上样液PH为6，过反相硅胶柱子吸附，依次用水、60%的甲醇进行洗脱，洗脱液流速为3mL/min；

（5）旋蒸浓缩：将步骤（4）得到的洗脱液进行浓缩，浓缩温度40℃，转速60rpm；

3.如权利要求1所述的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备方法，其特征在于，所述的雪菊油树脂的制备方法具体步骤如下：

4.如权利要求1所述的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊的制备方法制备的复合软胶囊，其特征在于，所述的环磷酸腺苷雪菊油树脂复合软胶囊以雪菊油树脂为基质，以红枣环磷酸腺苷为辅料，大豆磷脂为乳化剂、蜂蜡为助悬剂，通过制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液后，采用以明胶、甘油、水作为壁材制备软胶囊；环磷酸腺苷粉12%、雪菊油树脂78%、蜂蜡5％、大豆磷脂4％，制备环磷酸腺苷与雪菊油树脂复合软胶囊混悬液；以明胶、甘油、水作为制备软胶囊的壁材，明胶、甘油、水分别按重量比0.4%、0.2%和0.4%的比例配比。