IT201600112436A1 - Uso di una composizione a base di 5’-ribonucleotidi ottenuti da estratto di lievito come integratore alimentare con attività antiossidante - Google Patents
Uso di una composizione a base di 5’-ribonucleotidi ottenuti da estratto di lievito come integratore alimentare con attività antiossidanteInfo
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
Description
DESCRIZIONE
Campo di applicazione
La presente invenzione si riferisce al settore dell’alimentazione, in particolare alla produzione di integratori e additivi alimentari per il consumo umano.
Più in particolare, la presente invenzione riguarda un nuovo uso di una composizione a base di 5’-ribonucleotidi ottenuti da estratto di lievito come agente antiossidante per man tenere e/o migliorare lo stato di salute del consumatore, proteggendo l’organismo dallo stress ossidativo.
Arte nota
È noto che i ribonucleotidi sono monomeri dell’acido ribonucleico (RNA) costituiti da uno zucchero, ovvero il ribosio, da una base azotata selezionata nel gruppo costituito da adenina, guanina, citosina e uracile, e da un gruppo fosfato in posizione 5’ dell’anello zuccherino (da cui la denominazione di 5’-ribonucleotidi).
Tipicamente, i ribonucleotidi vengono ottenuti in seguito a estrazione dell’RNA da cellule microbiche, di solito batteriche o fungine, RNA che viene successivamente sottoposto a trattamenti fisici, chimici o enzimatici che ne permettono la degradazione nei suoi costituenti monomerici.
I ribonucleotidi sono impiegati ampiamente in diversi campi. Ad esempio, è noto il loro largo consumo nel settore alimentare come esaltatori della sapidità, eventualmente in combinazione con il glutammato di sodio.
È noto anche il loro impiego come sostanze per alimenti destinati ai lattanti e ai bambini nella prima infanzia (REGOLAMENTO (UE) N. 609/2013 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 12 giugno 2013 relativo agli alimenti destinati ai lattanti e ai bambini nella prima infanzia, agli alimenti a fini medici speciali e ai sostituti delTintera razione alimentare giornaliera per il controllo del peso e che abroga la direttiva 92/52/CEE del Consiglio, le direttive 96/8/CE, 1999/21/CE, 2006/ 125/CE e 2006/ 141/CE della Commissione, la direttiva 2009/39/CE del Parlamento europeo e del Consiglio e i regolamenti (CE) n. 41/2009 e (CE) n. 953/2009 della Commissione), in quanto facilitano la maturazione del sistema immunitario del neonato che, dai primi mesi fino a un anno di vita, non produce anticorpi IgG e IgA in risposta a infezioni batteriche o virali (Koletzko B, Baker S, Cleghom G, et al. Global Standard for thè Composition of Infant Formula: Recommendations of an ESPGHAN Coordinated International Expert Group. Medicai Position Paper. Journal of Pediatrie Gastroenterology and Nutrition. 2015. 41:584—599) (Schaller et al., Seminare in Fetal & Neonatal Medicine 2007, 12-35-44).
È noto il coinvolgimento dei ribonucleotidi in numerose funzioni metaboliche nei neonati tra le quali, ad esempio, la mediazione del metabolismo energetico, della trasduzione del segnale e della regolazione generale della crescita delle cellule (Vyh Y. Scientific rationale and benefìts of nucleotide supplementation of infant formula J Pediatr Child Health. 2002. 38:534-549).
È altresì nota la partecipazione di queste molecole organiche a diversi processi che iniziano nei primi mesi di vita, tra i quali sono stati particolarmente approfonditi: il metabolismo delle lipoproteine, l’aumento della concentrazione di lipoproteine ad alta densità (HDL) nel plasma e la sovra-regolazione della sintesi di acidi grassi a lunga catena poiinsaturi (Lanfang W, Jing L, Huan L, et al. Effects of nucleotides supplementation of infant formulas on plasma and eiythrocyte fatty acid composition: a meta-analysis. Plos one. 2015. 10(6): e0127758).
Inoltre, sono noti diversi effetti nutrizionali attribuiti al consumo di ribonucleotidi aggiunti alla dieta di neonati, tra cui la maturazione del tratto gastro-intestinale, in quanto favoriscono un rapido sviluppo dei bifido-batteri (ovvero popolazioni di batteri probiotici) e una riduzione delle popolazioni microbiche di enteropatogeni (Singhal A, Macfarlane G, Macfarlane F, et al. Dietary nucleotides and fecal microbiota in formula-fed infants: a randomized controlled trial. Am J Clin Nutr. 2008. 87(6): 1785-1792).
È noto anche che i ribonucleotidi presentano una attività antinfiammatoria.
In particolare, è stato dimostrato che un particolare nucleotide, composto da ribosio, dalla base azotata adenina e da un singolo gruppo fosfato, noto come 5’-AMP, è un potente regolatore della risposta infiammatoria che può essere impiegato per trattare malattie associate a uno stato infiammatorio (Arthritis: New Insights for thè Healthcare Professional: 2013 Edition, chapter V) (Carregaro V, Sà-Nunes A, Chuna TM, et al. Nucleosides from Phlebotomus papatasi salivary gland ameliorate murine collagen-induced arthritis by impairing dendritic celi functions. J Immunol. 2011. 187(8):4347-4359).
Alla luce delle proprietà benefiche summenzionate connesse al consumo di ribonucleotidi nei alimentazione umana, con particolare riferimento all’alimentazione durante l’infanzia, la Richiedente ha ritenuto interessante approfondire lo studio delle proprietà biologiche di queste molecole organiche, il cui impiego contribuisce al mantenimento di un buono stato di salute dell’individuo che le assume.
È noto che una delle condizioni più pericolose per la salute è rappresentata dallo stress ossidativo.
Lo stress ossidativo è un meccanismo di danno cellulare determinato da un particolare eccesso di sostanze chimiche che comprendono specie reattive dell’ossigeno (ROS, Reactive oxygen species) e monossido di azoto (NO).
La produzione di queste molecole può essere ricondotta all’attivazione di macrofagi in seguito, ad esempio, a un’infezione batterica, virale o fungina, alla presenza di metaboliti secreti da microorganismi, a ferite di tessuti o allo sviluppo di cellule tumorali.
In seguito all’attivazione, i macrofagi secernono diversi mediatori dell’infiammazione, come citochine, metaboliti dell’acido arachidonico, specie reattive dell’ossigeno (ROS) e monossido di azoto (NO).
Tra tutti i fattori in grado di attivare la risposta dei macrofagi, i lipopolisaccaridi (LPS) dei batteri Gram negativi sono quelli più diffusamente studiati. I LPS inducono infatti un rapido rilascio di citochine e altri mediatori dei infiammazione che hanno attività o proinfiammatorie o antinfiammatorie.
In particolare, il fattore di necrosi tumorale (TNF-α) è una citochina nota per il suo ruolo chiave nell’induzione della sintesi di monossido di azoto in risposta all’esposizione a lipopolisaccaridi.
Le specie reattive dell’ossigeno, ROS (note anche come “radicali liberi”) sono specie radicaliche instabili, altamente reattive, caratterizzate dalla presenza di elettrone spaiato nell’orbitale più esterno.
Le forme principali di ROS sono rappresentate da: anione superossido, idrossile, ossigeno singoletto, idroperossidi e perossido di idrogeno.
Nell’ambiente cellulare si producono normalmente radicali liberi ma, quando la formazione di queste specie diventa eccessiva, i ROS possono essere distruttivi, attaccando le macromolecole biologiche componenti fondamentali della cellula, come lipidi, proteine e DNA.
Diversi studi hanno dimostrato il coinvolgimento dello stress ossidativo in diverse patologie, tra cui malattie cardiovascolari e neurodegenerative, alcune forme di cancro, sindrome metabolica e diabete di tipo 2, cataratta e alcuni tipi di malattie infiammatorie quali artrite e vasculite (Ian M. Fearon, Stephen P. Faux. Oxidative stress and cardiovascular disease: Novel tools give (free) radicai insight. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2009. 47:372-381).
Con particolare riferimento etile malattie cardiovascolari, è altresì noto che un alto livello di lipidi ossidati a opera delle ROS, genera danni ai vasi sanguigni fino alla formazione di placche atero sclerotiche, che sono la causa di una grave malattia vascolare cronica e progressiva nota come aterosclerosi.
È noto anche un ruolo dello stress ossidativo cellulare in alcune malattie neurologiche (morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson) e nella distrofia muscolare (Kim GH, Kim JE, Rhie SJ, Yoon S. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Exp Neurobiol. 2015.
24(4):325-340).
Il ruolo delle specie reattive dell’ossigeno, alla base dello stress ossidativo, è stato inoltre riscontrato nella carcinogenesi, in quanto alla base della formazione di numerosi punti di rottura nel DNA e di siti di mutazione lungo la catena dell’acido nucleico.
È nota, a questo riguardo, Timportanza dell’azione di agenti antiossidanti, ovvero di composti o miscele di composti in grado di neutralizzare le specie reattive dell’ossigeno, ovvero i radicali liberi, donando un elettrone alla molecola di ROS ma rimanendo comunque molecole stabili dal punto di vista energetico.
È noto anche il consumo di composti estratti delle piante, come i polifenoli e i pigmenti vegetali che includono flavonoidi, tannini e antocianine che esplicano la loro funzione antiossidante prevenendo l’ossidazione delle lipoproteine (Quinones M, Miguel M, Aleixandre A. Beneficiai effects of polyphenols on cardiovascular disease. Pharmacol Res. 2013. 68(1): 125-31).
È altresì nota l’assunzione nell’alimentazione di co enzima Q10 ottenuto da cereali, soia, noci e vegetali per le sue proprietà antiossidanti con funzione protettiva delle arterie (Ndikubwimana JD, Lee BH. Enhanced production techniques, properties and uses of coenzyme Q10. Biotechnol Lett. 2014. 36:1917-1926).
Gli agenti antiossidanti summenzionati impiegati come integratori nell’alimentazione, presentano tuttavia lo svantaggio di essere particolarmente costosi a causa delle fonti e dei complessi processi di estrazione.
Sommario deirinvenzione
Lo scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione una composizione per l’uso nella riduzione dello stress ossidativo cellulare, con particolare riguardo alla riduzione delle concentrazioni di specie reattive dell’ossigeno e di monossido di azoto.
Tale scopo è stato raggiunto mediante l’uso di una composizione comprendente 5’-ribonucleotidi quale integratore alimentare per il mantenimento e/o il miglioramento stato di salute di un individuo, in cui detto componente esplica un’azione antiossidante tramite la riduzione della concentrazione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e di monossido di azoto (NO).
Preferibilmente la suddetta composizione comprende almeno il 40% in peso dei summenzionati 5’-ribonucleotidi sul peso totale della composizione.
Per 5’-ribonucleotidi si intende una miscela di 5’-ribonucleotidi costituita da adenosina 5’- monofosfato (5’-AMP), citidina 5’-monofosfato (5’-CMP), uridina 5’-monofosfato (5 -UMP) e guanosina 5’-monofosfato (5’-GMP).
La percentuale in peso di 5’-ribonucIeotidi nella composizione secondo l’invenzione (percentuale p/p) è basata sul peso totale della composizione e viene calcolata come percentuale di sale disodico eptaidrato (2Na-7Aq) di 5’-ribonucelotide.
Preferibilmente la composizione comprende da 8% a 14%, più preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, sia di 5’-AMP-Naa*7H20 sia di 5’-UMP-Na2*7H20, da 7% al 14%, più preferibilmente da 9% a 12% e convenientemente 10%, di 5’-CMPNa2*7H20 e da 9% a 15%, più preferibilmente da 11% a 13% e convenientemente 12% di 5’-GMPNa2*7H20, sul peso totale della composizione.
Secondo un aspetto dell'invenzione, la composizione comprende ulteriormente da 15% a 22%, preferibilmente da 17% a 20% e convenientemente 18%, di composti scelti tra nucleosidi e nucleotidi diversi da 5’-ribonucleotidi.
La percentuale in peso di tali nucleosidi e di tali nucleotidi diversi da 5’-ribonucleotidi (percentuale p/p) è basata sul peso totale della composizione, calcolando tali nucleotidi come sali disodici eptaidrati (2Na-7Aq).
I nucleosidi contribuiscono anch’essi all’azione antiossidante e rappresentano la forma nella quale i nucleotidi vengono assorbiti a livello intestinale.
Preferibilmente, la composizione comprende da 1% a 5%, convenientemente da 2% a 3%, di una miscela di amminoacidi sul peso totale della composizione.
Convenientemente, la summenzionata miscela di amminoacidi comprende metionina, cisteina, treonina, fenilalanina, triptofano e lisina.
Infatti, recenti acquisizioni hanno dimostrato che gli amminoacidi sono nutrienti importanti non solo per la sintesi proteica, ma anche in quanto precursori chiave per la sintesi di ormoni e di sostanze azotate a basso peso molecolare, quali poliammine, glutatione, taurina, serotonina. Tra i ruoli svolti dagli amminoacidi e dai loro metaboliti nell’organismo, vi sono la stimolazione della funzione immunitaria, il bilancio acido-base, la osmolarità extra- e intracellulare, le difese antiossidanti, la crescita e lo sviluppo fetale e postnatale, la rigenerazione dei tessuti (Wu G. Amino acids: metabolism, functions, and nutrition. Amino Acids. 2009. 37:1-17).
Secondo un aspetto della presente invenzione, la composizione è ottenuta mediante un processo enzimatico da un estratto di un microorganismo fungino.
Preferibilmente detto microorganismo fungino è un lievito di un genere scelto dal gruppo comprendente Saccharomyces, Kluyveromyces o Candida.
Ancora più preferibilmente, il lievito è Kluyveromyces.
In un ulteriore aspetto, la composizione ha una durata di conservazione di almeno 12 mesi, preferibilmente di 18 mesi.
In un altro aspetto, la presente invenzione concerne un metodo per ridurre e/o prevenire l’ossidazione cellulare in vitro, che comprende l’esposizione di cellule coltivate in un mezzo di coltura a una composizione comprendente 5’-ribonucleotidi in grado di ridurre la concentrazione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno.
In un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda anche un metodo per ridurre e/o prevenire l’ossidazione cellulare in vitro, che comprende l’esposizione di cellule coltivate in un mezzo di coltura a una composizione comprendente 5’-ribonucleotidi in grado di ridurre la concentrazione intracellulare di monossido di azoto.
Preferibilmente, la composizione comprendente 5’-ribonucleotidi secondo entrambi i metodi summenzionati comprende da 8% a 14%, più preferibilmente da 10% a 12%, convenientemente 11%, di adenosina 5 ’-mono fosfato sale disodico eptaidrato, da 8% a 14%, più preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, di uridina 5’-monofo sfato sale disodico eptaidrato, da 7% a 14%, più preferibilmente da 9% a 12%, convenientemente 10%, di citidina 5’- monofosfato sale disodico eptaidrato e da 9% a 15%, più preferibilmente da 11% a 13%, convenientemente 12% di guanosina 5’-monofostato sale disodico eptaidrato sul peso totale della composizione.
Preferibilmente la suddetta composizione è aggiunta al suddetto mezzo di coltura in una concentrazione compresa fra 1 mg/ mi e 2,5 mg/ mi, convenientemente tra 1,25 mg/ml e 2,5 mg/ml.
La Richiedente ha sorprendentemente scoperto l’inattesa capacità della composizione a base di 5’-ribonucleotidi di agire come agente antiossidante all’interno delle cellule, favorendo una sensibile riduzione dello stress ossidativo cellulare.
Infatti, in cellule trattate con la massima concentrazione non citotossica, tale composizione riduce la concentrazione di monossido di azoto intracellulare e la concentrazione di specie reattive dell’ossigeno rispetto a cellule non trattate con la composizione secondo l’invenzione.
Vantaggiosamente, tale composizione comprendente 5’-ribonucleotidi, riducendo i ROS, responsabili della degradazione ossidativa di biomolecole, quali proteine, lipidi e acidi nucleici, aiuta a prevenire danni a carico di tali molecole. Di conseguenza, tale composizione contribuisce a mantenere intatto il doppio strato lipidico che costituisce la struttura della membrana cellulare.
La composizione dell’invenzione ha un potenziale effetto protettivo nei confronti delle summenzionate malattie correlate con l’ossidazione dei lipidi delle membrane cellulari, tra cui quelli dell’endotelio arterioso alla base di stati infiammatori e formazione di placche.
Un ulteriore potenziale vantaggio rappresentato dall’uso della composizione secondo l’invenzione come agente antiossidante consiste nel favorire l’inibizione della formazione di punti di rottura nel DNA, causata da un’alta concentrazione intracellulare di ROS e suscettibile di determinare instabilità genomica e inclinazione alla generazione di mutazioni genetiche sito -specifiche.
E’ noto che una migliorata stabilità genomica favorisce la riduzione dei fenomeni molecolari alla base della cancerogenesi e allo sviluppo incontrollato di cellule tumorali.
Un ulteriore vantaggio della presente invenzione, derivato dalla diminuzione di ROS e di NO nell’ambiente cellulare conseguente aH’uso di tale composizione, consiste nella riduzione di fattori di rischio di malattie neurodegenerative, cardiovascolari e correlate con stati infiammatori acuti e cronici.
Vantaggiosamente, inoltre, l’uso della composizione secondo l’invenzione risulta particolarmente ampio, estendendosi anche all’alimentazione infantile, dove l’utilizzo di alimenti formulati per lattanti addizionati di nucleotidi favorisce il corretto sviluppo della flora batterica intestinale (Singhal A, Macfarlane G, Macfarlane S. Dietaiy nucleotides and fecal microbiota in formula-fed infante: a randomized controlled trial. Am J Clin Nutr. 2008. 87: 1785-1792}, correlata con la risposta immunitaria (Wu HJ, Wu E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3:4-14).
Tutte le percentuali riportate nella presente domanda sono da intendersi, salvo diversa indicazione, come percentuali in peso sul peso totale della composizione.
Figure
Figura 1 rappresenta un grafico della vitalità delle cellule THP-1 determinata mediante saggio MTT, dopo 24 ore di incubazione in presenza di differenti concentrazioni (mg/ mi) di RIBODIET<®>. I valori sono espressi in percentuale rispetto alle cellule di controllo non trattate (n=2, replicati=4) .
Figura 2 rappresenta una tabella dei valori percentuali della vitalità delle cellule THP-1, dopo 24 ore di incubazione in presenza di differenti concentrazioni (mg/ml) di RIBODIET<®>, determinata mediante saggio MTT.
Figura 3 rappresenta un grafico del contenuto di specie reattive dell’ossigeno (ROS) intracellulare, ottenuto secondo un’analisi quantitativa dell’intensità media di fluorescenza (MFI) emessa dalle cellule THP-1 trattate con RIBODIET<®>a due diverse concentrazioni (1,25 mg/ mi e 2,5 mg/ mi) ed espressa in percentuale rispetto al controllo positivo (Ctrl LPS). Ctrl: controllo; LPS: lipopolisaccaridi.
Figura 4 rappresenta una tabella del contenuto di specie reattive dell’ossigeno (ROS) intracellulare, ottenuto secondo un’analisi quantitativa dell’intensità media di fluorescenza (MFI) emessa dalle cellule THP-1 trattate con RIBODIET<®>a due diverse concentrazioni (1,25 mg/ mi e 2,5 mg/ mi) ed espressa in percentuale rispetto al controllo positivo (Ctrl LPS). Ctrl: controllo; LPS: lipopolisaccaridi.
Figura 5 rappresenta un grafico dei valori di monossido di azoto (NO) intracellulare dopo 24 ore dal trattamento con differenti concentrazioni di RIBODIET<®>ed esposizione a lipopolisaccaridi. I valori sono riportati come media (± deviazione standard) delle concentrazioni derivate dai valori di assorbanza dei campioni e interpolando tali valori con la curva standard secondo le istruzioni del fornitore del kit di saggio colorimetrico per monossido di azoto (Oxford Biomedicai Research, codice NB98).
Figura 6 rappresenta una tabella dei valori di monossido di azoto (NO) intracellulare dopo 24 ore dal trattamento con differenti concentrazioni di RIBODIET<®>ed esposizione a lipopolisaccaridi. I valori sono riportati come media (± deviazione standard) delle concentrazioni derivate dai valori di assorbanza dei campioni e interpolando tali valori con la curva standard secondo le istruzioni del fornitore del kit di saggio colorirne trico per monossido di azoto (Oxford Biochemical Research, codice NB98).
Figura 7 rappresenta un grafico dei valori di monossido di azoto intracellulare dopo il trattamento a due differenti concentrazioni di RIBODIET<®>(1,25 mg/ mi e 2,5 mg/ mi) espressi in percentuale rispetto ai valori di monossido di azoto delle cellule non trattate ed esposte a lipopolisaccaridi (Ctrl LPS) .
Figura 8 rappresenta una tabella dei valori di monossido di azoto intracellulare dopo il trattamento a due differenti concentrazioni di RIBODIET<®>(1,25 mg/ml e 2,5 mg/ml) espressi in percentuale rispetto ai valori di monossido di azoto delle cellule non trattate ed esposte a lipopolisaccaridi (Ctrl LPS) .
Descrizione dettagliata
La Richiedente produce da diversi anni una composizione a base di 5’-ribonucleotidi, commercializzato con il nome di RIBODIET<®>come integratore alimentare avente una funzione immuno stimolante e particolarmente indicata per favorire la salute del tratto intestinale.
In considerazione degli effetti benefici riscontrati con l’uso come integratore alimentare della composizione summenzionata grazie alle note capacità antinfiammatorie e immunizzanti e in considerazione anche della facilità di produzione del prodotto RIBODIET<®>, la Richiedente ha pensato di verificare se quest’ultimo prodotto presentasse un effetto favorevole anche sulla riduzione dello stress ossidativo cellulare.
E’ stato effettivamente riscontrato che il prodotto RIBODIET<®>esplica un’azione di riduzione dello stress ossidativo di una linea cellulare testata in vitro e si è rivelato particolarmente utile per ottenere una sensibile riduzione delle concentrazione di ROS e NO intracellulari rispetto alle cellule non trattate con la composizione dell’invenzione, come risulterà evidente dai risultati sperimentali esposti qui di seguito.
Processo di produzione di RIBODIET<®>
Per la produzione di RIBODIET<®>viene impiegato il liquido derivante dal processo di estrazione di DNA da lieviti (ad esempio, dei generi Kluyveromyces o Saccharomyces ) contenente 1<*>RNA.
Tale liquido presenta il 6% ed il 10% di sostanza secca che ha un contenuto di RNA idrolizzabile compreso tra il 60% ed il 90% (metodo Schmidt & Tannhauser) ,
Il liquido viene stoccato in un reattore di produzione, in quantità tale per cui la sostanza secca in esso contenuta sia pari a 500 kg. Si effettua una prima diluizione portando il peso a 6000 kg, mediante aggiunta di acqua osmotizzata e il pH, se necessario, viene corretto fino ad un valore di 5,5.
La massa così ottenuta viene sottoposta ad una prima fase di trattamento termico, portandone la temperatura compresa tra 90°C e 100°C per 20-30 minuti poi viene raffreddata mediante aggiunta di acqua osmotizzata, in quantità sufficiente per abbassare la temperatura fino a 70°C.
Dopo tale operazione, la massa totale presente nel reattore è pari a circa 12500 - 13500 kg (variabile a seconda della temperatura dell’acqua di raffreddamento) .
Il riscaldamento provoca normalmente un abbassamento del pH di 0,2÷Ό,5 punti, pertanto si effettua una seconda correzione mediante aggiunta di NaOH al 30% riportandone il valore in un range compreso tra 5,3 e 5,5.
Le condizioni così ottenute (70°C e pH compreso tra 5,3 e 5,5) sono quelle considerate ottimali per l’attività dell’enzima necessario al fine di idrolizzare l’RNA.
L’enzima viene pesato in ragione dello 0,33% sulla sostanza secca (500 Kg x 0,33% = 1,65 kg di enzima), ed aggiunto all’intemo del reattore previo scioglimento in apposito contenitore con un piccolo volume di acqua osmotizzata (10-15 L).
La durata standard dell’idrolisi è di 10 h, durante le quali il sistema di gestione dell’impianto garantisce il mantenimento della temperatura a 70°C. Il pH invece decrescerà a causa dell’attività enzimatica (di 0,4-0, 7 punti), ma non è prevista una sua ulteriore correzione durante l’idrolisi.
Dopo l'idrolisi, il pH viene portato a 6,30 mediante aggiunta di NaOH al 30% e la massa viene sottoposta a passaggio in centrifuga chiarificatrice, che rimuove eventuali impurità grossolane provenienti dal processo estrattivo e restati nel liquido.
La massa ottenuta dalla centrifuga viene concentrata mediante passaggio su un concentratore, che con l’azione combinata di vapore e vuoto, è in grado di rimuovere una quota di acqua dalla soluzione mantenendo le temperature di esercizio attorno agli 80°C sul primo stadio di concentrazione e decrescenti sul secondo e terzo stadio. Si ottengono quindi circa 1400-1500 L di liquido concentrato, che presenta una sostanza secca pari al 32-37%.
Il liquido concentrato è stoccato in un reattore, con capacità di 3000 kg e dotato anch’esso di sistema di riscaldamento con vapore fluente, nel quale è possibile effettuarne la sterilizzazione alle condizioni di 120°C per 15 min.
Il liquido subisce un raffreddamento a 90°C mediante passaggio di H2O fredda nella camicia del reattore, inserita nella coibentazione.
Successivamente il liquido viene pompato ai impianto di essiccamento spray, da cui si ottiene una polvere di colore beige chiaro, che normalmente presenta titolo in nucleotidi compreso tra il 40% ed il 50%.
TEST 1
È stato condotto un esperimento preliminare per individuare le concentrazioni non cito-tossiche del prodotto RIBODIET<®>, al fine di stabilire un appropriato intervallo di valori del prodotto da utilizzare nei successivi esperimenti.
II test di citotossicità è stato effettuato mediante saggio colorimetrico MTT, verificando la proliferazione e la vitalità cellulare in base alla funzionalità mitocondriale.
Il composto MTT [bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] è un sale di tetrazolio che viene ridotto nell’ambiente mitocondriale, che è tipicamente altamente riducente nelle cellule vive, grazie all’azione della deidrogenasi mitocondriale. La riduzione del composto MTT porta alla formazione di cristalli di formazano, che rendono le cellule di colore viola.
Al contrario, in caso di cellule non vitali, mancando l’attività mitocondriale, 1ΉΤΤ non viene ridotto e le cellule risultano di un colore viola meno intenso.
Basandosi sulla correlazione diretta e dipendente della vitalità cellulare con l’attività mitocondriale, tale saggio viene considerato affidabile per la determinazione della vitalità cellulare.
Nello specifico, monociti della linea cellulare umana THP-1 sono stati trattati con RIBODIET<®>in diluizioni seriali e sono stati incubati. In seguito, è stato aggiunto lTVITT al mezzo di coltura per un determinato periodo di tempo, poi è stato rimosso il mezzo di coltura, le cellule sono state lavate e Usate con DMSO. Il valore di assorbanza di ogni diluizione è stato utilizzato per individuare la concentrazione massima non citotossica del prodotto RIBODIET<®>.
I risultati mostrati nelle figure 1 e 2 mostrano che il prodotto presenta un’attività citotossica solo alla concentrazione testata più elevata, ovvero 5 mg/ mi.
La massima concentrazione non citotossica è di 2,5 mg/ mi, alla quale corrisponde una vitalità cellulare pari al 89,86% rispetto alle cellule non trattate.
TEST 2
In seguito, è stata testata la capacità antiossidante del prodotto RIBODIET<®>in termini di riduzione dei livelli di ROS nelle cellule THP-1.
Per determinare la formazione di ROS, è stato utilizzato il metodo descritto da Boulton et al., (Boulton S. et al., 2011) che si basa sulla trasformazione di diacetato di 2’-7<J>diidro-diclorofluoresceina (H2DCF-DA) in una molecola fluorescente, che avviene esclusivamente in presenza di ROS.
Il meccanismo di funzionamento di questo metodo è basato sul composto H2DCF-DA che viene de-acetilato dalle esterasi nelle cellule e diventa un composto non fluorescente (H2DCF). In presenza di ROS, il composto H2DCF è quindi ossidato e diventa un composto altamente fluorescente, ovvero la diclorofluoresceina (DCF), che può essere rilevata con citometria a flusso e la cui intensità è direttamente proporzionale ai livelli di ROS.
Per effettuare questo esperimento, le cellule THP-1 sono state trattate con due concentrazioni non citotossiche del prodotto RIBODIET<®>e successivamente sono stati aggiunti i lipopolisaccaridi per scatenare la produzione di ROS. Dopo il lavaggio, le cellule sono state quindi incubate in presenza di H2DCF-DA e poi analizzate mediante citometria a flusso.
I risultati riportati nelle figure 3 e 4 mostrano che le concentrazioni testate di RIBODIET<®>determinano una riduzione del contenuto di ROS dopo 24 ore dal trattamento. La riduzione è statisticamente rilevante e corrisponde a circa 60% e 55% dopo trattamento con RIBODIET<®>alla concentrazione di 2,5 mg/ml e di 1,25 mg/ml rispettivamente.
TEST 3
Per approfondire l’attività antiossidante della composizione, è stata testata la capacità del prodotto RIBODIET<®>di ridurre la concentrazione intracellulare di monossido di azoto (NO).
Sono state quindi testate le due concentrazioni massime non citotossiche di RIBODIET<®>, ovvero a 2,5 mg/ mi e a 1,25 mg/ mi e il contenuto di NO è stato valutato mediante l’utilizzo del kit di saggio colorimetrico per il monossido di azoto (Oxford Biochemical Research, codice NB98).
I risultati mostrati nelle figure 5 e 6 evidenziano una riduzione della concentrazione di monossido di azoto nei campioni trattati con una qualunque delle due concentrazioni di RIBODIET<®>rispetto al campione di controllo (Ctrl LPS) .
Esprimendo i valori ottenuti in percentuale, secondo le figure 7 e 8, si può evidenziare una riduzione statisticamente significativa del contenuto di NO nei campioni trattati con RIBODIET<®>ed è possibile apprezzare come la concentrazione di 2,5 mg/ mi del prodotto sia la più efficace tra quelle testate.
Metodi
Preparazione RIBODIET®
In un reattore della capacità di 14000 kg coibentato, dotato di celle di carico e di sistema di riscaldamento mediante passaggio di vapore in una camicia inserita nella coibentazione, è stato stoccato il liquido (sostanza secca pari al 9,15%) contenente TRNA da sottoporre ad idrolisi.
Il processo prevede che la quantità di liquido da caricare nel reattore sia calcolata in modo da avere una sostanza secca pari a 500 Kg e, quindi, sono stati caricati 5464 kg di liquido.
Mediante aggiunta di 536 kg di H2O osmotizzata, la massa è stata portata a 6000 Kg e mantenuta in costante agitazione. Si è provveduto alla correzione del pH a valore di 5,54 mediante aggiunta di NaOH al 30%.
La massa è stata poi sottoposta ad un primo trattamento termico: mediante il sistema di riscaldamento del reattore si è innalzata la temperatura fino a 95°C e mantenuta tale per 20 minuti, con un calo di pH di circa 0,4 punti.
In seguito, la sospensione di RNA è stata raffreddata a 70°C mediante aggiunta di un’altra quota di H2O osmotizzata, raggiungendo una massa totale nel reattore di 13340 Kg. Il pH è stato corretto nuovamente con NaOH al 30% fino ad un valore di 5,5.
Per l’idrolisi, l’enzima utilizzato è una 5’ fosfodiesterasi di origine microbica, in forma di polvere e contante 39.000 U/g (nome commerciale Flavorpro™ 848MDP), aggiunto in quantità pari a 1,65 kg (un dosaggio di 0,33% della sostanza secca presente nel reattore) precedentemente sciolto in 15 L di acqua in apposito contenitore, prima di essere versato nel reattore di produzione.
La durata ottimale dell’idrolisi è stata stabilita in 10 ore. In seguito, il pH della soluzione è stato nuovamente corretto, da 4,81 a portandolo a 6,47 mediante aggiunta di NaOH al 30%.
La soluzione, che presentava una massa pari a 13420 Kg, è stata chiarificata mediante passaggio su una centrifuga chiarificatrice Westfalia, per rimuovere eventuali particelle presenti (7400 giri/ min con alimentazione pari a 2800L/h).
Il chiarificato così ottenuto è stato trasferito ad un concentratore HTE, per la rimozione di una determinata quantità di acqua senza che la soluzione trattata raggiunga temperature eccessivamente critiche per i nucleotidi ottenuti dall'idrolisi.
Tale procedimento è costituito da tre stadi successivi di concentrazione, aventi le seguenti temperature di esercizio:
1° stadio di concentrazione: 80°C
2° stadio di concentrazione: 73°C
3° stadio di concentrazione: 65°C
con una depressione all’intemo dell’impianto pari a - 830 mbar
Si sono ottenuti così 1440 kg di liquido con un secco del 33,5%, stoccati in un reattore della capacità di 3000 kg, anch’esso dotato di sistema di riscaldamento mediante vapore passante in camicia inserita nella coibentazione (ulteriormente utilizzabile per la sterilizzazione del prodotto se necessario) .
Una pompa di alimentazione prelevava poi il liquido dal reattore trasferendolo allo spray dryer.
Le condizioni di essiccamento spray utilizzate erano le seguenti:
temperatura delTaria in ingresso 175°C
temperatura dell’aria in uscita 92°C
giri turbina 16000 giri/min
All<5>uscita dallo spray dryer la polvere è stata raccolta in un big bag, che ha fatto registrare un peso netto pari a 452 Kg di prodotto finito. Il prodotto finito è stato analizzato ed è rilevato un titolo in nucleotidi pari al 46,7% sulla sostanza secca.
Saggio di citotossicità
Le cellule della linea di monociti THP- 1 sono state piastrate ad una densità pari a 5x1 0<4>cellule in ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e trattate con RIBODIET<®>e sue diluizioni seriali 1:2 a partire dalla concentrazione iniziale di 5 mg/ mi.
Dopo incubazione per 24 ore, è stato aggiunto MTT alla concentrazione di 0,75 mg/ mi al mezzo di coltura di ogni pozzetto a 37°C. Dopo 2 ore, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state lavate con PBS (soluzione di tampone fosfato: 0,0 1M di tampone fosfato e 0,1 54M di cloruro di sodio a pH 7,4, Sigma) e lisate con DMSO (100 μΐ/ pozzetto di DMSO al 100%). È stata quindi letta l’assorbanza a 570 nm mediante l’impiego di un lettore di micro - piastre.
La citotossicità cellulare è stata calcolata come differenza percentuale di densità ottica di ogni concentrazione di RIBODIET<®>testata rispetto alle cellule non trattate con il prodotto.
Test dell’attività antiossidante di RIBODIET<®>nella riduzione di ROS.
Le cellule della linea di monociti THP- 1 sono state piastrate in capsule Petri a una densità di 4xl0<5>cellule in 3 mi di mezzo completo e incubate a 37°C, 5% CO2.
Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con RIBODIET<®>alla concentrazione di 1,25 mg/ml e di 2,5 mg/ mi, mentre altre non sono state trattate (controllo negativo dell'esperimento) .
L’incubazione dei campioni è avvenuta per 24 ore a 37°C, 5% CO2e, prima della fine del trattamento, sono stati aggiunti i lipopolisaccaridi (ottenuti da Escherichia coli , Sigma) alla concentrazione di 100 ng/ml in ciascun campione.
Le cellule sono state quindi lavate con PBS (soluzione di tampone fosfato: 0,0 1M di tampone fosfato e 0,1 54M di cloruro di sodio a pH 7,4, Sigma) e incubate con una soluzione di H2DCF-DA a 37°C, 5% CO2.
Dopo la fase di raccolta, sono state analizzate dieci mila cellule per ogni campione mediante analisi con citometria a flusso (Coulter Epics XL) ed è stata misurata la fluorescenza mediante software XL2 .
Test dell’attività antiossidante di RIBODIET<®>nella riduzione di NO.
Le cellule della linea di monociti THP- 1 sono state piastrate a una densità di 5 x IO<4>cellule /pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e trattate con RIBODIET<®>alle concentrazioni di 1,25 mg/ml e di 2,5 mg/ml per 24 ore, a 37°C, 5%C02.
Prima della fine del trattamento, sono stati aggiunti lipopolisaccaridi (da Escherichia coli, Sigma) alla concentrazione di 100 ng/ml ciascun campione.
I surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per determinare i livelli di NO intracellulare mediante il saggio colorimetrico per il monossido di azoto (Oxford Biochemical Research, codice NB98).
Gli standard sono stati ricostituiti con acqua ultrapura e utilizzati per costruire la curva standard.
I campioni sono stati aggiunti in ogni pozzetto in duplicato e il saggio è stato eseguito secondo le istruzioni del fornitore. L’assorbanza è stata letta a 450 nm usando un lettore per micro-piastre.
Analisi statistiche
È stato impiegato un metodo non-parametrico di analisi, adatto alla distribuzione non normale (ovvero non-Gaussiana) dei valori, a causa del numero di dati da analizzare.
Per confrontare i dati della presente invenzione, è stato scelto di utilizzare il test U di Mann-Whitney, poiché permette di confrontare due gruppi e stabilire se le mediane dei due gruppi sono identiche.
Per effettuare il test U di Mann-Whitney, è stato utilizzato un calcolatore online disponibile al sito Social Science Statistic (http: // www. socscistatistics.com/Default.aspx).
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di una composizione comprendente 5<5>-ribonucleotidi quale integratore alimentare per il mantenimento e/o il miglioramento dello stato di salute di un soggetto umano, in cui detto integratore alimentare esplica un’azione antiossidante tramite la riduzione della concentrazione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e di monossido di azoto (NO).
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione comprende almeno il 40% in peso di detti 5’-ribonucleotidi sul peso totale della co mpo sizione ,
- 3. Uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta composizione comprende da 8% a 14%, preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, di adenosina 5’- monofosfato sale disodico eptaidrato, da 8% a 14%, preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, di uridina 5’- monofosfato sale disodico eptaidrato, da 7% a 14%, preferibilmente da 9% a 12% e convenientemente 10% di citidina 5’- monofosfato sale disodico eptaidrato, e da 9% a 15%, preferibilmente da 11% a 13% e convenientemente 12%, di guanosina 5’-monofostato sale disodico eptaidrato, in peso sul peso totale della composizione.
- 4. Uso secondo una qualunque delle rivendicazioni da 2 a 3, in cui la composizione comprende ulteriormente da 15% a 22%, preferibilmente da 17% a 20% e convenientemente 18%, di composti scelti tra nucleosidi e nucleotidi diversi da 5’-ribonucleotidi, in peso sul peso totale della composizione.
- 5. Uso secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la composizione comprende da 1% a 5%, preferibilmente da 2% a 3%, di una miscela di amminoacidi, in peso sul peso totale della composizione.
- 6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta miscela di amminoacidi comprende metionina, cisteina, treonina, fenilalanina, triptofano e lisina.
- 7. Uso secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta composizione è ottenuta mediante processo enzimatico da un estratto di microorganismo fungino.
- 8. Uso secondo la rivendicazione 7, in cui detto microorganismo fungino è un lievito di un genere scelto dal gruppo comprendente Saccharomyces, Kluyveromyces o Candida, preferibilmente il lievito è del genere Kluyveromyces.
- 9. Uso secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detta composizione ha una durata di conservazione di almeno 12 mesi, preferibilmente di 18 mesi.
- 10. Metodo per ridurre e/o prevenire l’ossidazione cellulare in vitro, che comprende l’esposizione di cellule coltivate in un mezzo di coltura a una composizione comprendente 5’-ribonucleotidi in grado di ridurre la concentrazione intracellulare di specie reattive dell’ossigeno.
- 11. Metodo per ridurre e/o prevenire l’ossidazione cellulare in vitro, che comprende l’esposizione di cellule coltivate in un mezzo di coltura a una composizione comprendente 5 ’-ribonucleotidi in grado di ridurre la concentrazione intracellulare di monossido di azoto.
- 12. Metodo secondo le rivendicazioni 10 e 11, in cui detta composizione comprendente 5 -ribonucleotidi comprende da 8% a 14%, preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, di adenosina 5 -monofosfato sale disodico eptaidrato, da 8% a 14%, preferibilmente da 10% a 12% e convenientemente 11%, di uridina 5 -monofosfato sale disodico eptaidrato, da 7% a 14%, preferibilmente da 9% a 12% e convenientemente 10% di citidina 5 -monofosfato sale disodico eptaidrato, e da 9% a 15%, preferibilmente da 11% a 13% e convenientemente 12%, di guanosina 5’-monofo stato sale disodico eptaidrato in peso sul peso totale della composizione.
- 13. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni da 10 e 12, in cui detta composizione è aggiunta a detto mezzo di coltura in una concentrazione compresa fra 1 mg/ mi e 2,5 mg/ mi, preferibilmente tra 1,25 mg/ml e 2,5 mg/ mi.
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