CN104173401A - 一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用，选用生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素，采用微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min；制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效；通过小鼠肝损伤实验表明，从昆仑雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，对CCl4致小鼠肝损伤有一定的保护作用，应用从昆仑雪菊中提取原花青素具有良好的延缓衰老功效，具有广泛的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及原花青素的提取制备的技术领域。具体的说，本发明涉及一种从昆仑雪菊原花青素的提取方法及其应用的制备技术领域。
背景技术
新疆昆仑雪菊，学名为两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria)是菊科金鸡菊属一年生草本植物的干燥头状花序．在新疆主要分布于和田地区海拔高3000米左右的昆仑山区，有较丰富的野生资源。长期以来，昆仑雪菊被当地居民当花茶饮用，新疆维吾尔医院也作为一种维药材应用．具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功，用花泡茶饮，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒，是具有广阔前景和研究价值的新品种。作为药食两用资源，昆仑雪菊在近几年已经成为市场的卖点，已成为人们的高档馈赠礼品。关于昆仑雪菊黄酮研究较多，而对昆仑雪菊原花青素的研究鲜见报道。
原花青素(Procyanidins，PC)是一种黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成的一大类多酚化合物的总称，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。原花青素还具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、美容等，并具有改善人体微循环的功能。原花青素作为植物中一类普遍的次级代谢产物同花色素、生物黄酮等物质一样广泛分布于各种植物的种子、叶子、果实、花和皮、壳等处，目前国内外多从葡萄籽中提取原花青素，其次是从松树皮中提取。而以昆仑雪菊花作为提取原花青素原料，研究其提取方法和含量的文章还未见报道。
动态超高压微射流（DHPM）是一种特殊形式的高压均质技术，它利用高压使液体物料高速流过狭窄的缝隙时受到强大的剪切力、撞击力以及空穴爆炸力等综合作用，使细胞破碎、促进细胞内容物溢出，从而提高有效成分的提取率的过程。目前已有学者研究了DHPM在提取和大分子改性方面的应用，如对马铃薯叶中总黄酮提取及活性影响、木瓜蛋白酶活性的影响、脂肪酸脂质体的制备、对胰蛋白酶的活性、稳定性和构象的影响等，但尚无关于将DHPM技术运用于雪菊原花青素提取的相关研究报道。
发明内容
针对现有技术中未见有关将DHPM技术运用于雪菊原花青素提取的研究和报道，本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，旨在提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用，制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效，具有广泛的应用价值。
本发明提供的技术方案：
本发明以生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素，优化提取工艺，并对提取物进行抗氧化、延缓果蝇衰老作用及对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用的研究，确定了从昆仑雪菊中提取原花青素在延缓衰老中的应用具有良好的效果；制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，是一种天然的抗氧化剂，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效；通过小鼠肝损伤实验表明，从从昆仑雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，对CCl4致小鼠肝损伤有一定的保护作用，应用从从昆仑雪菊中提取原花青素具有良好的延缓衰老功效，具有广泛的应用价值。
本发明具体提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛。
（2）用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50℃烘干2h。
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜。
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次。
（5）动态超高压微射流处理：采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min。
（6）乙醇回流：以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 ℃，回流提取2次，离心并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm。
（7）大孔树脂纯化：AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm；纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76%。
（8）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
进一步，本发明通过体外抗氧化实验表明，对于清除羟基自由基, 抗坏血酸与原花青素的IC50值分别为0.052mg/mL 与 0.045mg/mL；对于清除DPPH·自由基，抗坏血酸与原花青素的IC50值分别为0.003mg/mL与0.025mg/mL，表明原花青素的清除羟基自由基与DPPH·自由基活性比抗坏血酸强；昆仑雪菊原花青素与抗坏血酸的总抗氧化能力IC50值分别为0.002mg/mL与 0.003mg/mL，由此可表明昆仑雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
本发明通过果蝇生存实验结果表明，采用本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素添加量达到0.0067%时雌性与雄性的平均寿命均显著高于相应对照组; 果蝇体内实验测定表明，原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性较对照组显著提高,而MDA含量却显著降低，表明采用本发明提供的动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素具有延缓果蝇衰老的功效。
本发明通过小鼠肝损伤实验结果表明，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素可以减轻实验性肝损伤所致炎性反应，降低肝体指数，降低血清中ALT、AST活性(P<0.05)。由此可得结论，本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素对CCl4造成的实验性肝损伤有保护作用，其机制可能与雪菊原花青素抗氧化作用有关。
本发明提供给了原花青素含量的具体计算方式:
显色剂制备：A液为0.5%香草醛溶液(称取0.500g香草醛溶于甲醇液中，最后定容到100mL)；B液为4%的盐酸液(取4mL浓盐酸溶于甲醇中，定容至100mL )；显色剂：A:B=1:1，现用现配。
原花青素对照品的制备：精密称取原花青素对照品10.0 mg，放置于10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得到浓度是1.0mg/mL的原花青素对照品溶液。
原花青素标准曲线：准确吸取原花青素对照品溶液0.0、0.5 、1.0、1.5、2.0、2.5mL别然后用甲醇定容至l0mL。各取1mL分别加入5mL显色剂，摇匀，避光。在30±1℃恒温水浴中保持30min，保温比色。取出比色管，在λmax=500nm波长下，测定其吸光度，绘制标准曲线。根据原花青素浓度与吸光值的数量关系，绘制出标准曲线。得标准回归曲线方程为： A=0.4066C-0.0018，r=0.9996，说明原花青素浓度在0.050～1.250mg/mL之间呈良好的线性关系。
原花青素含量=2.4594A+0.0044
本发明提供给了原花青素提取得率计算方式：
实验数据采用Minitlab15分析软件进行数据分析，以原花青素提取得率为考察指标原花青素提取得率计算公式：得率/%=[C×V×n/W]×100%
其中：C为根据标准曲线计算出的浓度mg/mL；V为提取液的体积mL；n为样品溶液的稀释倍数；W为样品的质量mg。
本发明采用统计方法利用Minitab15、SPSS17.0、Excel等软件对实验数据进行分析。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
（1）本发明采用动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素，并利用正交实验优化提取工艺，同时对昆仑雪菊原花青素的抗氧化性及延缓衰老作用进行了研究，探讨了雪菊原花青素对小鼠CCl4肝损伤的保护作用；实验结果表明， 动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素的最佳条件是：微射流压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min，此条件下原花青素的提取率为22.29%，纯度为25.68±0.98%，经AB-8大孔树脂纯化后纯度为66.76±0.34%。体外抗氧化实验表明，对于清除羟基自由基, 抗坏血酸与原花青素的IC50值分别为0.052mg/mL 与 0.045mg/mL；对于清除DPPH·自由基，抗坏血酸与原花青素的IC50值分别为0.003mg/mL与0.025mg/mL，表明原花青素的清除羟基自由基与DPPH·自由基活性比抗坏血酸强；昆仑雪菊原花青素与抗坏血酸的总抗氧化能力IC50值分别为0.002mg/mL与 0.003mg/mL，由此可表明昆仑雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
（2）本发明通过果蝇生存实验结果表明，采用本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素添加量达到0.0067%时雌性与雄性的平均寿命均显著高于相应对照组; 果蝇体内实验测定表明，原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性较对照组显著提高,而MDA含量却显著降低，表明采用本发明提供的动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素具有延缓果蝇衰老的功效。
（3）本发明通过小鼠肝损伤实验结果表明，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素可以减轻实验性肝损伤所致炎性反应，降低肝体指数，降低血清中ALT、AST活性(P<0.05)。由此可得结论，本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素对CCl4造成的实验性肝损伤有保护作用，其机制可能与雪菊原花青素抗氧化作用有关。
附图说明
图1为本发明提供的活性研究试验路线图。
图2 显示为乙醇浓度对提取得率及DPPH·清除率的影响图。
图3显示为提取温度对提取得率及DPPH·清除率的影响图。
图4显示为提取时间对提取得率及DPPH·清除率的影响图。
图5显示为微射流压力对提取得率及DPPH·清除率的影响图。
图6 显示为原花青素清除羟基自由基活性图。
图7 显示为原花青素清除DPPH·自由基活性图。
图8显示为原花青素总抗氧化活性图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例,本发明中基本涉及到的%无特别指明都是重量百分比计。
试验原料：昆仑雪菊采自新疆和田的昆仑山区，由新疆和田沙漠玫瑰有限责任公司采摘并提供,由新疆医科大学药学院的胡君萍博士鉴定为菊科金鸡菊品种。学名为两色金鸡菊C．tinctoria，本实验所用的为其干燥的花序；原花青素标准品(纯度95%)，天津市尖峰天然产物研究；AB-8大孔吸附树脂，天津南开大学实验化工厂； 天津建成生物试剂有限公司；2,2-二苯基-1-苦味酰苯肼(DPPH)， 天津市化学试剂三厂；SOD试剂盒、MDA试剂盒 自南京建成生物工程研究所。CCL4，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；联苯双酯（1.5mg/粒），浙江万邦药业股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司。
主要化学试剂：乙醇、甲醇、香草醛、浓盐酸、双氧水、碘化钾、三氯甲烷、邻二氮菲、磷酸纳、硫酸亚铁、石油醚、丙酸、琼脂粉、酵母粉，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁等化学试剂均为分析纯。
实验动物：黑檀体果蝇(Ebony,e) 由新疆大学生命科学与技术学院微生物实验室提供 同济大学生命科学与技术学院鉴定；昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半120只，合格证号No.65000200000072，由新疆实验动物研究中心提供，许可证号SCXK（新）2011-0001。本发明具体采用的活性研究试验路线图参见附图1。
试验仪器：SABA18全自动生化仪，意大利； IKA旋转蒸发仪，广州仪科实验室技术有限公司；V-1100D型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；AL-104电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 ，上海一恒科学仪器有限公司；MDF-382E型超低温冰箱，日本三洋电子生物仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；THZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；FZ102-SIM真空冷冻干燥设备，德国西门子公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-S型恒温水浴锅，巩义市英峪予华有限公司；H-1微型混合器，上海康禾光电仪器有限公司；高速冷冻离心机，德国SIGMA电仪器有限公司；体视显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；隔水式恒温培养箱GHP-9050,上海-恒科技有限公司；985-370 型匀浆器，美国Biospec公司等。
本发明中选用的所有原辅材料，所选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：新疆昆仑雪菊原花青素的提取
本发明具体提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛。
（2）用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50℃烘干2h。
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜。
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次。
（5）动态超高压微射流处理：采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min。
（6）乙醇回流：以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 ℃，回流提取2次，离心并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm。
（7）大孔树脂纯化：AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm；纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76%。
（8）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
实施例二：提取新疆昆仑雪菊原花青素最优工艺的确定
选择浓度为60%(V/V)的乙醇作为提取溶剂，反复浸提两次，以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度温度4个因素做单因素实验，以昆仑雪菊原花青素提取得率和DPPH·清除率为评价提取工艺条件的指标。
1.1乙醇浓度对提取得率及DPPH·清除率的影响
准确称取 1.000g雪菊花粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇浓度放置于4℃冰箱中静置过夜，经30MPa,均质2次后，在微射流压力100 MPa下处理2次，50℃水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH·清除率，结果如附图2所示：
由附图2所示，在乙醇浓度40-60%的范围内，提取得率及DPPH·清除率均呈现增长趋势，随着提取剂用量的增加，原花青素提取得率明显增大，这是因为对于一定量的粉末原料，溶剂用量的增加降低了浓度，增加了原料与溶剂接触面的浓度差，从而提高了原花青素与溶剂的扩散速度，原花青素提取得率升高。此时DPPH·的清除率为78.64%，随着乙醇浓度进一步增加，但是当乙醇浓度超过60%时，原料中的绝大部分原花青素已被溶解出来，提取得率缓慢降低，对DPPH·清除率也有所下降，因此选择60%的乙醇作为溶剂。
1.2提取温度对提取得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g雪菊花粉，处理条件同2.1.1.1，在微射流压力100 MPa下处理2次，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH·清除率，结果如附图3示。
从附图3可以看出，提取温度在20～40℃之间时，随着提取温度的增加，原花青素提取得率相应增大，这是由于升高温度增加了溶剂分子和原花青素分子的动能，促进了原花青素的扩散作用，使原花青素溶出率增大。但当温度超过40℃时变得缓慢降低，这可能是因为温度升高，溶剂的挥发加快，减少了溶剂和原料之间的有效接触面，使出原花青素提取得率下降。且在40℃时，DPPH·的清除率高达88.00%，,因此选择40℃为最佳提取温度。
1.3提取时间对提取得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g雪菊花粉，处理条件同2.1.1.1，在微射流压力100MPa下处理2次，40℃水浴提取10、20、30、40、50分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH·清除率，结果如附图4所示。
由附图4可见，随着提取时间的增加，雪菊原花青素提取得率出现先增加后减小的趋势，当提取时间30min时雪菊原花青素提取得率不再增加反而有所下降。分析原因可能是长时间作用下，有效成分发生降解或者是由于时间过长，造成杂质含量增加，有效成分含量随之下降，从而导致提取得率的降低。其DPPH·的清除率达到78.85%。因此选择30min为最佳提取时间。
1.4微射流压力对提取得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g雪菊花粉，处理条件同上，在微射流压力分别40MPa，60MPa，80 MPa，100MPa，120Mpa下处理2次，40℃水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH·清除率，结果见附图5。
由附图5所示，随着微射流压力的增大，提取得率及DPPH·清除率均呈现显著增长趋势，说明增加微射流压力有利于溶剂渗透到植物细胞内部，加速相互渗透，以增加原花青素在乙醇中的溶解度。在微射流压力上升到100MPa时，DPPH·清除率达到57.32%。随着压力进一步的增大，提取得率及DPPH·清除率都趋于平缓，因此，考虑到仪器的承受负荷，选择100MPa为最佳。
结论：动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素最优工艺为：提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min，此条件下原花青素的提取率为22.29%，纯度为25.68±0.98%，经AB-8大孔树脂纯化后纯度为66.76±0.34%。
实施例三：新疆昆仑雪菊原花青素最优工艺的确定
以乙醇浓度、提取温度、提取时间、微射流压力为自变量设计四因素三水平L9（34）正交优化实验昆仑雪菊原花青素提取工艺。
表1：正交试验结果表
| 序号 | A压力（Mpa） | B提取温度/℃ | C乙醇浓度 | D提取时间 | 提取得率/% |
| 1 | 1（80） | 1（30） | 1（50） | 1（20） | 16.84 |
| 2 | 1 | 2（40） | 2（60） | 2（30） | 17.00 |
| 3 | 1 | 3（50） | 3（70） | 3（40） | 19.80 |
| 4 | 2（100） | 1 | 2 | 3 | 17.70 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 20.40 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 21.90 |
| 7 | 3（120） | 1 | 3 | 2 | 19.30 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 20.30 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 20.70 |
| K1 | 17.880 | 17.947 | 19.680 | 19.313 | |
| K2 | 20.000 | 19.233 | 18.467 | 19.400 | |
| K3 | 20.100 | 20.800 | 19.833 | 19.267 | |
| R | 2.220 | 2.853 | 1.366 | 0.133 |
表:2：正交实验方差分析表
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
| A压力 | 9.433 | 2 | 349.370 | 19.000 | * |
| B温度 | 12.251 | 2 | 453.741 | 19.000 | * |
| C乙醇浓度 | 3.363 | 2 | 124.556 | 19.000 | * |
| D提取时间 | 0.027 | 2 | 1.000 | 19.000 | |
| 误差 | 0.03 | 2 |
由表:1、2可以看出，影响因素主次顺序为：B＞A＞C＞D，以提取温度影响最为显著，其次是压力，再次为乙醇浓度，最小为提取时间。最优组合为A3B3C3D2。即微射流压力120MPa、提取温度50℃,乙醇浓度70%，提取时间30min时提取得率最高。用此最佳工艺进行验证重复三次，平均原花青素提取率为22.29%，纯度为25.68±0.98%。而传统回流提取雪菊原花青素的提取率为10.24%。
结论：动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素最优工艺为：提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min，此条件下原花青素的提取率为22.29%，纯度为25.68±0.98%，经AB-8大孔树脂纯化后纯度为66.76±0.34%。
实施例四：昆仑雪菊原花青素体外抗氧化实验
1.1 清除羟基自由基(·OH) 活性的测定
本试验采用邻二氮菲-Fe2+法，在H2O2+Fe2+=·OH+OH-+ Fe3+体系中，没加入试样前，Fe2+与邻二氮菲形成红色配合物，加入试样后，多酚类化合物与·OH结合，减弱了·OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用，Fe2+,配合物颜色变浅，根据不同浓度的多酚类化合物抗氧化能力不同，从而使体系中Fe2+浓度不同，整个体系的颜色也发生变化，从而引起吸光度的变化。
吸取4mLpH7.4的磷酸纳缓冲溶液，加入1.5mL 5mmol/L的邻二氮菲应用液，充分混匀。再加入1mL 7.5mmol/L硫酸亚铁溶液，立即混匀。加入1mL试样，立即混匀。加入1.5mL双蒸水，以补充体积。最后加入1mL 0.1%的双氧水溶液，轻轻混匀，于37℃水浴中保温1h，然后在536nm处测定吸光度。
清除率：D%=（A0－A1）/（A2－A1）
式中：A0为加入试样和双氧水后测得的吸光值；A1为加入双氧水而不加试样的吸光值；A2为不加试样和双氧水时测得的吸光值。
由附图6可以看出，昆仑雪菊原花青素对反应产生的羟自由基具有较好的清除作用，而且随着浓度的升高其清除作用也随之提高，并呈现一定的剂量效应关系。由附图6可知，抗坏血酸的IC50值为0.052mg/mL，原花青素的IC50值为0.045mg/mL，表明原花青素的清除羟基自由基活性比抗坏血酸强。
1.2 对DPPH·自由基的清除活性的测定
DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其1个N原子上有1个孤对电子，结构中含有3个苯环，它的乙醇溶液呈紫色，它在517nm处有强吸收，当DPPH·溶液中加入抗自由基活性物质时，由于与其孤对电子配对而使其吸收逐渐消失，溶液颜色由紫色向黄色变化，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系。因此，可以通过在517nm处吸光度减弱的程度来评价自由基被清除的活性，抗氧化剂清除自由基的能力越强，其抗氧化活性就越高。
将原花青素母液稀释到浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，取各浓度样液2mL，分别加入2mL，2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液，摇匀后室温下反应30min，在517nm处测定吸光值Ai，空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替色素溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液作空白调零，并以抗坏血酸为阳性对照。
DPPH·自由基的清除率%=〔1–(Ai–Aj)/A0〕×100
A0：为对照组吸光值
Ai ：为样品组吸光值
Aj ：为空白组吸光值
由附图7可以看出，昆仑雪菊原花青素溶液及抗坏血酸溶液都有着较强的清除DPPH·自由基的能力。在浓度为0.01～0.05mg/mL范围内，随着昆仑雪菊原花青素浓度的增加，对DPPH·的清除率不断提高。抗坏血酸的IC50值为0.030mg/mL，原花青素的IC50值为0.025mg/mL，表明原花青素的清除DPPH·自由基活性比抗坏血酸强。
1.3 总抗氧化活性的测定
普鲁士蓝法的原理为：
K3Fe(CN)6 + 样品 → K4Fe(CN)6 + 样品氧化物
K4Fe(CN)6 + Fe3+ → K4[Fe(CN)6]3
在波长700nm条件下测定吸光值A(样品的还原能力与吸光度成正比关系）。
精确吸取不同浓度原花青素溶液1mL，加入2.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲液和2.5mL1% K3Fe(CN)6溶液，混合后在50℃放置20min，加入2.5mL 10%TCA溶液混合后，吸取2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.1%FeCl3溶液2.5mL，混匀，静置10min，在700nm处测定吸光度(A)。以试剂作为空白对照，测吸光度A0。总抗氧化能力可以WA来表示(WA = A-A0)。试验重复3次．最终结果以平均值表示。
在浓度为0.01～0.05mg/mL范围内，随着昆仑雪菊原花青素浓度的增加，其总抗氧化能力不断提高。昆仑雪菊原花青素的总抗氧化能力IC50值为0.002mg/mL，抗坏血酸的IC50值为0.003mg/mL，由此可表明昆仑雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。参见附图8。
结论:随着原花青素浓度的提高,对·OH自由基和DPPH·自由基的清除率也随之提高，其IC50值分别为0.045mg/mL，0.025mg/mL，两者都比抗坏血酸高。原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，是一种天然的抗氧化剂。
实施例五：昆仑雪菊原花青素延缓衰老实验
1.1果蝇培养基的制备
玉米培养基的配制方法( 以100g 饲料为例) :将11.33g 玉米粉倒入250mL烧杯中，加60mL水调成糊状。将0.7g琼脂放入100mL烧杯中，加40mL使其充分溶解，加8g白砂糖煮沸溶解。将上述两种配料混合后煮沸3min，立即加入0.53g酵母浸粉和0.33mL酸，混合均匀。趁热倒入已消毒的试管中，一般倒入厚度为20-30mm，冷却后备用。
1.2受试物剂量梯度选择
按人体推荐摄入量(0.0033g/kg·bw·d)计算实验中间浓度为0.0067% (实验按国家食品药品监督管理局保健食品要求的模型进行，人的推荐剂量为每日0.0033g/kg·bw·d，体重60kg的人每日食物加饮水的量定为3000g那么雪菊原花青素在食物中的浓度为0.0033*60/3000*100=0.0067%，该浓度设定为实验的中间浓度)。在此浓度上下按3倍组距各设1-2个浓度组，即0.0022%、0.0067%、0.0201%、0.0603%四个剂量组。另设1个空白对照组。
1.3果蝇生存试验方法
收集8 h内新羽化的果蝇成虫，乙醚麻醉下区分雌雄，随机分为5组，每组120只，雌雄各半，分装于2.5cm×20cm 的试管内(20只/管)，置于25±1℃相对湿度 45%-75% 的恒温培养箱内。每4d更换一次新鲜配制的培养基。每天观察果蝇生存活动情况并定时记录果蝇死亡数，直至果蝇全部死亡。计算半数死亡天数、平均寿命和平均最高寿命（平均最高寿命按最后死亡的10只果蝇的寿命计算）等指标，并进行统计分析。
1.4 果蝇生存试验
表3： 雪菊原花青素对果蝇寿命的影响
注：显著水平为0.01，各组之间显著性关系用a、b、c等表示。
由表3方差分析结果表明，剂量组和对照组间平均寿命和平均最高寿命均存在显著性差异。当原花青素添加量为0.0067%时，雌雄果蝇的平均寿命和平均最高寿命均达到最高值。
多重比较结果表明，雌性果蝇中，0.0067%剂量组的果蝇平均寿命和平均最高寿命均极显著高于对照组，0.0067%剂量组的平均寿命和平均最高寿命也显著高于其他组，其延寿率分别达到15.49%和10.43%，0.022%、0.067%和0.201%三剂量组的平均最高寿命显著高于对照组；雄性果蝇中，0.0067%和0.0201%剂量组的平均寿命和平均最高寿命均极显著高于对照组，其延寿率分别达到16.77%和14.03%与13.86%和8.91%，4个剂量组的平均最高寿命均显著高于对照组，其中，0.0067%剂量组与其他各组的平均最高寿命也均存在显著差异。由此可见，该受试物具有延长果蝇寿命的作用。
1.5果蝇体内生化指标的测定
按上述果蝇生存试验方法喂饲果蝇30天。依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》 每组果蝇各取重量，加入适量生理盐水，在冰浴中匀浆，制成1%组织匀浆，将制备好的匀浆以3000r /min 离心10～15min，取上清液待测。各实验组果蝇均测定5个样本。按照试剂盒说明测定每组果蝇组织的SOD(羟胺比色法)及MDA含量(硫代巴比妥酸法)。
表4： 雪菊原花青素对果蝇抗氧化酶活性的影响
注：显著水平为0.01，各组之间显著性关系用a、b、c等表示。
由表4方差分析结果表明，剂量组和对照组间SOD活性和MDA含量均存在显著性差异。雌雄果蝇体内的SOD活性随培养基中原花青素浓度的增加呈剂量依赖性显著增加(P < 0. 01)，当原花青素添加量为0.0201%时，雌雄果蝇体内的SOD活性达到最高值。雌雄果蝇体内的MDA含量随培养基中原花青素浓度的增加呈剂量依赖性显著降低 (P < 0. 01)。当原花青素添加量为0.0201%时，雌雄果蝇体内的MDA含量达到最小值。多重比较结果表明，雌性果蝇中，0.0201%剂量组体内的SOD活性极显著高于其他组，而MDA含量极显著低于其他剂量组。雄性果蝇中，0.0201%剂量组体内的SOD活性和MDA含量与对照组有极显著差异。
关于类胡萝卜素对果蝇头部SOD 活性及过氧化脂质含量的影响中类胡萝卜素使果蝇的平均寿命延长12. 4% (雄) 和7. 2% (雌) , 最高寿命延长2. 1% (雄) 和1. 7% (雌)。其效果低于原花青素的功效。
结论:原花青素添加量为0.0067%剂量组的果蝇平均寿命和平均最高寿命较对照组均有显著提高，原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性和MDA含量较对照组分别显著提高和显著降低，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效。
实施例六：昆仑雪菊原花青素对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用实验
1.1 CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立
空白对照组和模型组分别灌胃给予0.2ml/10g的蒸馏水；阳性对照组灌胃给予联苯双酯0.4g/kg；给药组：原花青素A、B、C（低、中、高剂量），分别以蒸馏水配制，每天灌胃给予受试物0.2ml/10g，连续6天。第5天给药1小时后，空白对照组小鼠腹腔注射橄榄油0.2ml/10g，其余各组腹腔注射0.1%的CCl4（橄榄油配制）0.2ml/10g。禁食不禁水24小时，末次给药1小时后，各组依次摘眼球取血[30-31]。见表5
表5：雪菊原花青素对CCl4致小鼠肝损伤实验分组
| 组别 | 剂量（g/kg） | 动物数（只） |
| 空白对照组 | 10 | |
| 模型组 | 10 | |
| 阳性对照组 | 0.40 | 10 |
| 原花青素A(低剂量组) | 0.125 | 10 |
| 原花青素B(中剂量组) | 0.250 | 10 |
| 原花青素C(高剂量组) | 0.50 | 10 |
1.2小鼠体内生化指标的测定
小鼠摘眼球取血，放入Eppendorf管中，3500r/min离心10min，分离血清。按照试剂盒说明测定每组样品的ALT、AST活性。采血后小鼠脱椎处死，立即取肝脏湿重，测定小鼠肝脏系数（肝脏系数=肝重/体重）。
1.3 昆仑雪菊原花青素对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用实验
模型组与对照组比较：血清中ALT、AST显著升高，模型组肝脏系数明显大于对照组。病理检查结果：与空白对照组比较，模型组及给药组小鼠肝脏都出现急性肝损伤反映，表现为：肝细胞坏死、变性（水肿），脂质空泡（脂变），散在的炎性细胞浸润，模型组与各给药组在损伤的程度和范围上无明显差异。以上说明肝损伤模型是成功的。
给药组与模型组比较：原花青素C(高剂量组)ALT和AST活性明显降低，与模型组比较有统计学意义（p<0.05）。结果提示：原花青素C(高剂量组)可降低血清ALT和AST活性，对CCl4致小鼠肝损伤有一定的保护作用。结果见表6、表7。
表6 ： 雪菊原花青素对CCl4肝损伤小鼠体重的影响
| 组别 | 剂量（g/kg） | 实验初体重（g） | 实验终体重（g） |
| 空白对照组 | 19.7±1.5 | 25.8±3.3 | |
| 模型组 | 20.0±1.4 | 25.4±2.0 | |
| 阳性对照组 | 0.40 | 20.0±1.6 | 23.2±1.7 |
| 原花青素A(低剂量组) | 0.125 | 19.6±1.5 | 22.8±2.4 |
| 原花青素B(中剂量组) | 0.25 | 20.0±1.2 | 23.1±1.1 |
| 原花青素C(高剂量组) | 0.50 | 20.6±2.4 | 23.2±1.7 |
表7 ： 雪菊原花青素对CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST和肝脏系数的影响
注：**与空白组比p<0.01; #与模型组比p<0.05
CCl4 致肝损伤是经典的化学性肝损伤动物模型。在CCl4 致急性肝损伤动物模型中，主要的肝损伤机制是脂质过氧化反应。CCl4 在体内一系列酶的作用下，生成三氯甲基自由基（·CCl3）、二氯甲基自由基(·CCl2 )及过氧化甲基自由基( ·OOCCl3 )。产生的这些自由基会攻击位于肝细胞膜上的多不饱和脂肪（Polyunsaturated fatty acid, PUFA），从而引发一系列脂质过氧化反应，导致肝细胞膜通透性改变，肝细胞内的ALT 和AST 等转氨酶就会大量释放到血液中，从而导致血清中这些酶的含量急剧上升。因此，血清中ALT、AST的水平被广泛用作于临床诊断肝脏炎性损伤程度的敏感指标。肝细胞损伤是很多种肝脏疾病共有的病理基础，其中氧化应激过程在肝细胞损伤中占有很重要的地位。因而，对氧化应激导致肝细胞损伤的科学研究便成为治疗肝脏疾病的重要途径之一。
在本实验中，模型组血清中ALT、AST活性明显升高（p<0.01），说明造模成功。与模型组比较，给药组原花青素C(高剂量组)血清中ALT、AST水平降低（p<0.05），表明原花青素能抑制因CCl4引起的小鼠体内转氨酶活性升高，具有保护肝细胞膜，一定程度对抗肝损伤的作用。
昆仑雪菊原花青素对CCl4致急性肝损伤小鼠保护作用的研究，目前国内外尚未有报道。其对肝细胞的保护可能是通过保护细胞膜、清除自由基、抑制脂质过氧化反应来发挥作用的。
结论:通过小鼠肝损伤实验，模型组与对照组比较血清中ALT、AST显著升高，模型组肝脏系数明显大于对照组，证明肝损伤实验造模成功。当原花青素剂量为0.5g/kg(高剂量组)时小鼠血清ALT和AST活性明显降低，说明原花青素可降低血清ALT和AST活性，对CCl4致小鼠肝损伤有一定的保护作用。
实施例七：原花青素含量计算
显色剂制备：A液为0.5%香草醛溶液(称取0.500g香草醛溶于甲醇液中，最后定容到100mL)；B液为4%的盐酸液(取4mL浓盐酸溶于甲醇中，定容至100mL )；显色剂：A:B=1:1，现用现配。
原花青素对照品的制备：精密称取原花青素对照品10.0 mg，放置于10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得到浓度是1.0mg/mL的原花青素对照品溶液。
原花青素标准曲线：准确吸取原花青素对照品溶液0.0、0.5 、1.0、1.5、2.0、2.5mL别然后用甲醇定容至l0mL。各取1mL分别加入5mL显色剂，摇匀，避光。在30±1℃恒温水浴中保持30min，保温比色。取出比色管，在λmax=500nm波长下，测定其吸光度，绘制标准曲线。根据原花青素浓度与吸光值的数量关系，绘制出标准曲线。得标准回归曲线方程为： A=0.4066C-0.0018，r=0.9996，说明原花青素浓度在0.050～1.250mg/mL之间呈良好的线性关系。
原花青素含量=2.4594A+0.0044
实施例八：原花青素提取得率计算
实验数据采用Minitlab15分析软件进行数据分析，以原花青素提取得率为考察指标原花青素提取得率计算公式：得率/%=[C×V×n/W]×100%
其中：C为根据标准曲线计算出的浓度mg/mL；V为提取液的体积mL；n为样品溶液的稀释倍数；W为样品的质量mg。
通过上述各实施例提供采用动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素，通过对昆仑雪菊原花青素的抗氧化性及延缓衰老作用进行了研究，探讨了雪菊原花青素对小鼠CCl4肝损伤的保护作用；实验结果表明， 采用动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素具有良好的清除羟基自由基和抗氧化活性，具有延缓果蝇衰老的功效，并对CCl4造成的实验性肝损伤有保护作用，在延缓衰老中具有良好的应用前景。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (2)
1.一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，其特征在于，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛；
（2）用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50℃烘干2h；
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜；
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次；
（5）动态超高压微射流处理：采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min；
（6）乙醇回流：以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 ℃，回流提取2次，离心并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm；
（7）大孔树脂纯化：AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm；纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76%；
（8）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
2.一种昆仑雪菊原花青素在延缓衰老中的应用。
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
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Granted publication date: 20170419 Termination date: 20190729 |
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