CN105784884A - 一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其属于医学检测技术领域。其核心步骤是采用固体吸附剂特异性吸附血浆中的非极性生物基质，然后采用洗脱液对血浆中氨基酸类成分进行选择性洗脱进而获得内源性氨基酸组分。具体操作流程如下：血浆样品用一定比例的酸化水溶液稀释后，加样到特定的固体吸附剂中，通过优化洗脱溶剂的用量及配比等参数，实现了血浆中内源性氨基酸的选择性洗脱。所获内源性氨基酸组分浓缩后复溶，并在特定的色谱质谱条件下实现一次性多种内源性氨基酸的同步检测。该前处理方法具有操作简便可控、目标物回收率高、重现性好等特点，还避免了血浆中非极性物质对氨基酸定量检测的干扰，提高了检测灵敏度和准确度。

Description

一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法
技术领域
本发明涉及一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其属于医学检测技术领域。
背景技术
氨基酸代谢与许多遗传代谢病的发生有关联。在临床中评价血浆中氨基酸含量的变化对疾病的诊断和治疗具有重要的指导意义。目前血浆中氨基酸的检测前处理方法中，不管是衍生化法还是非衍生化法，液相色谱质谱分离检测时的氨基酸响应和峰型都会受到血浆中蛋白和脂质等众多强非极性生物基质的干扰。血浆样品中这些非极性物质的存在一方面在大批量进样时会造成仪器流路系统及色谱柱堵塞，另一方面在色谱柱上吸附的这些物质会有“携带效应”，造成氨基酸检测定量不准以及分析时间延长等未知问题。而基于血浆样品中常见氨基酸的前处理技术需要新的技术手段方法来满足临床中大批量的血浆样本分析。目前生物体内发现的氨基酸约180多种，这些内源性氨基酸的浓度含量差异很大，且有些含量较小氨基酸对人体健康却很重要。由于氨基酸其结构原因，检测相对困难，当前氨基酸的临床检测手段多数仅局限于参与蛋白合成的20种常见含量较大的自然氨基酸，实际上，不参与蛋白合成的氨基酸在疾病发生过程中也扮演着重要的角色。一个明显的例子就是，Sreekumar等人发现组织中高浓度肌氨酸与前列腺癌高度相关并具有增强癌组织侵袭性和促转移作用。【SreekumarA,PoissonLM,RajendiranTM,KhanAP,CaoQ,YuJetal.Metabolomicprofilesdelineatepotentialroleforsarcosineinprostatecancerprogression.Nature2009;457:910-914.】一次性实现体内更多内源性的氨基酸同时检测对临床的重要性不言而喻。
发明内容
本发明涉及一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，原理是依靠固体吸附剂表面强非极性作用对血浆中非极性生物基质具有强烈的吸附作用。优化前处理过程中溶剂洗脱使用体积和配比等参数，血浆中的内源性氨基酸组分在固体吸附剂上随一定的洗脱液流出，强的非极性基质被保留，实现了对血浆中氨基酸的前处理制备。
一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，包括以下核心方法步骤：1）血浆样品的预处理；2）固相吸附剂处理；3）氨基酸组分的选择性洗脱；4）浓缩复溶检测。
（1）血浆样品的预处理
血浆样品经一次离心后取上层血浆，将血浆与体积分数为5%的酸按体积比1:1混合；经涡旋、超声、二次离心后，取上清液，作为上样溶液；一次离心的离心力介于3000-5000g，二次离心的离心力介于13000-18000g；
（2）固相吸附剂处理
a)装填固体吸附剂小柱：将固体吸附剂装填于固相小柱中，规格为100mg的固体吸附剂装填1mL的小柱中；所述固体吸附剂上烷基基团为CnH2n+1，其中n=1，2，3，4，……，30，或者为这些基团中的两种或多种；固体吸附剂的粒径为5~100um，孔径为60~300nm，比表面积为50~800m2/g；
b)固体吸附剂使用前采用有机溶剂活化，之后加入含有机溶剂和酸的水溶液进行平衡，所述平衡采用的平衡液为含有体积比为5%的有机溶剂和体积比为0.1%的酸的水溶液；活化和平衡过程采用的有机溶剂为异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯、醋酸丁酯中的任意一种或多种组合；所采用的酸为甲酸、乙酸中的一种或两种组合；
c)所有上样溶液上样于固体吸附剂中，完成非极性基质在吸附剂上完全吸附。
（3）氨基酸组分的选择性洗脱
固体吸附剂在上样全部酸化的血浆样品后，洗脱条件采用有机相∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1（体积比）进行洗脱，并收集所有的洗脱液，其中所采用有机相和酸与活化平衡所使用的有机相及酸需一致；
（4）样品浓缩复溶检测
收集到的洗脱液馏分浓缩至干后重溶于0.1moL/L的盐酸中，制成待测样品，适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法；
衍生化检测方法：待测样品用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯衍生后，用液质联用的方法进行检测；液相色谱流动相条件包括A和B：A为含20mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液；流速为0.45mL/min，柱温45℃，色谱柱：XselectHSST32.1×100mm2.5um粒径色谱柱；
非衍生化检测方法：待测样品直接用液质联用方法进行检测；液相色谱流动相包括A和B：A为含10mM甲酸铵、0.2%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1mM甲酸铵、0.2%甲酸的乙腈溶液；流速为0.40mL/min，柱温35℃，色谱柱为XAmide4.6×150mm5μm100A色谱柱。
一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法具体操作流程为：
1）血浆样品，在4℃下，5000g离心3min，取10-500uL的上层血浆与5%的酸水溶液1：1混合进行酸化。混合后样品涡旋30s，并超声3-5min。在4℃下，15000g高速离心3-10min，取所有上清液，作为上样溶液；
2）加入3-5mL纯有机溶剂进行活化，之后再加入3-5mL特定比例的有机溶剂和酸的水溶液进行平衡。
3）上样溶液全部加入固体吸附剂后，加入1mL特定的洗脱液进行洗脱，并收集所有的洗脱液馏分；
4）馏分浓缩至干后重溶于100uL0.1moL/L的盐酸中，然后直接或衍生化后采用串联质谱进行检测。
使用固体吸附剂选择性吸附血浆中非极性生物基质；
血浆样品前处理方法所使用固体吸附剂为硅胶表面烷基键合材料；所使用固体吸附剂上的烷基基团为CnH2n+1(n=1，2，3，4，……,30)中的任意一种或两种或多种组合；所使用的固体吸附剂的粒径介于5~100um，孔径介于60~300nm，比表面积介于50~800m2/g；吸附方式为固体小柱的方式进行吸附，固体小柱规格为100mg/mL。
固体吸附剂处理血浆样品体积介于10uL-500uL；
固体吸附剂使用前采用纯有机溶剂进行活化，所采用的有机溶剂为：异丙醇，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯、醋酸丁酯中的任意一种或多种组合；固体吸附剂并采用溶剂为体积比含5%的有机溶剂和0.1%的酸水进行平衡。平衡和活化采用的有机溶剂需一一对应，平衡采用的酸和血浆酸化采用的酸需一一对应；活化和平衡所使用的溶剂体积介于3-5mL；固体吸附剂在上样全部酸化的血浆样品后，洗脱条件采用有机相∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1（体积比）进行洗脱，所采用有机相和酸与活化平衡所使用的有机相及酸需一致。
本申请的有益效果为：
1.高选择性。针对当前临床血浆检测样品前处理遇到的问题，本发明提出使用烷基键合固体吸附剂进行前处理的方法。血浆样品中非极性成分在烷基键合相上得到吸附保留，氨基酸组分随洗脱剂流出。有效解决了血浆中氨基酸检测前处理存在非极性物质干扰的问题。2.方法简单，所采用的固体吸附剂易于制成96孔SPE板，实现批量化。3.重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定。4.前处理后的氨基酸样品采用衍生化法检测，一次性同时检测51种内源性氨基酸。
附图说明
图1是内源性氨基酸检测相关的血浆样品前处理操作流程图。
图2是血浆样品前处理后的内源性氨基酸组分的串联质谱检测总离子流图。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。实例所用到血浆样品均由辽宁锦州医科大学附属第一医院提供。
1，在衍生化检测实施方式中，前处理制备的样品取10uL和6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯衍生后，用液质联用的方法进行检测。其中液相色谱流动相条件包括A和B：A为含20mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液。流速为0.45mL/min，柱温45℃，色谱柱：XselectHSST32.1×100mm2.5um粒径色谱柱。梯度条件如下：
时间（min） 流速（mL/min) 流动相A（%） 流动相B（%）
0 0.45 98 2
0.5 0.45 98 2
10 0.45 70 30
16 0.45 5 95
17 0.45 5 95
17.5 0.45 98 2
20 0.45 98 2
质谱条件为正离子模式下采用多反应监测检测，参数为离子源温度150℃，毛细管电压3.0kv，源温度150℃，去溶剂温度500℃，去溶剂气流量800L/h，锥孔气流量150L/h。51种氨基酸标准品情况见下表：
氨基酸标准品的MRM条件如下表：
根据液相色谱和质谱条件对51种氨基酸进行标准曲线测定。并根据保留时间以及质谱离子对区别鉴定所有的氨基酸。配置51个氨基酸标准品的浓度如下：0.001ug/mL,0.005ug/mL,0.01ug/mL,0.05ug/mL,0.1ug/mL,0.5ug/mL,2ug/mL,10ug/mL。标准品氨基酸经衍生后，经液质联用检测数据处理后，回归方程如下表：
根据色谱质谱条件进行分析和数据处理，根据外标法计算实例中每种氨基酸的浓度，实现血浆中氨基酸的检测。
2，在非衍生化检测实施方式中，前处理制备的样品直接用液质联用方法进行检测；液相色谱流动相包括A和B：A为含10mM甲酸铵、0.2%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1mM甲酸铵、0.2%甲酸的乙腈溶液；流速为0.40mL/min，柱温35℃，色谱柱为XAmide4.6×150mm5μm100A色谱柱。其中流动相梯度如下：
时间（min） 流速（mL/min) 流动相A（%） 流动相B（%）
0 0.40 5 95
0.5 0.40 5 956 -->
6 0.40 20 80
10 0.40 45 55
13 0.40 55 45
15 0.40 55 45
17 0.40 5 5
20 0.40 5 5
质谱条件采用正离子模式下进行检测，采用分子离子峰及保留时间联合定性，峰面积进行定量。参数为离子源温度150℃，毛细管电压3.0kv，源温度150℃，去溶剂温度500℃，去溶剂气流量800L/h，锥孔气流量150L/h。51种氨基酸标准品系列浓度直接经质谱检测情况见下表：
检测后，根据色谱质谱条件进行分析和数据处理，根据外标法计算实例中每种氨基酸的浓度，实现血浆中氨基酸的检测。
实施例1
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合CH3烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例2
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C2H5烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL甲醇经活化后，再加入4mL体积比为含5%甲醇，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%甲醇，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例3
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层50uL血浆与50uL5%的乙酸酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C4H9烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙醇经活化后，再加入3mL体积比为含5%乙醇，0.1%乙酸酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%乙醇，0.1%乙酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于50uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例4
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的盐酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C8H17烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用4mL丙酮经活化后，再加入3mL体积比为含5%丙酮，0.1%盐酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%丙酮，0.1%盐酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例5
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层50uL血浆与50uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C8H17烷基固定相，粒径100um，孔径300nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于50uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例6
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层20uL血浆与20uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C10H21烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用4mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于20uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例7
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层10uL血浆与10uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C12H25烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙酸乙酯经活化后，再加入3mL体积比为含5%乙酸乙酯，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含10%乙酸乙酯，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于10uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例8
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层300uL血浆与300uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例9
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层所有血浆与500uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C30H61烷基固定相，粒径100um，孔径300nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含30%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于500uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例10
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径50um，孔径180nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含25%ACN，0.2%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例11
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL正丁醇经活化后，再加入3mL体积比为含5%正丁醇，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含10%正丁醇，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例12
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层所有血浆与500uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL醋酸丁酯经活化后，再加入3mL体积比为含5%醋酸丁酯，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%醋酸丁酯，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于500uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例13
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的乙酸酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL甲醇经活化后，再加入3mL体积比为含5%甲醇，0.5%乙酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含30%甲醇，0.5%乙酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例14
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C16H33烷基固定相，粒径30um，孔径100nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例15
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C18H37烷基固定相，粒径10um，孔径60nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例16
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C20H41烷基固定相，粒径30um，孔径60nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例17
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层200uL血浆与200uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C24H49烷基固定相，粒径60um，孔径300nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于200uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。
实施例18
血浆样品500uL，5000g离心后，取上层100uL血浆与100uL5%的甲酸水溶液混合，涡旋30s，并超声3min。在4℃下，15000g高速离心3min，取所有上清液，作为上样溶液。
固体吸附剂（硅胶键合C30H61烷基固定相，粒径100um，孔径300nm）100mg装填与1mL固相小柱中；用3mL乙腈经活化后，再加入3mL体积比为含5%ACN，0.1%甲酸水溶液平衡；然后将上样溶液全部上样，并同时开始接馏分。然后加入体积比含15%ACN，0.1%甲酸的水溶液进行洗脱，洗脱液洗脱后并采用真空泵在-15psi压力下抽干3min。所接取得馏分在4℃下，3000转真空离心浓缩至干。所获取样品重溶于100uL0.1moL/L的盐酸溶液中，衍生经液质联用检测，氨基酸的检测灵敏度得到大幅度提高，可从随机血浆中一次性对51种内源性氨基酸进行检测。

Claims (4)

1.一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）血浆样品的预处理
血浆样品经一次离心后取上层血浆，将血浆与体积分数为5%的酸按体积比1:1混合；经涡旋、超声、二次离心后，取上清液，作为上样溶液；一次离心的离心力介于3000-5000g，二次离心的离心力介于13000-18000g；
2）固相吸附剂处理
将固体吸附剂装填于固相小柱中，规格为100mg的固体吸附剂装填1mL的小柱；所述固体吸附剂为硅胶键合的C1-30的烷基颗粒，固体吸附剂的粒径为5~100um，孔径为60~300nm，比表面积为50~800m2/g；使用前采用有机溶剂活化，再加入含有机溶剂和酸的水溶液进行平衡，所述含有机溶剂和酸的水溶液为含有体积比为5%的有机溶剂和体积比为0.1%的酸的水溶液；
3）氨基酸组分的选择性洗脱
上样后采用酸化的有机溶剂水溶液为洗脱剂，酸化的有机溶剂水溶液中体积比为有机溶剂∶水∶酸=10-30∶89.9-69.9∶0.1；加入洗脱剂后收集所有的洗脱液馏分；
4）样品浓缩复溶检测
收集到的洗脱液馏分浓缩至干后重溶于0.1moL/L的盐酸中，制成待测样品，适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法。
2.根据权利要求1所述的一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法应用于检测氨基酸，其特征在于：所述待测样品适用于采用衍生化检测方法或非衍生化检测方法；
衍生化检测方法：待测样品用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯衍生后，用液质联用的方法进行检测；液相色谱流动相条件包括衍生流动相A和衍生流动相B：衍生流动相A为含20mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，衍生流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液；流速为0.45mL/min，柱温45℃，色谱柱：XselectHSST32.1×100mm2.5um粒径色谱柱；
非衍生化检测方法：待测样品直接用液质联用方法进行检测；液相色谱流动相包括非衍生流动相A和非衍生流动相B：非衍生流动相A为含10mM甲酸铵、0.2%甲酸、1%乙腈的水溶液，非衍生流动相B为含1mM甲酸铵、0.2%甲酸的乙腈溶液；流速为0.40mL/min，柱温35℃，色谱柱为XAmide4.6×150mm5μm100A色谱柱。
3.根据权利要求1所述的一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其特征在于：血浆样品的预处理、固相吸附剂处理、氨基酸组分的选择性洗脱过程中所用的酸是相对应的，所述酸为甲酸、乙酸或盐酸中的一种或多种；血浆样品的预处理、固相吸附剂处理、氨基酸组分的选择性洗脱过程所用的有机溶剂是相对应的，所述有机溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、醋酸丁酯中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，其特征在于：所述处理血浆样品的体积介于10uL-500uL。
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