CN105044222A - 生物活性多肽的分析测试和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法，对发酵乳进行了有效的前处理后，进行胃肠道消化模拟实验，保证尽可能多的得到发酵乳中及其消化产物中的生物活性多肽，特别是浓度低、但具有生物活性的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具有抵抗水解的作用，更利于人体吸收并发挥其生物活性。同时，还建立了一种通过分子量匹配得到预测序列，再通过计算验证预测得到的多肽序列方法。通过这种方法鉴定得到牛奶蛋白来源多肽共119条，除大量已经被报道过的生物活性肽外，还得到了大量未被前人报道过的多肽。该方法能普遍用于复杂基质中生物活性肽的分析鉴定，比如发酵乳及其消化产物。

Description

生物活性多肽的分析测试和鉴定方法

技术领域

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法。

背景技术

迄今为止鉴定生物活性肽常用的方法中，通常以某种生物活性为导向，在每次分离后，鉴定活性并取活性较强部分，再次分离纯化，最终鉴定活性强的部分产物中的多肽。CristianDeGobba等人鉴定来源于羊奶的抗氧化生物活性肽：首先，将水解物通过排阻色谱法分级，用选定的生物活性测定方法测定每部分的活性(如：体外的抗氧化活性)；然后将活性强的部分随后用半制备反相高效液相色谱法进一步分离，进行活性测定；最后，将分离得到的活性最强的部分用液相色谱串联质谱分析鉴定序列。

然而，以生物活性为主导进行分级分离的策略会在每次分离的过程中造成损失，因而忽略了一些低浓度的活性物质。特别是，酸奶在发酵过程中产生一系列复杂多样的多肽混合物，来源于含量不一的牛奶蛋白前体，包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白，它们之间的相对含量之比大约为30:30:10:12:10:4:1，因此采用传统方法来源于低浓度蛋白前体的多肽很难被鉴定得到。

因此，为了得到尽可能多的生物活性物质，本文通过简单的前处理，包括超滤、固相萃取，用模拟人体胃肠道消化实验对处理发酵乳，以保证验证得到的肽在一定程度上具有抵制水解的能力后，不经多次分级分离，直接用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪分析，以期得到更丰富、浓度相对较低的多肽物质。此外，本文还建立了一种鉴定发酵乳及其消化产物中多肽的方法，为低浓度生物活性肽的鉴定奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法，具体包括如下步骤：

1)多肽的粗提：取发酵乳进行低温离心分离，取上清液；

2)多肽的纯化：

c.对步骤1)的上清液进行超滤处理，收集滤液；

d.固相萃取柱分离：收集的滤液采用WatersSep-pakC18固相萃取柱萃取，收集生物活性多肽混合物；

3)多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤2)的生物活性多肽混合物，第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶；

4)将步骤3)得到的产物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱UPLC-MS联用分析，得到生物活性多肽的相对分子量；

5)建立牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库；

6)将步骤4)中UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中进行搜索，得到预测多肽序列；

7)验证生物活性多肽的序列：将步骤6)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图与UPLC-MS得到的实际二级质谱图对比分析，通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情况，确认预测多肽序列是否正确。

较优的，步骤1)所述发酵乳为瑞士乳杆菌发酵乳。

更优的，所述瑞士乳杆菌发酵乳为将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵而获得；所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵培养6～8h；更优选发酵温度37℃，发酵培养7h。

优选的，所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus，CICC6024)。

本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于0.1％。

较优的，步骤1)中，所述低温离心的条件为：4℃，8000～10000rpm，离心15～30min。

较优的，步骤2)a中，所述超滤处理所采用的是截留分子量分别为3kDa的超滤管。

更优的，步骤2)a中，所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心温度为4℃。

较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离，具体方法为：活化和平衡WatersSep-pakC18固相萃取柱；将步骤3)a中收集的滤液进行稀释后上样，采用洗脱液洗脱，收集所得到的洗脱液，即包含生物活性多肽混合物。

较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，所采用的洗脱液为甲醇和ddH₂O的混合液，所述甲醇和ddH₂O的混合液中甲醇与ddH₂O的体积比为80:20，所述甲醇和ddH₂O的混合液中含有0.1％(v/v)的甲酸。

较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，采用甲醇活化WatersSep-pakC18固相萃取柱；优选2ml甲醇。

较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，采用ddH₂O平衡WatersSep-pakC18固相萃取柱；优选2mlddH₂O。

较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，将步骤3)a中收集的滤液进行稀释50倍后上样，采用400ul洗脱液洗脱。

较优的，步骤2)b固相萃取柱分离法中，先采用2mL甲醇活化WatersSep-pakC18固相萃取柱，采用2mLddH₂O平衡WatersSep-pakC18固相萃取柱；上样样品为2mL；将步骤3)a中收集的滤液稀释50倍，采用400μL洗脱液洗脱。

较优的，步骤3)所述两步酶解法具体步骤为将步骤2)得到的含有多肽的混合物溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为1.9～2.1，在36.5～38.5℃的恒温水浴中保温反应60～120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为7.4～7.6，并加入胰酶，于36.5～38.5℃的恒温水浴中保温反应120～180min，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用95～100℃水浴法加热使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。

优选的，第二步酶解液采用95～100℃加热的时间为5min。

较优的，步骤3)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10～30mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶30～50mg/g底物。

更优的，步骤3)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶40mg/g底物。

较优的，步骤6)具体实现的方法为：将UPLC-MS得到的相对分子质量，与已建立的牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中氨基酸序列对应的相对分子量匹对，得到相对分子质量误差在±0.01Da内的生物活性多肽的序列、该序列的相对分子质量以及该序列的具体蛋白来源，以此作为预测多肽序列。

优选的，步骤7)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图是指步骤6)中，所得预测多肽序列的理论二级质谱图。

进一步的，以α-S1-酪蛋白为例，来说明本发明所使用的具体的程序代码：

a)程序和数据库的选择

JAVA+MySQL

b)数据库结构

注意：数据库中保存的quality是氨基酸片段质量乘以10000之后的结果。c)插入氨基酸片段的分析(以α‐S1‐酪蛋白为例)

1.代码片段

d)指定质量范围内氨基酸片段的查询

1.说明

输入是需要查询的质量，输出是质量在给定的质量范围内的氨基酸片段。待查询的质量列表在data.txt中，查询的结果放在result.txt中。

2.代码片段

本发明第二方面公开了前述方法在生物活性多肽鉴别中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)采用本发明的方法，对发酵乳进行了有效的前处理后，共得到1374种低分子量化合物，证实了经本实验室的瑞士乳杆菌发酵得到的酸奶中物质的复杂性以及质谱检测器优越的灵敏度和分离性。

(2)本发明在UPLC-MS分析前，对发酵乳进行胃肠道消化模拟实验，因此最终得到的多肽序列对消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用。

(3)本发明对发酵乳进行了有效的前处理后，进行胃肠道消化模拟实验，保证尽可能多的得到消化产物中的多肽，特别是浓度低的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具有抵抗水解的作用，更利于人体吸收并发挥其生物活性。同时，还建立了一种通过分子量匹配得到预测序列，再通过计算验证预测多肽序列的方法。通过这种方法鉴定得到牛奶蛋白来源多肽共119条，除已经被报道过的生物活性肽外，还得到了大量未被前人报道过的多肽。该方法能普遍用于复杂基质中生物活性肽的分析鉴定，比如发酵乳。

附图说明

图1：发酵乳消化产物质量色谱图

图2：质荷比为615.37Da的质量色谱图及一级质谱图

图3：质荷比为615.37Da的片段的二级质谱匹对图

图4：质荷比为615.37Da的预测多肽az，by断裂情况

图5：质荷比为544.38Da的质量色谱图及一级质谱图

图6：质荷比为615.37Da的片段的二级质谱匹对图

图7：质荷比为615.37Da的预测多肽az，by断裂情况

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1

1.1材料

脱脂奶粉(Fonterra公司)、瑞士乳杆菌CICC6024(北京北纳创联生物技术研究院)、胃蛋白酶(Sigma公司)、胰酶(AB公司)；3kDa超滤管(Millipore公司)、Sep-PackC18(50mg吸附剂)(Waters公司)。

1.2设备

BJ-2CD超净工作台(上海博讯实业有限公司)、LRH-250F生化培养箱(上海恒科技有限公司)、GL-22M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、ALPHA1-2-LD真空冷冻干燥机(Christ公司)、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(Waters公司)、G136T型高压灭菌锅(致微仪器有限公司)、RO15纯水系统(上海雷康分析仪器有限公司)、低温冰箱(Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1样品的准备

取菌种瑞士乳杆菌CICC6024，连续活化2次后，以2％的量接种到12％(W/V)的灭菌脱脂乳中培养，温度37℃，培养时间7h，获得发酵乳。将发酵乳装入离心管中低温离心，离心条件：9000r/min，4℃，30min。离心后弃沉淀，取上清液，并将上清液倒入超滤管中，超滤条件：4800r/min，4℃，30min，离心后超滤液备用。

在固相萃取(SPE)前，取超滤液用ddH₂O稀释50倍，备用。固相萃取条件为：固相萃取小柱先用乙醇(2mL)和水(2mL)活化。上样(2mL)后，用400μL溶液(80:20v/v甲醇/水和0.1％v/v的甲酸)将吸附着的物质洗脱下来。在上述所有步骤中，流速大约保持在1mL/min。洗脱液先用氮吹仪在室温条件下吹至约5-6mL后，真空冷冻干燥成粉末，于-80℃下储存备用。

取冻干后粉末样品进行胃肠道消化模拟实验，具体方法：取1.5mg样品粉末溶于1.5mLddH₂O中，在样品(浓度为1mg/mL)中加入胃蛋白酶(酶：底物＝1:50，w/w)后，将pH调至2.0，37℃水浴90min。随后，将水解产物的pH调至7.5，加入胰酶(酶：底物＝1:25，w/w)，37℃水浴150min。最后，用95℃水浴5min使酶失活停止反应。将样品真空冷冻干燥，存储于-80℃备用。

1.3.2超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用分析

1.3.2.1样品的准备

将1.3.1中得到的样品溶于100μLddH₂O中，离心后吸取上清液置于样品瓶，离心条件：12000r/min，10min，置于-4℃，备用。

1.3.2.2液相色谱条件

仪器：WatersACQUITYUPLC超高效液相色谱仪，色谱柱规格：CSHC18色谱柱，流动相A液：ddH₂O，流动相B液：乙腈溶液，流速：0.4mL/min，温度：45℃，紫外检测波长：220nm，进样量：5μl，梯度条件：0min-2.5min保持99％A液，1％B液；2.5min-5minB液从1％上升至5％，A液从99％下调至95％；5min-10minB液从5％上升至10％，A液从95％下调至90％；10min-17min％B液从10％上升至25％，A液从90％下调至75％；17min-22min，B液从25％上升至40％，A液从75％下调至60％；22min-27min，B液从40％上升至80％，A液从60％下调至20％；27min-29min，B液从80％上升至100％，A液从20％下调至0％，并保持2min；31min-31.5min，B液从100％下调至5％，A液从0％上升至95％；31.5min-32min，B液从5％下调至1％，A液从95％上升至99％；32min-34min，保持99％A液，1％B液。

1.3.2.3质谱条件

离子方式：ES+，质量范围(m/z)：50-2000，毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0，采样锥(V)：35.0，离子源温度(℃))：105，去溶剂温度(℃)：350，锥孔气流量(L/Hr)：50.0，去溶剂气流(L/Hr)：600.0，碰撞能量(eV)：6.0，碰撞气流(ml/min)：0.6，扫描时间(sec)：0.26，内扫描时间(sec)：0.02。

1.3.3多肽序列的鉴定方法

1.3.3.1牛奶来源蛋白氨基酸序列库的建立

蛋白氨基酸序列通过BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)以及《食品蛋白质——结构、性质、功能》搜索补充完成，包括α_s1-酪蛋白(ID：1086-1089，变体A-D)，α_s2-酪蛋白(ID：1090，变体A₁)，β-酪蛋白(ID：1097-1103，变体A₁-A₃，B，C，E，F)，κ-酪蛋白(ID：1117，变体A),α-乳白蛋白(ID：1115，变体B)，β-乳球蛋白(ID：1116，变体A)，乳铁蛋白(ID：1236)，血清白蛋白(ID：1729)。将得到的蛋白氨基酸序列建成一个数据库。

1.3.3.2氨基酸序列质量的匹对

建立匹配程序，将UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶蛋白的氨基酸序列数据库中进行搜索，得到预测多肽序列。该匹配程序通过JAVA程序和MySQL数据库实现，具体实现的要求：输入由UPLC-MS得到的质量，与已建立的数据库中氨基酸序列匹对，输出相对分子质量误差在±0.01Da内的多肽序列、该序列的相对分子质量以及该序列的具体蛋白来源。

1.3.3.3多肽序列的验证

通过Biolynx软件，将1.3.3.2中预测得到多肽序列的理论二级质谱图与MS/MS得到的实际二级质谱图对比分析，软件通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情况，根据计算结果，确认预测多肽。

1.4数据处理与分析

用Masslynx软件处理质谱所得数据，提取色谱峰；匹配程序用JAVA程序和MySQL

数据库编写；

最后通过Biolynx软件计算验证。

实施例2

结果与讨论

2.1超高效液相色谱-质谱分析

本实验对实施例1中所得到的发酵乳消化产物进行了超高效液相色谱-质谱分析。图1为消化产物的液相色谱图，根据实验的前处理方法，共得到1374种低分子量化合物，证实了经本实验室的瑞士乳杆菌发酵得到的酸奶中物质的复杂性以及质谱检测器优越的灵敏度和分离性。

本实验在UPLC-MS分析前，对发酵乳进行胃肠道消化模拟实验，因此最终得到的多肽序列对消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用，有更大进入机体发挥其作用的潜在可能。

2.2氨基酸序列质量的匹对

以α_s1-酪蛋白(ID：1087，变体B)为例，通过程序匹对，得到来源于该蛋白质序列的预测多肽序列共55条，具体序列见表1。

表1

2.3多肽序列的验证

本方法将预测得到的多肽序列经Biolynx验证，最终得到牛乳蛋白来源多肽共119条。其中，α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白来源的多肽序列分别为8，5，21，7，5，11，44，18条，具体分布见表2。由表2可知，得到的多肽大多为3～6个氨基酸残基。经胃消化模拟模拟实验后鉴定得到的多肽序列，多为低分子量的小肽，具有易被吸收的特点。Sadat-MekmeneL等人研究发现，细胞膜上有可运输寡肽的转运体，主要运输3～6个氨基酸残基的多肽，使多肽进入细胞质发挥其活性作用，同时需要ATP水解提供能量。

表2多肽的分布情况

需要说明的是：α_s1-酪蛋白(α_s1-CN)、α_s2-酪蛋白(α_s1-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)、α-乳白蛋白(α-LA)、β-乳球蛋白(β-LG)、乳铁蛋白(LAC)、血清白蛋白(ALB)；有些可来源于多条牛乳蛋白的多肽，先记录在前一条蛋白上。

以α_s1-酪蛋白(ID：1087，变体B)为例，根据本文方法对预测得到序列逐一分析，得到α_s1-酪蛋白来源的多肽序列共8条，具体如表3所示。如质核比为615.37Da的物质，出峰时间为6.63min，程序推测序列为LEQLL，提取质荷比为615.37Da的质量色谱图及其一级质谱图，如图2所示，将其质谱图导入Biolynx，由图3、4可知，根据az，by断裂的情况，发现该有6个碎片离子峰与LEQLL的实际二级质谱图相吻合，经过Biolynx软件分析计算，质荷比615.37Da的序列片段证实为LEQLL，与α_s1-酪蛋白的95-99残基序列对应。再如，质荷比为544.38Da的序列物质，程序推测序列为RLKK，提取质荷比为544.38Da的质量色谱图及其一级质谱图，如图5所示。同理，根据az，by断裂的情况以及图6、7，未发现与RLKK实际断裂相吻合的碎片离子峰，经过Biolynx软件分析计算，可证实质荷比544.38Da的序列片段不为RLKK。

表3α_s1-酪蛋白来源多肽的鉴定

其中，实验中证实存在的GS和SG具有较高的抑制血管紧张素转化酶活性，研究测定其IC₅₀分别为3800和8500μM。JoseAngelGomez-Ruiz等人研究了多种西班牙奶酪，具体筛选了分子量<1000Da的混合物，并用HPLC-MS/MS和离线MS/MS具体分析其中成分，从一种Cabrales奶酪中分离得到了多肽MPL，并研究了其抑制血管紧张素转化酶活性，发现活性不显著。此外，鉴定得到的其它α_s1-酪蛋白来源多肽序列也分别有被报道过。

除α_s1-酪蛋白来源外，还有大量经验证具有生物活性的、其它乳蛋白来源多肽，如具有ACE抑制活性的FPIIV，来源于β-酪蛋白的第205-209位残基；具有抗菌活性的KKISQ，来源于α_s2-酪蛋白的第180-184位残基等等。此外，通过本实验建立的方法，还获得了一系列新的多肽序列。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法，具体包括如下步骤：

1)多肽的粗提：取发酵乳进行低温离心分离，取上清液；

2)多肽的纯化：

a.对步骤1)的上清液进行超滤处理，收集滤液；

b.固相萃取柱分离：收集的滤液采用WatersSep-pakC18固相萃取柱萃取，收集生物活性多肽混合物；

3)多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤2)的生物活性多肽混合物，第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶；

4)将步骤3)得到的产物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱UPLC-MS联用分析，得到生物活性多肽的相对分子量；

5)建立牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库；

6)将步骤4)中UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中进行搜索，得到预测多肽序列；

7)验证生物活性多肽的序列：将步骤6)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图与UPLC-MS得到的实际二级质谱图对比分析，通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情况，确认预测多肽序列是否正确。

2.如权利要求1的方法，其特征在于，步骤1)所述发酵乳为瑞士乳杆菌发酵乳。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述瑞士乳杆菌发酵乳为将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵而获得；所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵时间6～8h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述低温离心的条件为：4℃，8000～10000rpm，离心15～30min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)a所述超滤处理所采用的是截留分子量分别为3kDa的超滤管；所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心温度为4℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)b中，固相萃取柱分离，具体方法为：活化和平衡WatersSep-pakC18固相萃取柱；将步骤2)a中收集的滤液进行稀释后上样，采用洗脱液洗脱，收集所得到的洗脱液，即包含生物活性多肽混合物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，所采用的洗脱液为甲醇和ddH₂O的混合液，所述甲醇和ddH₂O的混合液中甲醇与ddH₂O的体积比为80:20，所述甲醇和ddH₂O的混合液中含有0.1％(v/v)的甲酸。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述两步酶解法为：将步骤2)得到的含有多肽的混合物溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为1.9～2.1，在36.5～38.5℃的恒温水浴中保温反应60～120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为7.4～7.6，并加入胰酶，于36.5～38.5℃的恒温水浴中保温反应120～180min，获得第二步酶解液；将第二步酶解液置于95～100℃水浴中加热使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10～30mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶30～50mg/g底物。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)具体实现的方法为：将UPLC-MS得到的相对分子质量，与已建立的牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中氨基酸序列对应的相对分子量匹对，得到相对分子质量误差在±0.01Da内的生物活性多肽的序列、该序列的相对分子质量以及该序列的具体蛋白来源，以此作为预测多肽序列。

11.如权利要求1～10任一权利要求所述的方法在发酵乳生物活性多肽鉴别中的应用。