CN108107018B - 一种基于胃肠消化的大分子多肽制备原位实时监测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于胃肠消化的大分子多肽制备原位实时监测方法，该技术属于蛋白质酶解过程在线监测领域。步骤为：对牛奶蛋白溶液进行酶解，在制备牛奶蛋白大分子多肽过程中，对酶解液取样经胃肠消化后再测定其降血压活性，同时收集其酶解液之前快速采集其原位实时光谱。将其光谱进行预处理，并筛选最佳光谱区间，采用联合区间偏最小二乘法建立校正模型和预测模型。并将其预测模型对酶解过程进行原位实时监测和反应终点的判断，结果显示预测模型和实测模型非常接近，可实现制备牛奶蛋白大分子酶解过程中水解度、酶解产物经胃肠消化后生物活性的有效原位检测。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质酶解过程实时监测领域，具体指牛奶大分子多肽制备过程中，原位实时监测蛋白酶解过程中水解度及其酶解产物经胃肠消化后的降血压生物活性。
背景技术
蛋白质经过胃肠道内的胃蛋白酶和胰酶的酶解作用，70％以多肽的形式被吸收，进入血液的多肽可发挥多种生物学活性，例如，降血压(Jakubczyk A.,
M.,BaraniakB.,et al.,The impact of fermentation and in vitro digestion on formationangiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory peptides from pea proteins[J],Food Chemistry,2013,141:3774-3780)。但是大部分蛋白质由于分子量大和特有的空间结构，难以被快速消化，需要经过完整消化道才能被完全消化吸收，释放的生物活性肽片段少且较慢，降低了多肽的生物学效果。因此，在制备生物活性肽的过程中可利用蛋白预处理，将大分子蛋白酶解成大分子多肽，再通过体内胃肠道内蛋白酶的进一步酶解，最大限度地提高胃肠道消化后产物的活性。与小分子肽(2-3肽)的制备目标是口服后直接被胃肠吸收的设计准则不同，大分子多肽制备过程中，充分利用胃肠消化对多肽的酶解作用，在体外只对蛋白进行低程度酶解，再经过体内进一步的胃肠消化，可以达到与传统小分子活性肽相近的效果。大分子多肽的制备过程中蛋白水解程度低，可以大幅地缩短酶解时间、减少用酶量、简化工艺、降低能耗，达到显著降低制备成本的目的。但是目前基于胃肠消化的大分子多肽制备的检测指标仍然需要离线测定(在线取样后，经胃肠模拟消化后再测定其生物学活性)，不仅耗时长、工作量大而且测定数据具有滞后性。因此需要一种快速、连续的方法获得基于胃肠消化的大分子多肽制备酶解反应中的重要参数，用以判断酶解反应终点。
近年来，光谱监测手段已应用于多肽的制备过程中(基于原位实时光谱在线监测蛋白质酶解过程的装置和方法，公开号：CN105628644A)。原位实时在线光谱技术能对过程中化学成分的变化进行连续性测量，而且该技术由于采用了微小型光纤光谱仪，因此其具有方便携带，成本低廉，速度快，无污染，实时连续检测的优点。目前已实现光谱与酶解产物活性定量模型的建立，但是能否实现光谱与酶解产物经胃肠消化后的活性定量模型的建立还未见报道。
本发明旨在利用在线光谱技术建立一种适用于基于胃肠消化制备大分子多肽原位实时监测方法，用以快速在线判断酶解反应终点，为智能化控制其酶解过程打下基础。
发明内容
本发明的目的是克服传统方法的离线检测耗时长、步骤繁琐、工作量大、测定滞后的缺点，采用原位实时近红外光谱在线监测大分子多肽的酶解过程，旨在实现该蛋白酶解过程的快速实时监测。
为了实现上述发明目的，一种基于胃肠消化的大分子多肽制备原位实时监测方法，按照下述步骤进行：
(1)对牛奶进行酶解，酶解过程中定时取样，并对所取的样品进行模拟胃肠消化，酶解过程指标为牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性(以ACE抑制率为指标)。
所述模拟胃肠消化按以下步骤进行：取酶解产物按照2％(E/S)加酶量加入胃蛋白酶，酶解2h，酶解结束后按照4％(E/S)加酶量加入胰酶，酶解4h，反应结束后于100℃灭酶15min。
(2)制备牛奶大分子降血压肽酶解过程中，定时对酶解液进行快速采集原位实时近红外光谱，采用便携式微小型近红外光谱仪采集数据，采集的光谱波长范围：900-2500nm)。
(3)对光谱数据进行预处理，具体为采用多项式卷积平滑(sg)的方法对样品光谱数据进行预处理。
(4)筛选最佳光谱区间，具体为采用联合区间偏最小二乘回归方法筛选牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性的最佳光谱区间。也可以采用偏最小二乘法、区间偏最小二乘法等方法。
(5)建立校正和预测模型，具体为采用联合区间最小二乘回归方法，将牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性与原位实时光谱数据建立校正和预测模型，其中校正集(70个)和预测集(20个)。
(6)将上述预测模型应用于制备牛奶大分子降血压肽酶解过程中，利用上述预测模型，对建模外的制备牛奶大分子降血压肽的酶解过程进行原位实时在线监测，预测酶解过程中水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性，并计算预测值和实测值的偏差。
以上所述的蛋白来源不限于牛奶，还包括一些可溶性较好的其他蛋白。例如大豆蛋白、蛋清或乳清蛋白等。
本发明的有益效果是：
本发明是一种基于胃肠消化制备牛奶大分子多肽的原位实时监测方法，在线监测制备牛奶大分子降血压肽酶解过程中水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性。以牛奶为样本，采集制备大分子降血压肽酶解过程中的原位实时光谱，采用联合区间偏最小二乘法将检测指标和光谱图建立模型，以实测值和预测值的偏差为指标，评价牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性的回归模型。牛奶酶解液的水解度预测模型的相关系数R为0.962，标准偏差为1.12％；酶解产物经胃肠消化后的降血压活性预测模型的相关系数R为0.972，标准偏差为2.88％，实现了对制备牛奶大分子多肽酶解过程中水解度、酶解产物经胃肠消化后生物活性的有效原位检测。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为牛奶大分子多肽的酶解过程原位在线监测定量建模流程图。
图2为基于胃肠消化制备牛奶大分子多肽的原位实时监测的装置图。其中1为酸碱滴定管，2为夹层烧杯，3为磁力搅拌器，4为浸入式光纤探头，5为超级恒温箱，6为钨灯光源，7为微小型近红外光谱仪，8为信息采集系统，9为自动滴定仪。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
超级恒温箱5通过软管连接夹层烧杯2，恒温的热水通过软管进入夹层以保持反应体系温度，夹层烧杯2放于磁力搅拌器3上，酸碱滴定管1悬空于夹层烧杯2上方，浸入式光纤探头4在反应时没过反应液面。钨灯光源6和微小型近红外光谱仪7通过线缆连接浸入式光纤探头4并通过线缆将信号传输到信息采集系统8进行分析。自动滴定仪9通过线缆连接酸碱滴定管1以控制酸碱的滴定。
本实施例中所用牛奶为光明优倍巴氏杀菌鲜牛奶，蛋白含量3.4％，脂肪含量0％。
实施例
(1)取牛奶(蛋白浓度为34g/L和30g/L)400mL于夹层烧杯中，在50℃恒温搅拌平衡10min，用1mol/L的NaOH调节到pH为7.0。随后加入5％(E/S)的中性蛋白酶进行酶解，整个酶解过程中pH保持恒定，酶解时间90min，每间隔2min取样，同时采集光谱信息，取样后迅速沸水浴灭酶，冷却进行胃肠模拟消化实验。用3mol/L的HCl调节pH为1.60。随后加入2％(E/S)的胃蛋白酶，酶解2h，整个酶解过程中pH保持在1.5-2.0之间。胃蛋白酶酶解结束后，用1mol/L的NaOH调节到pH为8.0，随后加入2％(E/S)胰酶，酶解4h，整个酶解过程中pH保持恒定，酶解结束后取样，取样后迅速用沸水浴灭酶10min，冷却后10000g离心10min，收集上清液储存于4℃待测。共计90个样品。
(3)测定牛奶酶解产物经过胃肠蛋白酶消化后的降血压活性。降血压活性的测定方法参照丁青芝的方法并略作修改(丁青芝.脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究[D].江苏大学，2008.)。ACE、FAPGG各加50μL，HEPES缓冲液加100μL，样品加100μL。
(4)牛奶酶解过程中原位实时光谱的采集。经原位仪器如图2所示，整个系统工作时，在夹层烧杯2中进行牛奶的酶解，开启自动滴定仪、磁力搅拌器、超级恒温箱。将浸入式光纤探头置于牛奶中并固定。由卤钨灯光源6将光源传入浸入式光纤探头4，在酶解反应过程中采集到的相应光谱反映在微小型近红外光谱仪7中，最终通过信息采集系统将光谱信息采集并存储。以InGaAs检测器采集900-2500nm光谱(以50℃蒸馏水为背景，采用透反射方式；光程4mm；扫描次数为16次，分辨率6.4nm，共含90个变量。每个样品连续采集3次光谱，取其平均值作为该样本的原始光谱)。
(5)牛奶酶解过程中原位实时光谱的预处理。采用多项式卷积平滑(sg)预处理方法对酶解过程中采集的原始光谱进行预处理。
(6)校正模型的建立。将90个样品的光谱用sg预处理方法进行预处理，分成校正集(70个)和预测集(20个)两个部分。采用偏最小二乘算法建立酶解过程中牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性的定量模型，包括校正模型和预测模型。
(7)酶解过程的预测。牛奶(蛋白浓度34g/L和30g/L)400mL，按照(1)的方法采集光谱，按照(1)、(2)和(3)的方法进行酶解。将采集的光谱带入(7)中所建立的预测模型中，对牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性进行预测，并比较其预测值和实测值的残差。残差值小于实测值5％认为该模型预测准确。
表1牛奶水解度及其酶解产物经胃肠消化后的降血压活性建模结果
表2牛奶大分子肽酶解过程中水解度预测结果
表3牛奶酶解产物经胃肠消化后的降血压活性预测结果
Claims (1)
1.一种牛奶大分子多肽制备原位实时监测方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)取蛋白浓度为34g/L和30g/L的牛奶于夹层烧杯中，在50℃恒温搅拌平衡10min，用1mol/L的NaOH调节到pH为7.0；随后加入5％E/S的中性蛋白酶进行酶解，整个酶解过程中pH保持恒定，酶解时间90min，每间隔2min取样，同时采集光谱信息，取样后迅速沸水浴灭酶，冷却进行胃肠模拟消化实验；用3mol/L的HCl调节pH为1.60；随后加入2％E/S的胃蛋白酶，酶解2h，整个酶解过程中pH保持在1.5-2.0之间；胃蛋白酶酶解结束后，用1mol/L的NaOH调节到pH为8.0，随后加入2％E/S胰酶，酶解4h，整个酶解过程中pH保持恒定，酶解结束后取样，取样后迅速用沸水浴灭酶10min，冷却后10000g离心10min，收集上清液储存于4℃待测；共计90个样品；
(3)测定牛奶酶解产物经过胃肠蛋白酶消化后的降血压活性；
(4)牛奶酶解过程中原位实时光谱的采集，整个系统工作时，在夹层烧杯中进行牛奶的酶解，开启自动滴定仪、磁力搅拌器、超级恒温箱；将浸入式光纤探头置于牛奶中并固定；由卤钨灯光源将光源传入浸入式光纤探头，在酶解反应过程中采集到的相应光谱反映在微小型近红外光谱仪中，最终通过信息采集系统将光谱信息采集并存储；以InGaAs检测器采集900-2500nm光谱，采集光谱时以50℃蒸馏水为背景，采用透反射方式；光程4mm；扫描次数为16次，分辨率6.4nm，共含90个变量；每个样品连续采集3次光谱，取其平均值作为该样品的原始光谱；
(5)牛奶酶解过程中原位实时光谱的预处理；采用多项式卷积平滑预处理方法对酶解过程中采集的原始光谱进行预处理；
(6)校正模型的建立；将90个样品的光谱用多项式卷积平滑预处理方法进行预处理，分成校正集和预测集两个部分，其中校正集为70个样品，预测集为20个样品；采用偏最小二乘算法建立酶解过程中牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性的定量模型，包括校正模型和预测模型；
(7)酶解过程的预测；蛋白浓度34g/L和30g/L的牛奶，按照步骤(4)的方法采集光谱，按照步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的方法进行酶解；将采集的光谱带入步骤(6)中所建立的预测模型中，对牛奶水解度及其酶解产物经过胃肠消化后的降血压活性进行预测，并比较其预测值和实测值的残差；残差值小于实测值5％认为该模型预测准确。
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