CN112834631A - 一种单细胞单管样品制备及单细胞蛋白质组学分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞蛋白组分析技术领域，具体涉及一种基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，步骤为：采用DDM对测试管内壁进行预处理；向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单一测试管(例如PCR管)对单细胞进行裂解和蛋白质变性、还原烷基化、酶解等处理，在所述的测试管中获得单细胞蛋白质组分析的多肽待测溶液。本发明还包含对所得到的待测样品直接进样，进行液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)分析的方法。本发明能够有效克服单细胞蛋白质丢失的问题，能够有效改善单细胞蛋白质组学分析的效果。此外，该方法简便，高效，不需要额外的仪器和其他试剂，可以在普通的蛋白质组学实验室容易得到实施，为单细胞蛋白质组学的发展提供了新的分析工具。

Description

一种单细胞单管样品制备及单细胞蛋白质组学分析方法
技术领域
本发明属于蛋白分析领域，具体涉及一种单细胞单管的样品处理及其单细胞蛋白质组学分析方法。
背景技术
蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。
近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。单细胞蛋白质组学分析的最大难点是样品量极少，单个细胞(如单个人体细胞)的蛋白约为100-200pg，并且在处理过程中细胞蛋白质因吸附在测试管内壁发生蛋白质的丢失，给样品前处理带来极大的困难。常规的蛋白质组样品前处理方法仅适用于大量细胞样品处理，适用常规反应体系时酶解效率低,当样品浓度很低(单细胞样品时)，此时酶解效率也会随之降低，所以迫切需要发展创新一系列技术来解决这个问题。目前还没有十分成熟的单细胞蛋白质组学分析方法，我们提出的这种基于单管处理的蛋白质组学样品处理方法简单、易操作、普适性强，实用性好。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便的单细胞蛋白质组学研究的单管样品处理方法。旨在避免单细胞蛋白信息丢失，改善单细胞蛋白质组学分析的效果。
本发明的第二目的在于，通过将样品处理方法与标准液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)平台相结合，形成了一套单细胞蛋白质组学方法。
一种基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)对测试管内壁进行预处理；
步骤(2)：向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单管处理方式，在该测试管中对单细胞进行细胞裂解，蛋白酶解处理，在所述的测试管中获得肽段待测溶液。
单细胞中的蛋白信息少，处理过程中极易丢失，影响结果分析，这是导致单细胞蛋白质组学分析需要依赖高昂设备，阻碍其大范围推广应用的主要因素。为解决单细胞蛋白质组学分析中容易存在蛋白丢失问题，本发明创新地采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理，并进一步配合单管样品制备方式，直接在该预处理后的测试管中完成单细胞蛋白裂解的整个过程，并直接将其进行进样分析。本发明研究发现，通过本发明所述的十二烷基-β-D- 麦芽糖苷的预处理以及单管样品制备方式的联合，能够有效降低单细胞蛋白的丢失问题，能够改善单细胞蛋白质组学研究的准确性和分析的回收率和准确性。
本发明提供了一种简便，实惠，高效单细胞蛋白质组学技术。对于医学相关领域，单细胞蛋白质组学应用前景也十分广阔，先进及高效的方法能够帮助我们更好的服务于临床工作之中。
本发明中，通过所述的预处理，在所述的测试管的内壁形成十二烷基-β-D-麦芽糖苷薄膜。
本发明中，步骤(1)的预处理步骤为：向测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，浸泡后倒出溶液，并干燥(例如自然干燥)。
本发明中，将所述的测试管的内壁均浸泡在所述的十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液中，利用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理。
作为优选，步骤(1)中，十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液的溶质的质量百分比为0.05～0.50％；进一步优选为0.05～0.15％。
作为优选，步骤(1)中，浸泡的时间大于或等于12h。
本发明中，所述的测试管没有特别要求，能够实现后续进样分析即可，例如，所述的测试管可以是PCR管。
本发明中，在所述的创新地在所述的十二烷基-β-D-麦芽糖苷预处理的基础上，进一步配合单管蛋白裂解处理思路，在所述的预处理的测试管内完成对蛋白的裂解步骤，且直接进行进样，如此，有助于进一步降低蛋白信息丢失，有助于进一步改善分析效果。
本发明中，步骤(2)蛋白裂解体系中添加有十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液。本发明中，创新地在所述的十二烷基-β-D-麦芽糖苷预处理的基础上，进一步利用十二烷基-β-D-麦芽糖苷辅助参与单细胞蛋白裂解过程，有助于进一步改善蛋白信息丢失的问题，有助于进一步改善单细胞蛋白组学的分析效果。
作为优选，步骤(2)中，十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液的溶质的质量百分浓度为0.005～0.10％。
作为优选，步骤(2)中，向预处理后的测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，加入单细胞，随后对单细胞的蛋白进行裂解。
本发明中，蛋白裂解方法可采用现有方法，例如包括细胞裂解，蛋白质变性，蛋白质还原烷基化，蛋白质酶解等蛋白质组学样品处理过程。
作为优选，步骤(2)中，采用DTT-IAA-胰蛋白酶裂解体系在所述的测试管中对单细胞蛋白进行裂解。例如，通过DTT-IAA-胰蛋白酶裂解体系进行单细胞裂解、蛋白质变性、蛋白质还原烷基化、蛋白质酶解等蛋白质组学样品处理全过程。
进一步优选，步骤(2)中，裂解步骤为：
步骤(2-1)：向预处理测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，再加入单细胞；
步骤(2-2)：加入DTT溶液并孵育；
步骤(2-3)：步骤(2-2)孵育后再添加IAA溶液，并孵育；
步骤(2-4)：步骤(2-3)孵育后加入胰蛋白酶溶液，进行酶解反应；
步骤(2-5)：终止酶解，即得所述的肽段待测溶液。
本发明中，步骤(2-1)～步骤(2-5)中，各步骤处理完成后进行离心悬沉后在进行下一步。
进一步优选，步骤(2-1)：往所述的测试管中加入1～2μL的0.005～0.10％DDM溶液，随后经离心处理；
步骤(2-2)：步骤(2-1)离心后加入0.1～0.5μL40～60mmol/L DTT溶液，离心后再在80～90℃恒温孵育0.5～1.5h；离心处理；
步骤(2-3)：步骤(2-2)离心后0.4～0.6μL的25～35mmol/L IAA溶液，并在50～60℃下黑暗孵育20～40min，随后离心；
步骤(2-4)：步骤(2-2)离心后加0.9～1.1μL的25～35ng/μL胰蛋白酶溶液；并加入1.5～1.9μL NH4HCO3溶液定容至5～7μL，37℃下进行酶解反应；
步骤(2-5)：加入0.4～0.6μL的4～6％FA溶液终止酶解，离心得到所述的肽段待测溶液。
本发明还公开了一种单细胞蛋白质组学分析方法，采用所述的单细胞单管样品的制备方法获得装有所述肽段待测溶液的测试管，随后直接进样、进行LC-MS/MS测定，并对测定结果进行蛋白组学分析。
本发明所述的测试方法，创新地采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理，能减少测试管内壁蛋白质吸附；并在该预处理的测试管内对单细胞进行细胞裂解，蛋白质变性，蛋白质还原烷基化，蛋白质酶解，酶解终止使单细胞变成多肽溶液，直接将测试管内容物上样至高分辨质谱仪内进行分析；经研究发现，单一PCR管处理和上样至质谱仪同样可以达到减少多肽丢失的效果。
本发明中，所述的LC-MS/MS测定以及对测定结果的蛋白组学分析均可采用现有方法。
本发明优选的单细胞蛋白质组学分析方法，包括以下步骤：
步骤(1)：采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理；
步骤(2)：向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单管处理方式，在该测试管中对单细胞蛋白进行裂解，在所述的测试管中获得单细胞蛋白裂解待测溶液。
步骤(3)：将步骤(2)获得的装有待测溶液的测试管直接进样、进行LC-MS/MS测定，并对测定结果进行蛋白质组学分析。
该蛋白组学分析方法中，所述的步骤(1)和(2)的操作和条件同所述的单细胞单管样品的制备方法。
本发明的有益效果为：
1、本发明通过所述的十二烷基-β-D-麦芽糖苷的预处理以及单管样品处理思路的联合，能够克服单细胞蛋白组分分析过程中难于避免的蛋白信息少，且容易丢失的行业性难题，可以基于简便、容易实现的设备对单细胞蛋白组学进行研究分析。
2、本发明创新地提供了一种新型的单管样品处理方法，相比其他方法具有简便，高效，实用，适用于蛋白质组学研究。
附图说明
图1实施例DDM单管处理方法体系的建立；
图2单细胞蛋白质组学方法的流程图
图3单管处理消化效率
图4非标记量化分析
具体实施方式
人肺腺癌细胞株Hcc827和H1975为本实验室液氮罐中保存；RPMI 1640、胰蛋白酶，胎牛血清：Gibco公司提供。胰蛋白酶(质谱分析级):Promega公司提供。碘乙酰胺(IAA)，碳酸氢铵，二硫苏糖醇(DTT)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供；甲酸(FA)，十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)：北京凯森莱科技有限公司提供；
相关仪器设备：
仪器：质谱仪:Orbitrap Fusion Lumos；液相:Themo EASY-nLC 1200；预柱:Acclaim PepMapTM 100 75μm*2cm,nanoViper2pkC18,3μm,100A(P/N 164946,S/N10758712)；分析柱:Acclaim PepMapTM RSLC 75μm*15cm,nanoViper C18,2μm,100A(P/N164940,S/N 10533159)
实施例1：DDM预处理研究
(1)：多细胞研究
为了实现单个细胞蛋白质组的精确定量，我们在单一PCR试管中使用均匀的蛋白质样品 (即细胞裂解液)，系统地评估了样品回收率。
细胞裂解：对处于生长期MCF细胞用冰冷PBS溶液冲洗2次，加入1ml冰冷PBS溶液(含 1％磷酸酶抑制剂cocktail(Pierce),10mM NaF(Sigma))收集细胞于PCR管中。细胞4℃1500rpm 离心10min,丢弃多余PBS溶液。再加入细胞裂解液buffer(250mM HEPES,8M urea,150Mm Nacl,1％Triton X-100,PH 6.0)重悬细胞沉淀，裂解缓冲液与细胞沉淀比例为3:1。4℃14000rpm 离心10min.保留可溶性蛋白质成分。蛋白质浓度采用BCA法。
往未经处理的PCR管(对照组)以及DDM预处理(0.1％DDM浸泡12h后干燥)后的 PCR管(DDM组)中分别加入1μg细胞裂解液(约等于1000MCF7细胞)进行上样实验，通过对比，DDM组1μg细胞裂解产物鉴定的肽段数目从6241增加到7342(图1左一；由左至右，第一张图).在此基础上，我们进一步评估DDM辅助单管处理方法是否可以使用于单细胞水平。
(2)：双细胞研究
按照上述(1)方法分别往未经处理的PCR管(对照组)以及DDM预处理(0.1％DDM浸泡 12h后干燥)后的PCR管(DDM组)中分别加0.2ngMCF7细胞裂解液(相当于2个MCF7 细胞)进行上样实验，通过对比,DDM组鉴定肽段数目从63升至891.(图1左二；由左至右，第二张图)从这些结果看出，对于微量细胞消化产物来说，DDM和PCR管的结合能够显著降低表面吸附损失,特别是对于小于10个哺乳动物细胞的细胞裂解产物。
(3)：单细胞研究
基于上述(1)(2)研究发现DDM单管处理方法在少数细胞中的表现，我们进一步研究、评估DDM单管处理是否可以用于单个哺乳动物细胞的蛋白质组学分析。使用连续稀释法从新鲜细胞悬液中分别挑取单个MCF7细胞放入未经处理的PCR管(对照组)以及DDM预处理(0.1％DDM浸泡12h后干燥)后的PCR管(DDM组)中，按照图2方案统一进行处理。研究发现，只使用MS/MS算法，对照组3重复样本平均只能鉴定出6独立肽段；DDM组3 重复样本平均能鉴定出313独立肽段.(图1右二；由左至右，第三张图)；这一结果强烈表明，如果没有进行DDM预处理，由于显著的表面吸附损失,单管方法不能有效地处理单个细胞进行蛋白质组学分析，这与我们对细胞裂解产物的观察是一致的。
实施例2
按图2示意图，对人肺腺癌细胞株Hcc827单细胞蛋白组学研究：
一.细胞培养
将装有人肺腺癌细胞株Hcc827冻存管取出，37℃水浴，不断摇动使其快速融化；待细胞融化后，从水浴中取出，1000rpm离心5min；表面消毒后放入超净工作台内，去上清，加入 1ml新鲜培养基(1640+10％胎牛血清+1％谷氨酸钠+1％丙酮酸钠)重悬；转移至培养瓶内静止培养；细胞培养于37℃、5％CO2的恒温恒湿培养箱中.
二.细胞挑取
将0.1％DDM加入到PCR管中，全部加满(完全浸没PCR管的内壁)，室温静置过夜(至少12h)，吸出DDM溶液，通风柜自然风干PCR管。
选择处于对数生长期的癌细胞，倒去培养液，PBS洗两次，加胰蛋白酶消化1～3min，加入适量DMEM或1640培养基中和，终止消化，用移液管吸取培养基转移至离心管中，1000rpm离心5min，去上清用PBS重悬，重复3次，以除去剩余的PBS和胰蛋白酶.
在显微镜下运用连续稀释法挑取细胞，将所需数量的细胞分离到内含1μL0.1％DDM的 PCR试管中后，立即将分离的细胞在4℃下1000rpm离心10min，使细胞保持在试管底部，以避免潜在的细胞损失.将含有分离细胞的PCR管保存在-80℃的冰箱中，直到进一步分析.
三.样品处理
1.从-80℃冰箱中取出样品，解冻后往管中加入1.5μL 0.1％DDM，6000rcf离心4.5min；
2.加0.3μL 50mmol/L DTT，6000rcf离心1min
3.90℃恒温PCR仪中孵育1h，600rcf离心2min，37℃降温半小时
4.加0.5μL 30mmol/L IAA，57℃黑暗孵育30min，8500rpm摇动，6000rcf离心1.5min
5.加1μL 30ng/μL胰蛋白酶(质谱分析级)
6.加1.7μL NH4HCO3定容6μL，37℃过夜，摇晃，震荡2-3次
7.加0.5μL 5％FA终止酶解，15000rcf离心1h
四.质谱处理
把处理后的样品，放进2ml进样瓶中，剪掉PCR管盖，接着盖上具有切口内衬的盖子，最后放进液相.相关参数设定:
液相进样体积为5μL，流速为10μL/min；Orbitrap Fusion Lumos:电喷雾电压设为+2.4kV，离子管转移温度:320℃；MS属性:默认电荷价态:2MS扫描属性:检测器Orbitrap分辨率 120000扫描范围:375-1575m/z；AGC Target:1.0e6最大注射时间:246ms；Includecharge state:2-7,intensity threshold:2.0e4；Dynamic exclusion duration:90s；Mass Tolerance:±10ppm；Data-Dependent MS scan属性:分离模式；Quadrupole分离窗:1.6m/z活化类型:HCD 40％HCD collision energy检测器:Orbitrap分辨率240000FirstMass:110m/z；AGC Target:5.0e4最长注射时间:502ms；
当分析100个细胞时，参数做了相应改变：Orbitrap分辨率60000First Mass:110m/zAGC Target:5.0e4最长注射时间:118ms
五.数据处理
使用MaxQuant(1.5.7)软件处理MS原始文件，采用UniProtKB/Swiss-Prot Human(20180126)数据库进行搜库(参数设定：缺失裂解位点的胰蛋白酶多肽：0-2；10ppm亲本离子耐受性；0.6Da片段离子质量耐受性；可变修饰(蛋氨酸氧化)).搜索结果用MAXQUANT 进行处理，设定假阳性率≤1％进行过滤。当肽库可用时，选择游程间匹配(MBR)功能以增加蛋白质组覆盖范围。采用无标记定量(LFQ)功能进行蛋白质定量。使用Perseus(1.6.2.3)软件进行相关下游统计学分析.
实施例3
和实施例2相比，区别仅在于，细胞挑取过程中，分别挑取1，5，10，100H1975细胞样品，进行蛋白组学研究(也即是，区别仅在于，挑取的细胞数的不同，其他步骤同实施例 2)。例如，细胞挑取过程中，使用连续稀释法从新鲜细胞悬液中分别挑取1，5，10，100H1975 细胞放入单个DDM预处理后的PCR管中，经DDM辅助单管处理方法对管中样品进行酶解，将PCR管去盖后塞入2ml进样瓶中，进行LC-MS/MS分析。
具体实验结果见表一，1，5，100细胞组平均分别可以鉴别肽段数目为904，1491，4321. (图1右一；由左至右，第四张图)
表一.单管处理方法体系建立相关数据
Figure BDA0002410460190000071
Figure BDA0002410460190000081
单细胞蛋白质组学应用：
我们针对单细胞展开进一步研究，在显微镜下运用连续稀释法挑取1，5，10H1975细胞进行单细胞蛋白质组学分析。
从空白样本中只鉴别出对应于15个蛋白的42独立肽段，并且随着细胞数目的增加，污染物所占比例逐渐下降，说明连续稀释法的细胞分离方法可以在一定程度上减少细胞悬液对蛋白质的污染(图3).对于含有细胞的样品，观察到多肽和蛋白质识别几乎呈线性增加，表明总体平台灵敏度控制蛋白质组覆盖范围.对于1，5，10细胞每组3平行样本进行分析，基于MS/MS平均分别能鉴别出849，1095，1956独立肽段；接着应用MBR算法，平均识别肽段数目增长至1466，1992，2478，通过结果可以看出MBR显著提高检出灵敏度和蛋白质组范围；基于MS/MS算法,从1，5，10细胞样品中我们最多鉴别独立肽段数目(蛋白数目)分别为1475(195)，2356(482)，4377(726)；使用MBR算法，与之对应结果为2341(551)， 3941(1041)，5029(1029)(图3).
为了进一步验证该方法的单细胞蛋白质组学分析，我们比较了单细胞与100个H1975细胞裂解产物的蛋白丰度分布。正如预期一样，在单个细胞中鉴别出的大部分蛋白质都是高丰度蛋白，高于100H1975细胞裂解消化的中值丰度.(图4).单细胞组间任意两样本之间的皮尔森相关系数都大于0.85.所有这些结果表明该方法能够实现非标记量化单细胞蛋白质组学分析.
目前该方法可以适用于任何质谱仪，容易在普通的蛋白质组学实验室得到实施，而不需要额外的仪器或试剂费用。我们期望它可以广泛应用于生物医学研究和系统生物学，具有促进精确医学的潜力。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理；
步骤(2)：向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单管处理方式，在该测试管中对单细胞进行细胞裂解，蛋白酶解处理，在所述的测试管中获得肽段待测溶液。
2.如权利要求1所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(1)的预处理步骤为：向测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，浸泡后倒出溶液，并干燥。
3.如权利要求2所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(1)中，十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液的溶质的质量百分比为0.05～0.50％。
4.如权利要求2所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(1)中，浸泡的时间大于或等于12h。
5.如权利要求1～4任一项所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(2)蛋白裂解体系中添加有十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液。
6.如权利要求5所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(2)中，十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液的溶质的质量百分浓度为0.005～0.10％。
7.如权利要求5任一项所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用DTT-IAA-胰蛋白酶裂解体系在所述的测试管中对单细胞蛋白进行细胞裂解、蛋白质变性、蛋白质还原烷基化、蛋白质酶解过程。
8.如权利要求7所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(2)中，裂解步骤为：
步骤(2-1)：向预处理测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，再加入单细胞；
步骤(2-2)：加入DTT溶液并孵育；
步骤(2-3)：步骤(2-2)孵育后再添加IAA溶液，并孵育；
步骤(2-4)：步骤(2-3)孵育后加入胰蛋白酶溶液，进行酶解反应；
步骤(2-5)：终止酶解，即得所述的肽段待测溶液。
9.如权利要求8所述的基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，其特征在于，步骤(2-1)：往所述的测试管中加入1～2μL的0.005～0.10％DDM溶液，随后经离心处理；
步骤(2-2)：步骤(2-1)离心后加入0.1～0.5μL40～60mmol/L DTT溶液，离心后再在80～90℃恒温孵育0.5～1.5h；离心处理；
步骤(2-3)：步骤(2-2)离心后0.4～0.6μL的25～35mmol/L IAA溶液，并在50～60℃下黑暗孵育20～40min，随后离心；
步骤(2-4)：步骤(2-2)离心后加0.9～1.1μL的25～35ng/μL胰蛋白酶溶液；并加入1.5～1.9μL NH4HCO3溶液定容至5～7μL，37℃下进行酶解反应；
步骤(2-5)：加入0.4～0.6μL 的4～6％FA溶液终止酶解，离心得到所述的待测溶液。
10.一种单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项方法获得装有所述肽段待测溶液的测试管，随后直接进样、进行LC-MS/MS测定，并对测定结果进行蛋白组学分析。
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