CN111638293A

CN111638293A - 一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的lc-ms/ms的检测方法

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Publication number: CN111638293A
Application number: CN201910814074.1A
Authority: CN
Inventors: 韦晓群; 刘鸿婷; 邹轶; 郭成贤; 赵晋楷; 欧纪锋; 孙远明; 雷红涛
Original assignee: South China Agricultural University; Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: South China Agricultural University; Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-09-08

Abstract

本发明涉及食品及生物检测领域，具体涉及一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC‑MS/MS的检测方法。本方法根据酸性洗脱和碱性洗脱双重保留机理，采用超高效液相色谱‑静电离子轨道肼质谱系统，使用XBridge BEH Amide色谱柱，以乙腈‑甲酸水溶液‑氨水为流动相进行三元梯度洗脱，无需添加离子对和衍生化试剂，建立了氨基酸和核苷酸液相色谱‑质谱联用直接分析方法。本发明简单易行，大大降低前处理时间和成本，实现以氨基酸为典型的样品中极性物质的分离，以氨基酸和核苷酸为典型例子，有效解决同时分离带正电荷离子和带负电荷离子的问题。

Description

一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法

技术领域

本发明涉及食品及生物检测领域，具体涉及一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法。

背景技术

氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称，氨基酸是构成蛋白质的基础，是生命活动中不可或缺的一类小分子物质；氨基酸是生命代谢的物质基础是生物体内不可缺少的营养成分，对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用。对生物体内氨基酸的析研究，有助于了解生命过程，对于疾病的诊断和药物的研究具有重要作用。

目前，核苷酸作为最热门的食品营养强化剂之一，已被广大食品制造商添加到其配方产品中进行功能性的推广。其原因是核苷酸本身具有常见的生物代谢功能，不仅是DNA和RNA的前体结构单元还是辅酶的组成部分(例如：NAD、CoA)和活性中间体(例如:糖元和糖蛋白的中间体)，作为生理调节剂、变构效应剂、细胞激动剂在能量代谢、细胞信号传导中参与多代谢反应。从另一个角度评价，其在生物学功能领域也起了重要作用，提高免疫力，促进铁的吸收，参与脂蛋白的代谢，调节肠道菌群，有助组织生长和分化。

我国尚未建立核苷酸的检测方法，国内外测定核苷酸的方法也是多种多样，包括荧光法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、.液相色谱-质谱法等除了质谱方法，现有检测的方法存在着易受干扰，操作复杂，重现性不佳等问题。在液相色谱-质谱法中，多以研究形式为主，利用高分辨质谱分析定量核苷酸含量，在仪器维护等方面要求较高，同时核苷酸同位素内标难以取得，基质效应对离子化效率的影响导致检测结果的准确度较难保证。

而近年来，质谱技术的高速发展在一定程度上满足了氨基酸高灵敏检测的需求。氨基酸容易离子化，在电喷雾源(ESI)正离子模式下能够得到很好的响应，同时由于质谱检测的信号为质荷比(m/z)，即使未能达到基线分离的情况，也可通过不同质荷比进行定量分析，因此在氨基酸的液相色谱质谱联用(LC/MS)分析中，氨基酸在色谱柱上的保留成为关键。目前，氨基酸的LC/MS分析方法多通过衍生化或添加离子对试剂改善其保留行为，但往往衍生试剂的加入又会在一定程度上影响质谱离子源的离子化。

氨基酸的分离检测技术一直是研究者的关注点之一，尽管氨基酸分析方法多种多样，但改进现有方法，使其具有更好的专属性与灵敏度一直是研究的热点和难点问题。在氨基酸的液相分离中，由于氨基酸类物质含有氨基和羧基两种官能团，一方面自身极性很强，难以直接在反相C18色谱柱上得到良好保留，另一方面紫外吸收弱，生命体中常见的20种氨基酸中，除酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸外，均难以在紫外检测器(UV)上得到高灵敏响应。为了改善氨基酸的保留与检测问题，通常使用衍生化试剂在柱前或柱后对氨基酸进行衍生处理再上机检测，但是对于生物类样品分析，衍生化试剂的引入会将原本就复杂的体系进一步复杂化，增加解析的难度。

核苷酸类属于带负电荷的物质，应用阴离子交换色谱可以进行分离和定量，但离子色谱柱平衡时间长，检测效率低毛细管电泳法由于缓冲溶液的pH值对核苷酸的分离影响较大，容易造成检测结果不稳定。采用高效液相色谱法对核苷酸进行检测在实际检测过程中发现一般C18色谱柱很难对5种核苷酸进行很好的保留和分离，目标化合物很容易受杂峰干扰，流动相中含有离子对试剂，色谱柱平衡时间较长，很容易发生保留时间漂移的情况，样品前处理对杂质的去除效果不理想，对色谱柱寿命影响较大。

发明内容

为了克服现有的氨基酸和核苷酸分离技术中存在的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，该方法前处理操作较为方便，无需对样品进行衍生化处理，基于氨基酸和核苷酸的结构特性，能实现至少17种氨基酸和5种核苷酸较好的分离。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，包含如下步骤：

(1)提取和去除大分子物质干扰：将绞碎后的待测样品和水混合，涡旋振荡均匀；加入甲醇，涡旋振荡均匀；离心，取上清，得到提取物1；

(2)去除脂质对结果的干扰：在步骤(1)制得的的提取物1中加入有机试剂正己烷，涡旋振荡均匀；离心，取上清，得到提取物2；

(3)制备上机前待测液：将步骤(2)制得的提取物2用水稀释定容，过滤，得到上机前待测液；

(4)测定：采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱(UHPLC-Thermo Fisher QExactive Mass Spectrometer)系统对步骤(3)制得的上机前待测液进行检测，根据氨基酸和核苷酸的标准曲线线性回归方程，计算得到待测样品中对应氨基酸和核苷酸的含量；

步骤(1)中所述的样品的用量优选为0.5g；

步骤(1)中所述的甲醇与水的体积比优选为(5～7.5)：(2.5～5)，两者组成沉淀剂，沉淀蛋白质等大分子物质；其中，先加入水并涡旋，使得绞碎后的样品可以完全分散均匀，避免直接加入甲醇水溶液导致沉淀局部发生、提取不完全、大分子物质去除不彻底，进而影响最终结果的准确性；

步骤(1)中所述的甲醇与水的体积比进一步优选为3：1；

步骤(1)中所述的甲醇和水的总体积与样品的质量比优选为10:0.5(mL：g)；

步骤(1)中所述的甲醇和水的总体积与步骤(2)中所述的正己烷的体积比优选为1：1；

步骤(1)和(2)中所述的离心的条件优选为800～4000r/min离心10～15min；

步骤(3)中所述的过滤的滤膜的孔径优选为0.1～0.5μm；

步骤(4)中所述的氨基酸和核苷酸的标准曲线线性回归方程通过如下方法获得：

配制系列浓度梯度的氨基酸和核苷酸标准品工作溶液，采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统对氨基酸和核苷酸标准品工作溶液进行检测，得到各份标准品工作溶液对应的色谱图；以各份标准品工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到氨基酸和核苷酸的标准曲线线性回归方程；

所述的标准品工作溶液的浓度梯度优选为：

胱氨酸标准品工作溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1.0和1.25μmol/L，其他氨基酸标准品工作溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μmol/L；

核苷酸标准品工作溶液10ppb、20ppb、40ppb、60ppb、80ppb、100ppb；

步骤(4)中所述的检测的色谱条件为：

采用XBridge BEH Amide(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，以A-B-C为流动相进行三元梯度洗脱，其中，A：乙腈，B：0.09～0.1％V/V的甲酸水溶液，C：0.09～0.1％V/V的氨水；

步骤(4)中所述的检测的色谱条件进一步优选为：

柱温为30℃，进样量为2～10μL，流速为100μL/min，洗脱条件：平衡5min，梯度洗脱20min；

所述的三元梯度洗脱的程序优选为：

步骤(4)中所述的检测的质谱条件为：

离子化方式：电喷雾电离；

电离方式：正离子和负离子同时扫描；

扫描模式：Full Scan/ddMS²；

分辨率：14000FWHM；

喷射电压：正谱条件(一级)3.0KV，负谱条件(一级)2.8KV；正谱条件(二级)3.0KV，负谱条件(二级)2.8KV；

毛细管温度：320℃；

辅助气加热温度：300℃；

雾化气、鞘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；

所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-丝氨酸(Ser)、L-脯氨酸(Pro)、L-缬氨酸(Val)、L-苏氨酸(Thr)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-天冬氨酸(Asp)、L-赖氨酸(Lys)、L-谷氨酸(Glu)、L-蛋氨酸(Met)、L-组氨酸(His)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-精氨酸(Arg)、L-酪氨酸(Tyr)、L-胱氨酸(Cys)中的至少一种；

所述的核苷酸为胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)中的至少一种；

本发明的原理：

针对现有技术中氨基酸和核苷酸检测存在衍生试剂影响质谱离子源的离子化、目标化合物很容易受杂峰干扰、色谱柱平衡时间较长、容易发生保留时间漂移、样品前处理对杂质的去除效果不理想从而对色谱柱寿命影响较大、无法同时检测多个项目等缺点和不足，本发明在超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱(UHPLC-Thermo Fisher Q ExactiveMass Spectrometer)系统的基础上，开发一种使用XBridge BEH Amide(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱将极性氨基酸和核苷酸良好保留的方法，极大改善氨基酸和核苷酸在LC/MS上的保留问题等。

第一，本发明利用超高效液相色谱四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术的高灵敏度和强抗干扰能力等特点，通过髙分辨质谱全扫描模式提取目标化合物的精确质量数，利用阈值自动触发全扫描二级质谱，在一定程度上消除了基质干扰，且样品前处理方式较为简单，可同时快速筛选和确证样品及标准品中的17种氨基酸(甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-丝氨酸(Ser)、L-脯氨酸(Pro)、L-缬氨酸(Val)、L-苏氨酸(Thr)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-天冬氨酸(Asp)、L-赖氨酸(Lys)、L-谷氨酸(Glu)、L-蛋氨酸(Met)、L-组氨酸(His)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-精氨酸(Arg)、L-酪氨酸(Tyr)、L-胱氨酸(Cys))和5种核苷酸(胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP))。

第二，本发明使用的XBridge BEH Amide氨基柱，其基质为基于亚乙基桥杂化颗粒(BEH)的三键键合酰胺基，三键键合的酰胺基键合相结合技术，提供了优异的柱使用寿命和方法稳健性；能耐受的pH范围较宽，在高pH和高温条件下具有更高的化字稳定性，与高pH流动相的兼容性，有助于MS检测而无需衍生化从而极大简化了LC-MS分析前的样品预处理工作，并提高分析灵敏度。BEH Amide色谱柱采用亚乙基桥杂化颗粒，5μm的粒径使其具有相对较高的塔板数，分离效率更高，可以将17中氨基酸和5种核苷酸与杂质有效分离。

第三，本发明对样品前处理以及色谱条件进行了优化，使样品前处理能够去除更多的杂质，在待测样品前处理过程中采用甲醇：水混合有机溶剂高效的减少待测样品中的大分子化合物干扰，并加入正己烷去除油脂。选择使用分离效果更好的色谱条件，使17中氨基酸和5种核苷酸都达到与杂质的有效分离，从而保证检测数据的准确性。可得到良好的分离结果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)与现有的分离技术相比，本发明采用酸性洗脱和碱性洗脱双重保留机理，采用XBridge BEH Amide色谱柱，基于一项由酸到碱顺序梯度洗脱程序，可达到同时分离带正电荷离子及负电荷离子的目的的，无需添加离子对和衍生化试剂，对强极性物质的保留问题提供一种新的检测方向。

(2)本发明简单易行，大大降低前处理时间和成本，以17种氨基酸和5种核苷酸为典型例子，有效解决同时分离带正电荷离子和带负电荷离子的问题，缩短两类物质的检测时间，减少仪器因误差，便于统一进行数据处理与分析。

(3)本发明提供了一种测定动物组织中17种氨基酸和5种核苷酸的LC-MS/MS正离子模式和负离子模式同时鉴定的检测方法，该方法具有优异的重现性、准确性和灵敏度。

(4)本发明为相关部门制定相应法律法规提供了技术支持及日后食品领域的研究提供参考。

附图说明

图1是17种氨基酸标准品的提取离子色谱图(Amide色谱柱)；其中，1-NL:2.64E6,m/z＝76.03550-76.04310；2-NL:1.38E7,m/z＝90.05046-90.05946；3-NL:1.50E7,m/z＝106.04457-106.05517；4-NL:8.10E7,m/z＝116.06481-116.07641；5-NL:6.00E7,m/z＝118.08036-118.09216；6-NL:2.47E7,m/z＝120.05952-120.07152；7-NL:1.11E8,m/z＝132.09530-132.10852；8-NL:7.94E6,m/z＝134.03808-134.05148；9-NL:1.30E7,m/z＝147.11206-147.11354；10-NL:2.41E7,m/z＝148.05969-148.06117；11-NL:5.86E7,m/z＝150.05758-150.05908；12-NL:2.18E7,m/z＝156.07597-156.07753；13-NL:5.02E7,m/z＝166.08543-166.08709；14-NL:5.85E7,m/z＝175.11807-175.11983；15-NL:4.06E7,m/z＝182.08206-182.08208；16-NL:4.20E7,m/z＝241.02991-241.0323。

图2是5种核苷酸标准品的提取离子色谱图(Amide色谱柱)；其中，1-NL:8.87E7,m/z＝322.04296-322.04618；2-NL:1.20E7,m/z＝323.02967-323.0302；3-NL:7.03E6,m/z＝346.05408-346.05754；4-NL:6.83E6,m/z＝347.03808-347.04158；5-NL:2.98E6,m/z＝362.04891-362.05253。

图3是17种氨基酸标准品的提取离子色谱图(C18色谱柱)；其中，1-NL:2.46E7,m/z＝76.03550-76.04310；2-NL:5.72E7,m/z＝90.05046-90.05946；3-NL:2.17E7,m/z＝106.04457-106.05517；4-NL:8.15E7,m/z＝116.06481-116.07641；5-NL:1.98E8,m/z＝118.08036-118.09216；6-NL:4.33E7,m/z＝120.05952-120.07152；7-NL:1.81E8,m/z＝132.09530-132.10852；8-NL:1.05E7,m/z＝134.03808-134.05148；9-NL:2.13E7,m/z＝147.11206-147.11354；10-NL:7.14E7,m/z＝148.05969-148.06117；11-NL:3.17E7,m/z＝150.05758-150.05908；12-NL:2.86E8,m/z＝156.07597-156.07753；13-NL:1.00E8,m/z＝166.08543-166.08709；14-NL:7.90E7,m/z＝175.11807-175.11983；15-NL:3.29E7,m/z＝182.08206-182.08208；16-NL:4.01E5,m/z＝241.02991-241.03233。

图4是5种核苷酸标准品的提取离子色谱图(C18色谱柱)；其中，1-NL:2.26E5,m/z＝322.04296-322.04618；2-NL:8.48E5,m/z＝323.02967-323.0302；3-NL:6.73E6,m/z＝346.05408-346.05754；4-NL:3.19E7,m/z＝347.03808-347.04158；5-NL:1.07E6,m/z＝362.04891-362.05253。

图5是17种氨基酸标准品的提取离子色谱图(Amide色谱柱、两相洗脱)；其中，1-NL:5.51E6,m/z＝76.03550-76.04310；2-NL:1.56E7,m/z＝90.05046-90.05946；3-NL:2.04E7,m/z＝106.04457-106.05517；4-NL2.04E7,m/z＝116.06481-116.07641；5-NL:9.27E7,m/z＝118.08036-118.09216；6-NL:3.38E7,m/z＝120.05952-120.07152；7-NL:1.56E7,m/z＝132.09530-132.10852；8-NL:1.03E7,m/z＝134.03808-134.05148；9-NL:1.77E7,m/z＝147.11206-147.11354；10-NL:3.16E7,m/z＝148.05969-148.06117；11-NL:1.02E8,m/z＝150.05758-150.05908；12-NL:8.12E7,m/z＝156.07597-156.07753；13-NL:1.71E8,m/z＝166.08543-166.08709；14-NL:9.90E7,m/z＝175.11807-175.11983；15-NL:1.08E8,m/z＝182.08206-182.08208；16-NL:2.19E7,m/z＝241.02991-241.03233。

图6是5种核苷酸标准品的提取离子色谱图(Amide色谱柱、两相洗脱)；其中，1-NL:3.16E5,m/z＝322.04296-322.04618；2-NL:2.92E6,m/z＝323.02967-323.0302；3-NL:1.20E7,m/z＝346.05408-346.05754；4-NL:8.00E7,m/z＝347.03808-347.04158；5-NL:1.30E6,m/z＝362.04891-362.05253。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例所用到的仪器和设备：

(1)液相色谱-质谱/质谱联用仪：超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱(UHPLC-Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer)系统；

(2)电子天平：精确到0.01mg，0844cf0173-1(华南国家计量测试中心广东省计量科学研究院)；

(3)离心机：最高转速4000r/min(长沙湘智离心机仪器有限公司)；

(4)微孔滤膜：0.22μm(上海安普科学仪器公司)；

(5)移液枪：5mL、1000μL、100μL，

S(Brand公司，德国)；

(6)带螺盖耐热离心管或者其他能够密封的耐热离心管：50mL；

(7)注射器：1mL、2mL。

以下实施例所用到的试剂与溶液：

水为去离子水；17种氨基酸标准品和5种核苷酸标准品：购自国家标准物质研究中心，纯度为≥99.99％；甲醇：色谱纯；正己烷：色谱纯。

实施例1检测方法的选择、建立及优化

1、鸡肉样品前处理方法

(1)样品制备：将屠宰24h后的鸡的胴体，用白切鸡的做法处理：将胴体放入烧开的沸水中，水量要求淹没胴体，盖上电磁炉锅盖，焖20min，取出胴体，再次把水烧开，将胴体再放进开水中浸泡20min，最后取出，放凉，取鸡胸肉绞碎。

(2)提取和去除大分子物质干扰：称0.5g绞碎后的鸡肉样品于50mL离心管中，加入纯水，涡旋振荡均匀；再加入甲醇涡旋振荡均匀以沉淀蛋白质等大分子物质，其中，甲醇和水的体积比为3：1，甲醇和水的用量为10mL；4000r/min离心15min，取上清，得到提取物1；

(3)去除脂质对结果的干扰：在步骤(2)制得的提取物1中加入10mL正己烷有机试剂，涡旋振荡均匀，4000r/min离心15min，取上清，得到提取物2；

(4)制备上机前待测液：将步骤(3)制得的提取物2用水定容至5mL，得待测样品溶液；取1mL过0.22μm滤膜至进样瓶中，得到上机前待测液；

2、标准品工作溶液的制备

(1)分别取25.00μL的2.50μmol/L氨基酸标准品溶液(共计17种)及25.00μL的10pmm核苷酸标准品溶液(共计5种)于50mL的容量瓶中定容作为储备液，加入0.1N HCl溶液，将混合储备液稀释0.1倍、0.2倍、0.4倍、0.6倍和0.8倍，充分摇匀后得到浓度分别为0.25μmol/L、0.50μmol/L、1.00μmol/L、1.50μmol/L、2.00μmol/L、2.50μmol/L的17种氨基酸标准品工作溶液(胱氨酸的浓度减半)及10ppb、20ppb、40ppb、60ppb、80ppb、100ppb的5种核苷酸标准品工作溶液，置于带密闭的试管；

(2)用1.0mL注射器过0.22μm微孔滤膜；

(3)取过滤后的标准品溶液至进样瓶，17种氨基酸和5种核苷酸标准品工作溶液，由液相色谱串联质谱测定。

3、仪器参数及测定条件的选择及优化

(1)色谱条件：

赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC-Thermo Fisher系列高效液相色谱系统；流速为100μL/min，进样体积2μL；洗脱条件：平衡5min，梯度洗脱20min。梯度洗脱程序如表1所示，其中，A相为乙腈，B相为0.09％V/V甲酸水溶液，C相为0.09％V/V氨水。

表1 梯度洗脱程序

时间(min)	流速(μL/min)	A(％)	B(％)	C(％)
					-5	100	75	25	0
0	100	75	25	0
					7	100	50	45	5
8.1	100	100	0	0
					10.1	100	40	0	60
18	100	20	0	80
					19.1	100	100	0	0
20	100	100	0	0

(2)色谱柱：XBridge BEH Amide(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱；结合柱效和稳定性俩方面考虑，柱温设定为30℃，此时氨基柱对极性物质的分离效果较好。

(3)质谱条件：

1)质谱仪：四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司)

2)离子化方式：电喷雾电离；

3)电离方式：正离子和负离子同时扫描；

4)扫描模式：Full Scan/ddMS²；

5)分辨率：14000(FWHM)；

6)毛细管温度：加热电喷雾离子化源(ESI+)320℃，(ESI-)320℃；

雾化气、鞘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求(表2)。

7)采用inclusion列表包含目标物的分子式，监测离子对如表3所示。

表2 质谱条件参数

表3 17种氨基酸和5种核苷酸的检测离子对

(4)流动相条件的选择及优化

本实施例首先在制备的标准品工作溶液的基础上，摸索能实现有效分离17种氨基酸和5种核苷酸的流动相条件，发现当流动相为乙腈(A)-(0.09～0.1％)甲酸水(B)-(0.09～0.1％)氨水(C)＝0～100：0～45：0～80(V/V/V)时，氨基酸和核苷酸的峰分离得较好，可同时检测17种氨基酸和核苷酸。

4、色谱分析

吸取2μL标准品工作溶液注入液相色谱-质谱/质谱联用仪，在上述质谱条件下测定试样的响应峰面积(应在仪器检测的线性范围内)。按ESI⁺、ESI^-离子模式进样，通过高分辨质谱全扫描模式提取目标化合物的精确质量数，利用阈值自动触发全扫描二级质谱，得到标准品的离子色谱图，如图1和图2所示。

5、定性定量测定

(1)定性标准

在相同测试条件下，样品中待检测物质与同时检测的标准品应具有相同的保留时间，偏差在±2.5％之内；样品中待确证的化合物的二对特征离子的相对丰度比应与同时检测的标准品一致，相对误差在±30％。

(2)定量方法

以各标准品的特征离子中信号响应高且无干扰的离子为定量离子，进行外标法定量分析。以标准溶液的响应峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。标准曲线应至少包含5个浓度点(包括零点)，本方法包括7个浓度点(包括零点)。依据测定的待测样品响应峰面积，在标准曲线上查出(或回归方程计算出)样品中17种氨基酸和5种核苷酸的含量，再乘以稀释倍数。

6、结果的计算

(1)确证分析

样品的LC-MS/MS数据符合下列要求时，可判定为阳性：

a：在相同试验条件下，样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5％以内。

b：监测离子的信噪比应≥3。

c：如果达到前两项要求，则计算3个不同的比值。并且在样品含量对应的水平下同时计算被测物标准响应离子的比值，对未知样品(例如鸡肉样品)阳性结果的定性鉴定，所得到的离子比率应在如表4规定范围内。

表4 所应用的各种质谱相对离子强度最大允差

(2)计算

通过Trace Finder软件处理，设定母离子和碎片离子的质量数偏差5ppm，保留时间窗口60s，碎片离子数为2，信噪比设定为1000，根据标准曲线数据及样品的峰面积数据，可以得到样品中17种氨基酸和5种核苷酸的质量浓度，氨基酸和核苷酸单位分别为μmol/mL、ppb。

7、检测方法评价

(1)相关系数

17种氨基酸的标准曲线在0.125μmol/L～2.500μmol/L的浓度范围内(胱苷酸的浓度减半)，5种核苷酸的标准曲线在10ppb～100ppb的浓度范围内，响应值与质量浓度呈良好的线性关系。所得标准品的回归方程为及相关系数如表5所示。

表5 17种氨基酸和5种核苷酸标准品的标准曲线

(2)测定限

实验以空白测量的3倍标准差为测定低限，10倍标准差为定量检测限，平行测定3次取平均值，得出所建立的液相色谱-串联质谱法的检出限。

如上，回归系数R²>0.99，测定结果显示，该方法的定性限(三倍信噪比)为0.0001mg/kg，定量限(10倍信噪比)为0.001mg/kg，应用本方法可以解决现有方法检测限过高，无法测定低浓度17种氨基酸和5种核苷酸的问题。

(3)回收率

另外，针对不同类型的鸡肉样品，准确量取已知17种氨基酸和5种核苷酸含量的供试样品，再分别加入一定量的17种氨基酸和5种核苷酸的标准样品10.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L，按上述方法，计算出样品的峰面积，计算加标回收率，结果如表6所示。

由该实验结果得到，各种不同品种鸡肉中17种氨基酸和5种核苷酸的平均回收率范围在80.15％～97.43％之间。

表6 鸡肉样品中17种氨基酸和5种核苷酸的加标回收率

(4)精密度

同时测定同一鸡肉样品中17种氨基酸和5种核苷酸含量(添加浓度为10.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L)，反复测定5次，根据样品的峰面积，计算该测定方法的精密度。

实验结果如表7所示，本方法检测的变异系数小于10％。

表7 17种氨基酸和5种核苷酸测定方法的精密度

实施例2不同鸡肉样品中17种氨基酸和5种核苷酸的测定

1、利用实施例1所述待测样品预处理的方法预处理各类不同品种的鸡肉样品后，再按照实施例1所述的仪器参数及测定条件，进行液相色谱串联质谱测定，将得到的质谱信息导入TransFinder软件进行统一定量处理，与标准曲线上的浓度对应，所得到的样品浓度乘以1000倍的稀释倍数，最后计算出待测不同品种的鸡肉样品中的17种氨基酸和5种核苷酸含量。

实验所用各种不同品种的鸡肉样品均为温氏集团有限责任公司的养殖中心提供。

2、检测结果如表8所示，测定了5个不同品种的鸡肉样品。

表8 不同品种的鸡肉样品的17种氨基酸和5种核苷酸实测值

而已知报道的测定氨基酸和核苷酸的方法基本上都是需要衍生步骤的，不衍生的方法很难做到17种氨基酸和5种核苷酸分离良好，且在分离过程中是先用酸洗脱把氨基酸洗脱出来，再用碱洗脱把核苷酸分离出来。

本发明在超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱(UHPLC-Thermo Fisher QExactive Mass Spectrometer)系统的基础上，开发一种使用XBridge BEH Amide(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱实现以17种氨基酸和5种核苷酸的准确检测，具有如下特点：

(1)正离子模式和负离子模式联用——实现以17种氨基酸和5种核苷酸为典型代表的正离子和负离子的准确检测

①本研究利用高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术的高灵敏度和强抗干扰能力等特点，通过高分辨质谱全扫描模式(正离子模式和负离子模式联用)提取目标化合物的精确质量数，利用阈值自动触发全扫描二级质谱，在一定程度上消除了基质干扰，且样品前处理方式较为简单，可同时快速筛选和确证样品中的17种氨基酸和5种核苷酸。

②核苷酸中同时存在氨基和磷酸基团，正负离子模式均可。通过核苷的结构可知，核苷在正离子模式下电离较为稳定，经过多次实验结果分析中发现，运用本方法使核苷酸在负离子模式下电离也很稳定。

③正离子模式和负离子模式的联用，使得在样品检测时得到更多的质谱信息，为下一步更深入挖掘数据处理与深层分析提供更多可选择的信息，为广大科研工作者提供一个有效可行的参考方向。

(2)XBridge BEH Amide氨基柱与三相洗脱法联用——实现以17种氨基酸和5种核苷酸为典型代表的正离子和负离子的分步洗脱

①氨基酸和核苷酸都为强极性水溶性物质，为了达到较好的分离效果，在C18上几乎没有保留，且在常规反向色谱柱上保留较弱，易受样品中杂质的干扰，所以应选择对极性化合物保留能力强、能耐受高水相的色谱柱，氨基柱对强极性的分离效果较好，同时，选用pH耐受范围广的色谱柱—XBridge BEH Amide氨基柱，能更好调节流动相pH范围，达到更好的分离目的，便于方法学的探索。实验结果显示，XBridge BEH Amide氨基柱所测得的回收率、样品的浓度及含量均比普通C18柱所得到的效果好。氨基柱所得氨基酸和核苷酸的提取离子色谱图如图1、图2所示，C18所得的氨基酸和核苷酸的提取离子色谱图如图3、图4所示。

②核苷酸本身呈酸性，氨基酸本身呈碱性，在流动相中加入少量甲酸可提供酸性环境、促进核苷的电离和提高质谱响应，但是酸含量过高会对核苷酸产生电离抑制，不利于质谱响应经过比较确定，在加入含0.09％甲酸水的流动相环境中，氨基酸和核苷酸都可以达到较高的质谱响应，且氨基酸在正离子模式、核苷酸在负离子模式的分离下得到的结果都很稳定，同时，相对于较普遍的两相分离的基础上再加一相，使得整个超高效液相色谱分离系统成为三相，即“三相洗脱法”—C相中加入0.09％氨水，所得氨基酸和核苷酸的提取离子色谱图如图1、图2所示，对比实验的两相分离法，即乙腈和0.09％甲酸水作为流动相所得到氨基酸和核苷酸的提取离子色谱图如图5、图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于包含如下步骤：

(4)测定：采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统对步骤(3)制得的上机前待测液进行检测，根据氨基酸和核苷酸的标准曲线线性回归方程，计算得到待测样品中对应氨基酸和核苷酸的含量；

步骤(4)中所述的检测的色谱条件为：

步骤(4)中所述的检测的质谱条件为：

离子化方式：电喷雾电离；

电离方式：正离子和负离子同时扫描；

扫描模式：Full Scan/ddMS²；

分辨率：14000FWHM；

喷射电压：正谱条件/一级3.0KV，负谱条件/一级2.8KV；正谱条件/二级3.0KV，负谱条件/二级2.8KV；

毛细管温度：320℃。

2.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的甲醇与水的体积比为(5～7.5)：(2.5～5)。

3.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的甲醇和水的总体积与样品的质量比为10：0.5。

4.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的甲醇和水的总体积与步骤(2)中所述的正己烷的体积比为1：1。

5.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

配制系列浓度梯度的氨基酸和核苷酸标准品工作溶液，采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统对氨基酸和核苷酸标准品工作溶液进行检测，得到各份标准品工作溶液对应的色谱图；以各份标准品工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到氨基酸和核苷酸的标准曲线线性回归方程。

6.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

所述的标准品工作溶液的浓度梯度为：

核苷酸标准品工作溶液10ppb、20ppb、40ppb、60ppb、80ppb、100ppb。

7.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的检测的色谱条件为：

柱温为30℃，进样量为2～10μL，流速为100μL/min；洗脱条件：平衡5min，梯度洗脱20min。

8.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

所述的三元梯度洗脱的程序为：

9.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

所述的氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的LC-MS/MS的检测方法，其特征在于：

所述的核苷酸为胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸中的至少一种。