CN113419007B - 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 - Google Patents
一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113419007B CN113419007B CN202110700181.9A CN202110700181A CN113419007B CN 113419007 B CN113419007 B CN 113419007B CN 202110700181 A CN202110700181 A CN 202110700181A CN 113419007 B CN113419007 B CN 113419007B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- creatinine
- mobile phase
- detection
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒,涉及检测分析技术领域。该方法采用样本沉淀剂对血清样本或尿液样本进行快速处理,以形成用于液相色谱串联质谱检测的待测样本溶液;所述样本沉淀剂为含三(2‑羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水,在待测样本溶液中,乙腈的体积终浓度为50%~70%,三(2‑羧乙基)膦盐酸盐TCEP的终浓度为0.1~5μg/μL。本发明将样本检测前的处理时间有效缩短为15分钟以内,且能够实现对多种样本(如血清、血浆和尿液)中多种氨基酸以及肌酐的快速检测,为多种氨基酸以及肌酐的定量检测提供了途径。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域,具体而言,涉及一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒。
背景技术
氨基酸,是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物,化学式是RCHNH2COOH,氨基酸是蛋白质的基本单元,是生物体内不可缺少的营养成分。体内氨基酸水平处于内源性蛋白质的释放与各组织利用之间的动态平衡之中,氨基酸水平的失衡,是众多疾病的诱因或表现形式,涉及代谢、肿瘤、免疫、病毒感染、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和儿童生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等人体各种健康环节。全谱氨基酸检测通过对人体内的氨基酸精确定量,揭示人体内详细的氨基酸代谢状况,从而从不同的代谢路径提示人体的健康状况。另外氨基酸制剂在临床上广泛应用于相关疾病的治疗和营养支持。因此监测体内氨基酸水平的变化规律,对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
对于大多数氨基酸及其类似物而言,其亲水性强不易在反相柱上保留,很快会被冲洗出来,且由于不含苯环等强紫外吸收基团,其整个分子的紫外吸收光谱很弱。目前,定量检测血清样本和尿液等样本中游离氨基酸的方法主要采用柱前衍生或柱后衍生的液相色谱法。但液相色谱方法的缺陷主要在于对复杂基质的分离效果不好,由于血样、尿液等样本是一个复杂的基质,存在很多性质类似的小分子化合物,会对目标化合物的色谱分离峰产生干扰,特别是对于低丰度的氨基酸,往往很难准确定性和定量,导致结果误差很大,同时不管是柱前衍生还是柱后衍生的普通液相色谱法,其在仪器上分析的时间都很长,一个样品通常需要运行1-2个小时左右。而且对于PITC衍生试剂,对色谱柱有很强的破坏作用,而OPA衍生后的衍生产物却很不稳定,AQC购买又很贵,茚三酮又是一种致癌性很强的有机化合物。
如何有效准确地测定多种氨基酸是目前亟待解决的技术难题之一。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的方法,所述目标氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、胱硫醚、半胱氨酸、同型半胱氨酸、高瓜氨酸、肌氨酸和牛磺酸中的至少一种;
所述方法包括:将添加有内标的样本溶液与样本沉淀剂混合后形待测样本溶液用于液相色谱串联质谱检测;
所述样本沉淀剂为含三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水,在所述待测样本溶液中,乙腈的体积终浓度为50%~70%,三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的终浓度为0.1~5 μg/μL。
第二方面,本发明实施例提供了一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的试剂盒,应用于如前述实施例所述的方法,所述试剂盒包括如样本沉淀剂,所述样本沉淀剂为含三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水。
本发明具有以下有益效果:
本发明采用一种新的样本沉淀剂对血清/血浆样本或尿液样本进行预处理,将样本检测前的处理时间有效缩短为15分钟以内,且能够实现对多种类型的样本(如血清、血浆和尿液)中多种氨基酸以及肌酐的快速检测,为多种氨基酸以及肌酐的定量检测提供了途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中检测方法的流程示意图;
图2为试验例1中的TIC色谱图;
图3为试验例2中本发明实施例2提供的检测方法的检测结果;
图4为试验例2中对比例1提供的检测方法的检测结果;
图5为试验例3中本发明实施例2提供的检测方法的检测结果;
图6为试验例3中对比例1的检测方法的检测结果;
图7为试验例4中本发明实施例2提供的检测方法的检测结果;
图8为试验例4中对比例1提供的检测方法对应的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的方法,所述目标氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、胱硫醚、半胱氨酸、同型半胱氨酸、高瓜氨酸、肌氨酸和牛磺酸中的至少一种;
所述方法包括:将添加有内标的样本溶液与样本沉淀剂混合后形待测样本溶液用于液相色谱串联质谱检测;
所述样本沉淀剂为含三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水,在所述待测样本溶液中,乙腈的体积终浓度为50%~70%,三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的终浓度为0.1~5 μg/μL。
本发明不对目标氨基酸的构型(L型和D型)作具体限定,只要采用本发明实施例提供的方法用于上述任意目标氨基酸的检测,则属于本发明的保护范围。
肌酐可用于校正尿液样本中氨基酸的浓度水平。同时可作为肾功能标志物。
优选地,所述目标氨基酸包括:L-丙氨酸(Ala,L-Alanine)、L-精氨酸(Arg,L-Arginine)、L-天冬酰胺(Asn,L-Asparagine)、天冬氨酸(Asp,L-Aspartic acid)、L-瓜氨酸(Cit,L-Citeulline)、L-谷氨酸(Glu,L-Glutamic acid)、L-谷氨酰胺(Gln,Glutamine)、甘氨酸(Gly,Glycine)、L-组氨酸(His,L-Histidine)、L-亮氨酸(Leu,L-Leucine)、L-异亮氨酸(Ile,L-Isoleucine)、L-赖氨酸(Lys,L-Lysine)、L-甲硫氨酸(Met,L-Methionine)、L-鸟氨酸(Orn,L-Ornithine)、L-苯丙氨酸(Phe,L-Phenylalanine)、L-脯氨酸(Pro,L-Proline)、L-丝氨酸(Ser,L-Serine)、L-苏氨酸(The,L-Threonine)、L-色氨酸(Trp,L-Tryptophan)、L-酪氨酸(Tyr,L-Tyrosine)、L-缬氨酸(Val,L-Valine)、牛磺酸(Tau,Taurine)、肌氨酸(Sar,Sarcosine)、同型半胱氨酸(Hcy,Homocysteine)、L-半胱氨酸(Cys,L-Cysteine)、L-胱硫醚(Cth,L-Cystathionine)、β-丙氨酸(β-Ala,β-Alanine)、L-高瓜氨酸(Hit,L-Homocitrulline)和γ-氨基丁酸(GABA,4-Aminobutyricaeid)中的至少一种。
具体地,肌酐的缩写为Cre,Creatinine。
本文中的“样本沉淀剂”中的沉淀是其具有的其中一个技术效果,并不对其具有的其他功效有限定作用。
本发明实施例提供的样本沉淀剂中含有的三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP具有还原剂的功效,其能够将血浆基质中同型半胱氨酸与半胱氨酸还原为还原态,实现对血浆中同型半胱氨酸和半胱氨酸的准确测定。
三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP,作为还原剂,能够将血浆基质中半胱氨酸与半胱氨酸还原为还原态,添加入乙腈溶液中与样本混合,能够快速对样本进行预处理,实现对血浆中同型半胱氨酸和半胱氨酸的准确测定。
在本发明实施例的浓度限定下,样本沉淀剂能够有效地实现对血清以及尿液样本的预处理,使得处理后的样本能够直接用于液相色谱串联质谱分析,完成对样本中29种氨基酸以及肌酐的有效检测。
优选地,所述样本选自血清样本、血浆样本以及尿液样本中的任意一种。本发明提供的方法能够同时针对血液以及尿液样本实现29种氨基酸以及肌酐的检测,检测效率高,适用范围广。
在一些实施例中,乙腈的体积终浓度可以为50%、60%、70%、80%、90%中的任意一种;三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的终浓度可以为0.1μg/μL、1.67μg/μL、2.67μg/μL、3.67μg/μL、4.67μg/μL和5μg/μL中的任意浓度。更具体地,样本沉淀剂可以由以下方法配置而成:在乙腈溶液中按照浓度添加TCEP;乙腈溶液可以由乙腈与水按照一定体积混合比配置而成。
优选地,添加有内标的样本溶液与样本沉淀剂的混合时间为1~15 min。在一些实施例中,混合时间可以为1min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10min、11 min、12 min、13 min、14 min和15 min中的任意时间。
在一些实施例种,液相色谱的条件可根据检测需要选自现有的色谱条件。
优选地,所述液相色谱的条件为:洗针液:体积浓度为40%~60%的乙腈水;柱温为38~42℃;进样器温度为8~12℃;进样量为1~2μL;流动相A:20~40mM甲酸铵水溶液;流动相B为含甲基叔丁基醚和甲酸的乙腈溶液,在所述流动相B中,甲基叔丁基醚的体积浓度为20%~30%,甲酸的体积浓度为0.05%~0.15%;梯度洗脱。
经一系列创造性劳动,基于血清样本以及尿液样本的特点,以及29种氨基酸以及肌酐的性质,本发明发现色液相色谱条件进行了优化,在上述优选的液相色谱的条件范围内进行检测,能够得到更精准有效的检测结果。
在一些实施例中,洗针液的体积浓度可以为40%、45%、50%、55%、60%中的任意一种;柱温可以为38℃、39℃、40℃、41℃、42℃中的任意温度;进样量可以为1μL、1.5μL和2μL中的任意体积;流动相A可以为20mM、25 mM、30 mM、35 mM、40 mM中任意浓度的甲酸铵水溶液;流动相B中,甲基叔丁基醚的体积浓度可以为20%、22%、24%、26%、28%、30%中的任意浓度;甲酸的体积浓度可以为0.05%、0.10%、0.15%中的任意浓度。
优选地,所述梯度洗脱的洗脱程序如(1)~(2)中任一项的表格所示:
(1):
表1 洗脱程序
时间( min ) | 流速( mL/min ) | 流动相 A | 流动相 B |
起始 | 0.3~0.5 | 13%~17% | 83%~87% |
1.60~2.0 | 0.3~0.5 | 15%~19% | 81%~85% |
4.00~4.40 | 0.3~0.5 | 26%~30% | 70%~74% |
6.30~6.70 | 0.3~0.5 | 48%~52% | 58%~52% |
6.70~7.10 | 0.3~0.5 | 48%~52% | 48%~52% |
6.80~7.20 | 0.3~0.5 | 13%~17% | 83%~87% |
7.80~8.20 | 0.3~0.5 | 13%~17% | 83%~87% |
(2):
表2 洗脱程序
时间( min ) | 流速( mL/min ) | 流动相 A | 流动相 B |
0.00 | 0.400~0.600 | 18%~22% | 78%~82% |
2.10~2.50 | 0.400~0.600 | 19%~23% | 77%~81% |
5.70~6.10 | 0.400~0.600 | 38%~42% | 58%~62% |
5.90~6.30 | 0.400~0.600 | 38%~42% | 58%~62% |
5.91~6.31 | 0.400~0.600 | 18%~22% | 78%~82% |
6.80~7.20 | 0.400~0.600 | 18%~22% | 78%~82% |
只要采用以上洗脱程序实现待测物洗脱,以完成血清或尿液样本中目标氨基酸以及肌酐检测的,均属于本申请的保护范围内。
优选地,所述(1)项洗脱条件的适用机型包括Waters Acquity UPLC;(2)项洗脱条件适用机型包括岛津Jasper HPLC。不同仪器型号适宜的检测条件不同,表1的洗脱程序与Waters Acquity UPLC相适宜,表2的洗脱程序与岛津Jasper HPLC相适宜,对应结合,能够实现更佳的检测效果。
优选地,所述液相色谱为亲水作用色谱。本发明采用的是非衍生法的样本前处理,各检测项目极性较大,普通反相色谱无法保留,而亲水作用色谱对各检测项目(29种氨基酸以及肌酐)均具有很好的色谱保留。
优选地,所述液相色谱采用的色谱柱为:键合酰胺官能团的正相柱,粒径为2.5μm~3.5μm,内径为 2.1 cm~3.0 cm,柱长为30 cm~100cm。
优选地,所述质谱条件为:扫描模式为MRM;离子化模式为:正离子模式;离子源为ESI;去溶剂温度为550~620℃;去溶剂流速为:480~520 L/Hz;毛细管电压:3.3~5.5kV。
在一些实施例中,去溶剂温度可以为550℃、560℃、570℃、580℃、590℃、600℃、610℃、620℃中的任意温度;去溶剂流速可以为480 L/Hz、490 L/Hz、500 L/Hz、510 L/Hz和520 L/Hz中的任意流速;毛细管电压可以为3.3kV、3.5kV、4.0 kV、4.5 kV、5.0 kV和5.5 kV中的任意电压。
本发明的检测原理:
采用样本沉淀剂处理样本后,进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析,待测物经色谱分离后,导入质谱仪,在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下,聚焦进入三重四级杆质量分析器。在第一级四级杆(Q1)中,带电离子按质荷比分离,筛选出母离子,随后进入第二极四级杆(Q2)中,在碰撞气体和碰撞能量的作用下,碎裂形成碎片离子,产生的碎片离子进入到第三极四级杆(Q3),按质荷比分离,筛选出目标子离子,最终进入检测器,产生信号。将校准品中29种氨基酸与肌酐分别与其相应内标的峰面积比值与标示浓度进行线性拟合,绘制标准曲线。将实际样本中的29种氨基酸以及肌酐分别与其内标的峰面积比值代入拟合的标准曲线方程,即可计算出待测物浓度。
此外,本发明实施例还提供了一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的试剂盒,应用于如前述任意实施例所述的方法,所述试剂盒包括如样本沉淀剂,所述样本沉淀剂为含三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水。
优选地,在所述样本沉淀剂中,乙腈的体积浓度为80%~99%,三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的浓度为1~10 mg/mL。
在一些实施例中,所述样本沉淀剂中的乙腈的体积浓度可以为80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%中的任意一种;三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL和10 mg/mL中的任意浓度。
优选地,所述检测试剂盒还包括流动相A和/或流动相B;
所述流动相A为20~40mM甲酸铵水溶液;
流动相B为含甲基叔丁基醚和甲酸的乙腈溶液,在所述流动相B中,甲基叔丁基醚的体积浓度为20%~30%,甲酸的体积浓度为0.05%~0.15%;
流动相A和流动相B的具体选择同前述实施例,不再赘述。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
优选地,所述试剂盒还包括以下至少一种试剂:校准品、低值质控品、高值质控品、内标准品、稳定剂以及针洗液。
校准品为含有不同浓度水平的29种氨基酸以及肌酐。
低值质控品为含低水平的29种氨基酸以及肌酐。
高值质控品为含高水平的29种氨基酸以及肌酐。
内标准品为含有29种氨基酸以及肌酐的同位素内标。
稳定剂为含40~60 mg/mL硼酸的0.8~1.2 M HCl溶液。可选地,稳定剂中硼酸的终浓度可以为40mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、55 mg/mL、60 mg/mL终的任意浓度,HCl的浓度可以为0.8M、0.9M、1.0 M、1.1 M和1.2 M中的任意浓度。
针洗液可以由甲醇与水按照1:(0.5~1.5)的体积比混合配置而成。
需要说明的是,各试剂的规格可以基于实际需要进行选择性设置。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的试剂盒,其包括如表3所示的试剂。
表3 产品组成
样本沉淀剂为含5mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP(还原剂)的90%(体积浓度)乙腈水;
流动相A添加剂为甲酸铵;在其他实施例中,流动相A添加剂也可以替换为流动相A(30mM甲酸铵水溶液);
流动相B为含甲基叔丁基醚和甲酸的乙腈溶液,在所述流动相B中,甲基叔丁基醚的体积浓度为25%,甲酸的体积浓度为0.1%。
校准品以及质控品的浓度详见表4。
表4 校准品以及质控品的目标浓度水平
校准品( μg/mL ) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 低值质控( μg/mL ) | 高值质控( μg/mL ) |
L- 丙氨酸( Ala ) | 1 | 2 | 4 | 10 | 40 | 100 | 4 | 80 |
L- 精氨酸( Arg ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 天冬酰胺( Asn ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 天冬氨酸( Asp ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 瓜氨酸( Cit ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 谷氨酸( Glu ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 谷氨酰胺( Gln ) | 1.5 | 3 | 6 | 15 | 60 | 150 | 6 | 120 |
L- 甘氨酸( Gly ) | 15 | 30 | 60 | 150 | 600 | 1500 | 60 | 1200 |
L- 组氨酸( His ) | 2 | 4 | 8 | 20 | 80 | 200 | 4 | 80 |
L- 亮氨酸( Leu ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 异亮氨酸( Ile ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 赖氨酸( Lys ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 甲硫氨酸( Met ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 鸟氨酸( Orn ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 苯丙氨酸( Phe ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 脯氨酸( Pro ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 丝氨酸( Ser ) | 1 | 2 | 4 | 10 | 40 | 100 | 4 | 80 |
L- 苏氨酸( Thr ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 色氨酸( Trp ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 酪氨酸( Tyr ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 缬氨酸( Val ) | 1 | 2 | 4 | 10 | 40 | 100 | 4 | 80 |
β- 丙氨酸( β-Ala ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
γ- 氨基丁酸( GABA ) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 1 | 4 | 10 | 0.4 | 8 |
L- 胱硫醚( Cth ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 半胱氨酸( Cys ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
同型半胱氨酸( Hcy ) | 0.5 | 1 | 2 | 5 | 20 | 50 | 2 | 40 |
L- 高瓜氨酸( Hit ) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 1 | 4 | 10 | 0.4 | 8 |
牛磺酸( Tau ) | 2 | 4 | 8 | 20 | 80 | 200 | 8 | 160 |
肌氨酸( Sar ) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 1 | 4 | 10 | 0.4 | 8 |
肌酐( Cre ) | 15 | 30 | 60 | 150 | 600 | 1500 | 60 | 1200 |
备注:试剂盒内校准品、质控品和内标准品组分于-18℃±8℃条件下避光储存,流动相A添加剂、流动相B和稳定剂组分于2℃~8℃ 避光保存。开封后,于2℃~8℃ 避光储存30天。
标准品的配制:精密吸取各种氨基酸储备液,用10 mM PBS水溶液稀释,配制成不同浓度的标准曲线样品。
质控品的配制:精密吸取各种氨基酸储备液,用10 mM PBS水溶液稀释,配制成不同浓度的质控样品。
样本需求:
1.样本类型:本试剂盒适用于人血清或者尿液样本,血清或者尿液量要求≥0.3mL。2.样本采集和制备:样本采集时应空腹,并严格登记,确保每个样本的信息准确。血清样本采集时,用不含任何添加剂或促凝剂的采血管取血,采血后2小时内,于1000~1200 g离心15分钟,收集上清液。尿液样本应采集清晨中段尿液,装于无菌尿杯中,在 1h 内于4℃,2000~4000g离心并将尿沉渣、细胞碎片去除,转移一定量上清液,按照9:1比例添加样本稳定剂,混匀后可运输或储存。
3.样本储存以及运输:已采集的血清样本,室温(10~30℃)储存不超过6 h;2℃-8℃ 条件下储存,可稳定放置 4天;避免冻存样本。已采集并且添加稳定剂的尿液样本,室温(10~30℃) 储存不超过24 h;2℃~8℃ 条件下储存不超过4天,-18℃±8℃条件下储存不超过7天。
实施例2
本实施例提供一种用于检测样本中目标氨基酸和/或肌酐的检测方法,其包括以下步骤。
测试前,将实施例1提供的试剂盒和样本恢复至室温。
1.检测前溶液准备:
流动相A的配制:将流动相添加剂A全部转移至1000 mL试剂瓶中然后加入1000mL去离子水,超声5 分钟后,备用。
流动相B的准备:取试剂盒配套提供的流动相B试剂,恢复至室温后,备用。
2.检测样本制备:
2.1精密吸取50 μL校准品、质控品、血清样本或者尿液样本,置于合适的容器中(1.5 mLEP管或450 μL 96孔板)中,分别精密加入100 μL内标沉淀剂,涡旋混匀3 min后,于4℃,2000~4000 g 离心10 min,转移100 μL上清液至另一个96孔板中,进行LC-MS/MS检测。流程图可参照附图1。
内标工作液的配制:精密吸取适量内标储备液,用90%乙腈水稀释,配制成合适浓度的内标工作溶液。
3.检测条件:
3.1 色谱条件如表5,需要说明的是在其他实施例中,也可以采用表6所示的色谱条件。
表5 Waters Acquity UPLC液相
表6 岛津Jasper HPLC液相
备注:表5和表6中A为流动相A,B为流动相B。
3.2 质谱条件
本实施例中,采用的Waters Xevo TQD质谱仪,所述质谱条件为:扫描模式为MRM;离子化模式为:正离子模式;离子源为ESI;去溶剂温度为600℃;去溶剂流速为:500 L/Hz;毛细管电压:3.5kV。
MRM模式的参数设置具体参照表7。
表7 参数设置
备注:IS为内标,internal standard。
需要说明的是,在其他实施例中,也可以采用其他质谱仪,如AB Sciex 质谱仪,对应的质谱条件为:扫描模式:MRM;离子化模式:正离子模式;离子源温度:550℃;气帘气:30;雾化气:55;气化气:55;毛细管电压为:5.5kV。
MRM模式的参数设置具体参照表8。
表8 MRM参数
化合物名称 | Q1 | Q3 | Dwell Time(ms) | DP (V) | CE(eV) | 母离子加合方式 |
Gly | 76.1 | 30.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Gly-IS | 79.1 | 32.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ala | 90.1 | 44.1 | 10 | 50 | 10 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ala-IS | 93.1 | 47.1 | 10 | 50 | 16 | [M+H] <sup>+</sup> |
Pro | 116.1 | 70.1 | 10 | 50 | 60 | [M+H] <sup>+</sup> |
Pro-IS | 119.1 | 70.1 | 10 | 50 | 20 | [M+H] <sup>+</sup> |
Leu | 132.1 | 86.1 | 10 | 50 | 30 | [M+H] <sup>+</sup> |
Leu-IS | 135.1 | 89.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ile | 132.11 | 86.1 | 10 | 50 | 40 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ile-IS | 142.1 | 96.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Asp | 134.1 | 88.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Asp-IS | 137.1 | 91.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Lys | 147.1 | 84.1 | 10 | 50 | 30 | [M+H] <sup>+</sup> |
Lys-IS | 151.1 | 88.1 | 10 | 50 | 20 | [M+H] <sup>+</sup> |
Glu | 148.1 | 84.1 | 10 | 50 | 40 | [M+H] <sup>+</sup> |
Glu-IS | 151.1 | 87.1 | 10 | 50 | 22 | [M+H] <sup>+</sup> |
Met | 150.1 | 104.1 | 10 | 50 | 20 | [M+H] <sup>+</sup> |
Met-IS | 153.1 | 107.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
His | 156.1 | 110.1 | 10 | 50 | 40 | [M+H] <sup>+</sup> |
His-IS | 159.1 | 113.1 | 10 | 50 | 23 | [M+H] <sup>+</sup> |
Phe | 166.1 | 120.1 | 10 | 50 | 45 | [M+H] <sup>+</sup> |
Phe-IS | 172.1 | 126.1 | 10 | 50 | 18 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ser | 106.1 | 60.1 | 10 | 50 | 12 | [M+H] <sup>+</sup> |
Ser-IS | 109.1 | 62.1 | 10 | 50 | 17 | [M+H] <sup>+</sup> |
Val | 118.1 | 72.1 | 10 | 50 | 35 | [M+H] <sup>+</sup> |
Val-IS | 126.1 | 80.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Thr | 120.1 | 74.1 | 10 | 50 | 10 | [M+H] <sup>+</sup> |
Thr-IS | 123.1 | 77.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Orn | 133.1 | 70.1 | 10 | 50 | 40 | [M+H] <sup>+</sup> |
Orn-IS | 139.1 | 76.1 | 10 | 50 | 20 | [M+H] <sup>+</sup> |
Asn | 133.1 | 74.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Asn-IS | 137.1 | 76.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Gln | 147.11 | 84.1 | 10 | 50 | 48 | [M+H] <sup>+</sup> |
Gln-IS | 154.1 | 89.1 | 10 | 50 | 23 | [M+H] <sup>+</sup> |
Arg | 175.1 | 116.1 | 10 | 50 | 15 | [M+H] <sup>+</sup> |
Arg-IS | 181.1 | 120.1 | 10 | 50 | 18 | [M+H] <sup>+</sup> |
Cit | 176.1 | 113.1 | 10 | 50 | 35 | [M+H] <sup>+</sup> |
Cit-IS | 182.1 | 119.1 | 10 | 50 | 22 | [M+H] <sup>+</sup> |
Tyr | 182.1 | 136.1 | 10 | 50 | 10 | [M+H] <sup>+</sup> |
Tyr-IS | 188.1 | 142.1 | 10 | 50 | 18 | [M+H] <sup>+</sup> |
Trp | 205.1 | 146.1 | 10 | 50 | 40 | [M+H] <sup>+</sup> |
Trp-IS | 213.1 | 151.1 | 10 | 50 | 23 | [M+H] <sup>+</sup> |
4. 数据分析和结果:
4.1 校准曲线绘制:以校准品的浓度为自变量xi,以对应浓度校准品和内标的峰面积比值为因变量yi,计算线性回归方程y = ax + b和相关系数r;
4.2 质控品数据分析:当校准曲线的r ≥ 0.990时,将低值和高值质控品的信号强度带入回归方程,获得质控品浓度;
4.3 血清或者尿液样本数据分析:当质控品的检测结果在预期范围内时,将血清或者尿液样本的信号强度带入回归方程,获得血清或者尿液样本中的目标物浓度。
5. 产品性能指标:
5.1剂量反应曲线线性
在0.1~10 μg/mL的浓度范围,肌氨酸、L-高瓜氨酸和γ-氨基丁酸的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。
在0.5~50 μg/mL的浓度范围,L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、同型半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-胱硫醚和β-丙氨酸的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。
在1~100 μg/mL的浓度范围,L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-缬氨酸的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。
在1.5~150 μg/mL的浓度范围,L-谷氨酰胺的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。在2~200 μg/mL的浓度范围, L-组氨酸和牛磺酸的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。
在15~1500 μg/mL的浓度范围,甘氨酸和肌酐的线性良好,相关系数r ≥ 0.990。
5.2 重复性
低值质控品的变异系数(CV)≤ 20%;高值质控品的变异系数(CV)≤ 15%。
5.3 均一性
低值质控品的变异系数(CV)≤ 20%;高值质控品和校准品的变异系数(CV)≤15%。
5.4 批间差
批间相对极差(R)≤ 15%。
5.5 准确度
准确度的相对偏差(B)≤±15%。
对比例1
现有的色谱方法:提供一种检测方法,检测方法与实施例2提供的检测方法大致相同,区别在于流动相的差异:流动相A:20~40mM甲酸铵水溶液;流动相B为含甲酸的乙腈溶液。
对比例2
提供一种检测试剂盒以及检测方法,检测方法与实施例2提供的检测方法相同,试剂盒与实施例1提供的检测试剂盒大致相同,区别仅在于:样本沉淀剂中的TCEP替换为二硫苏糖醇。
对比例3
提供一种检测试剂盒以及检测方法,检测方法与实施例2提供的检测方法相同,试剂盒与实施例1提供的检测试剂盒大致相同,区别仅在于:样本沉淀剂中,TCEP的浓度为20mg/mL。
对比例4
提供一种检测试剂盒以及检测方法,检测方法与实施例2提供的检测方法相同,试剂盒与实施例1提供的检测试剂盒大致相同,区别仅在于:样本沉淀剂中,TCEP的浓度为50mg/mL。
试验例1
获得人体血浆样本,采用实施例1提供的试剂盒,基于实施例2提供的检测进行29种氨基酸以及肌酐的检测,结果如图2所示。
由图2可知,各检测项目均有很好的色谱保留。
试验例2
验证本发明提供的检测方法对Leu与同分异构体的分离效果。
获得人体血浆样本分为2份,一份采用实施例1提供的试剂盒,基于实施例2提供的检测方法进行,另一份采用对比例1提供的检测方法进行检测。本发明的检测结果见图3,对比例1的检测结果见图4。
由结果可知,本发明提供的检测方法能够显著改善Leu与其同分异构体的分离效果。
试验例3
验证本发明提供的检测方法对Lys与同分异构体的分离效果。
获得人体血浆样本分为2份,一份采用实施例1提供的试剂盒,基于实施例2提供的检测方法进行检测,另一份采用对比例1提供的检测方法进行检测。本发明的检测结果见图5,对比例1的检测结果见图6。
由结果可知,本发明提供的检测方法能够显著改善Lys与其同分异构体的分离效果。
试验例4
验证本发明提供的检测方法对Glu与其他结构类似物的分离效果。
获得人体尿液样本样本分为2份,一份采用实施例1提供的试剂盒,基于实施例2提供的检测方法进行检测,另一份采用对比例1提供的检测方法进行检测。本发明的检测结果见图7,对比例1的检测结果见图8。
由结果可知,本发明提供的检测方法能够显著改善Glu与其同分异构体的分离效果。
本发明提供的检测方法的检测效果如下:
选择性实验:
分别处理空白基质(样本基质或模拟基质)样本、空白溶剂样本、内标空白样本(分析物水平为ULOQ样本水平)、分析物空白样本各3份,交替进样分析,每个样本重复分析2次。在本次方法学验证中,双空白样品中内源性物质对待测物和内标的干扰均为0%;空白样品中内标对待测物、ULOQ样品中待测物对内标的干扰均为0%,满足接受标准。
标准曲线和最低定量限:
每个分析批内的标准曲线均符合75%的标曲样品的%RE在理论值的±15%(LLOQ在其理论值的±20%)范围以内的接受标准,相关系数r均大于或等于0.99。LLOQ样本检测的精密度RSD%在20%以内。所有验证运行中报告的标准曲线均符合线性的接受标准。
基质效应实验:
混合样本的响应值(待分析物/内标)与临床样本和标准溶液响应均值的差异小于20%,说明无相对基质效应。满足接受标准。
准确性(检测CRMs、加标回收率实验):CRMs(CHROM SYSTEMS,0471和0472)检测值应该在靶值的±15%以内,低浓度样本在±20%以内。回收率结果表明,29种氨基酸及肌酐在低、高浓度水平下回收率部分氨基酸低浓度加标回收由于本底值影响导致不过,其他都符合接受标准。
精密度:在低、中、高浓度下,批内精密度%RSD均小于15%;批间精密度%RSD均小于15%。符合生物样品分析要求。
残留效应:
部分氨基酸残留效应样品中内标物峰面积均在LLOQ内标峰面积的5%以内,残留效应样品分析物峰面积均在LLOQ分析物峰面积的20%以内,符合生物样品分析要求。
稀释可靠性:
稀释因子结果表明稀释因子为2倍的质控样品的平均%RE均在15%以内,满足稀释因子的接受标准。
血清样本稳定性实验:
样品的稳定性结果表明29种氨基酸及肌酐在真实血清样品浓度下,室温放置6 h、2~8℃条件下放置4天后,其样本浓度的%RE均在±15.0%以内,满足稳定性的接受标准。说明29种氨基酸及肌酐在以上条件下是稳定的。
已采集并且添加稳定剂的尿液样本,室温(10~30℃) 储存不超过24 h;2℃~8℃条件下储存4天,-18℃±8℃条件下储存7天,其样本浓度的%RE均在±15.0%以内,满足稳定性的接受标准。说明29种氨基酸及肌酐在以上条件下是稳定的。
本发明提供的检测方法在1~200 ng/mL范围内,具有良好的精密度、准确度、选择性和特定条件下的稳定性,满足临床血清样本中多种氨基酸浓度测定的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,所述目标氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、胱硫醚、半胱氨酸、同型半胱氨酸、高瓜氨酸、肌氨酸和牛磺酸;
所述方法包括:将添加有内标的样本溶液与样本沉淀剂混合后形待测样本溶液用于液相色谱串联质谱检测;
所述样本沉淀剂为含还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的乙腈水,在所述待测样本溶液中,乙腈的体积终浓度为50%~70%,三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP的终浓度为0.1~5 μg/μL;
所述液相色谱的条件为:色谱柱为键合酰胺官能团的正相柱;柱温为30℃或40℃;流动相A:20~40mM甲酸铵水溶液;流动相B为含甲基叔丁基醚和甲酸的乙腈溶液,在所述流动相B中,甲基叔丁基醚的体积浓度为20%~30%,甲酸的体积浓度为0.05%~0.15%;梯度洗脱;
所述梯度洗脱的洗脱程序如(1)~(2)中任一项的表格所示:
(1):
(2):
。
2.根据权利要求1所述的用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,添加有内标的样本溶液与样本沉淀剂的混合时间为1~15 min。
3.根据权利要求1所述的用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,(1)项洗脱条件的适用机型包括Waters Acquity UPLC;(2)项洗脱条件适用机型包括岛津Jasper HPLC。
4.根据权利要求1所述的用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,所述液相色谱采用的色谱柱为:键合酰胺官能团的正相柱,粒径为1.7μm或2.5μm,内径为 2.1cm~3.0 cm,柱长为30 cm~100cm。
5.根据权利要求1~4任一项所述的用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,所述质谱的条件为:扫描模式为MRM;离子化模式为:正离子模式;离子源为ESI;去溶剂温度为550~620℃;去溶剂流速为:480~520 L/Hz;毛细管电压:3.3~5.5kV。
6.根据权利要求1~4任一项所述的用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法,其特征在于,所述样本选自血清样本、血浆样本以及尿液样本中的任意一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110700181.9A CN113419007B (zh) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110700181.9A CN113419007B (zh) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113419007A CN113419007A (zh) | 2021-09-21 |
CN113419007B true CN113419007B (zh) | 2022-11-29 |
Family
ID=77717518
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110700181.9A Active CN113419007B (zh) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113419007B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114509516B (zh) * | 2022-01-29 | 2023-11-17 | 大连博源医学科技有限公司 | 同时检测血液中芳香-支链氨基酸浓度的方法及应用 |
CN115144517B (zh) * | 2022-05-31 | 2023-07-21 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6066467A (en) * | 1997-07-24 | 2000-05-23 | Anticancer, Inc. | High specificity homocysteine assays for biological samples |
US20100285593A1 (en) * | 2007-11-26 | 2010-11-11 | Waters Technologies Corporation | Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample |
US20160195510A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Castle Medical, LLC | Methods for determination of total homocysteine |
CN109239212A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-18 | 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 | 一种测定小分子生物标志物的方法 |
-
2021
- 2021-06-23 CN CN202110700181.9A patent/CN113419007B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113419007A (zh) | 2021-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7399214B2 (ja) | 液体クロマトグラフィー質量分析による体液中のアミノ酸分析 | |
EP1750126B1 (en) | Method and apparatus for analyzing aminofunctional compound | |
Shimbo et al. | Precolumn derivatization reagents for high‐speed analysis of amines and amino acids in biological fluid using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry | |
Kaspar et al. | Automated GC–MS analysis of free amino acids in biological fluids | |
Piraud et al. | ESI‐MS/MS analysis of underivatised amino acids: a new tool for the diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism. Fragmentation study of 79 molecules of biological interest in positive and negative ionisation mode | |
US8945933B2 (en) | Liquid chromatography-mass spectrometry methods for multiplexed detection and quantitation of free amino acids | |
Pucciarini et al. | Development and validation of a chiral UHPLC-MS method for the analysis of cysteine enantiomers in biological samples | |
CN113419007B (zh) | 一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒 | |
CN112730723B (zh) | 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法 | |
US7700364B2 (en) | Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromatography-mass spectrometry | |
CN114236025B (zh) | 不使用离子对试剂和非衍生化测定43种氨基酸的方法 | |
JP2018163155A (ja) | アミノ酸の分析方法 | |
Choi et al. | Development of a mixed-mode chromatography with tandem mass spectrometry method for the quantitative analysis of 23 underivatized amino acids in human serum | |
Shen et al. | Absolute quantitative analysis of endogenous neurotransmitters and amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with multidimensional adsorption and collision energy defect | |
Sánchez-López et al. | Design of strategies to study the metabolic profile of highly polar compounds in plasma by reversed-phase liquid chromatography–high resolution mass spectrometry | |
JP5276993B2 (ja) | 低分子量ペプチドの高感度定量方法 | |
Li et al. | Simultaneous determination of 24 free amino acids in MGC803 cells by hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry | |
CN113588802B (zh) | 用于非侵入性检测肝毒性吡咯里西啶类生物碱暴露的生物标志物和方法 | |
CN114019034A (zh) | 一种游离氨基酸快速非衍生的液相色谱串联质谱检测方法 | |
Ferreira et al. | Use of microextraction by packed sorbents and gas chromatography-mass spectrometry for the determination of polyamines and related compounds in urine | |
Wang et al. | Sensitive analysis of N-blocked amino acids using high-performance liquid chromatography with paired ion electrospray ionization mass spectrometry | |
CN110806458A (zh) | 同时检测血液中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸含量的方法 | |
CN117030878A (zh) | 一种稳定的游离氨基酸的未衍生化检测方法及其应用 | |
CN113945675B (zh) | 一种基于DIPP衍生化-HPLC-Chip/QQQ-MS检测痕量胺的方法及其应用 | |
Salazar et al. | Combination of an AccQ• Tag-ultra-performance liquid chromatographic method with tandem mass spectrometry for the analysis of amino acids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |