CN109239212A - 一种测定小分子生物标志物的方法 - Google Patents

一种测定小分子生物标志物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种测定小分子生物标志物的方法。具体而言，该方法包括：1)样品预处理；2)色谱分离；3)质谱检测；和4)计算。本发明中的方法具有样品前处理步骤简便、分析速度快、专属性好、精密度及准确度高等优点，不仅适用于血清样本，而且适用于干血片样本，便于采样，易于运输和保存，采血者顺应性好。另外，在样品前处理步骤中，还原剂的引入使得样品中的结合态同型半胱氨酸及同型半胱氨酸二聚体能够解离为游离态单体，更准确地测定样品中同型半胱氨酸含量。

Description

一种测定小分子生物标志物的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种测定小分子生物标志物的方法，尤其涉及一种同时测定多种小分子生物标志物的方法。
背景技术
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病严重威胁人类(特别是50岁以上中老年人)健康，具有患病率高、致残率高和死亡率高等特点。即使应用目前最先进、最完善的治疗手段，仍有约50％以上的意外幸存者无法实现生活自理。全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。
研究表明，心脑血管疾病的致病机制可能在于血液的病变，其对人体的损害是隐秘的、逐渐的和全身性的，且早期很难发现明显的临床症状。寻找合理、有效的生物标志物(biomarker)来诊断、分级和指导心脑血管疾病的治疗一直是临床检验诊断学科一个重点关注的内容。
目前已有一系列较为成熟、临床普遍开展的生物标志物检测，为心脑血管疾病的诊断与治疗提供了重要的参考依据。研究较为成熟的心脑血管标志物主要包括血管本身和凝血系统的标志物(如血小板和纤维蛋白溶解)、脂代谢标志物和炎症标志物、粥样斑块钙化和非钙化脱落预测性标志物；其次是脏器损伤标志物，如心肌损伤标志物和脑损伤标志物。
心脑血管疾病的常见危险因素指标有血清脂质(具体包括总胆固醇、甘油三酯和载脂蛋白等)以及C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。Hcy是蛋白质代谢过程中的降解产物。在正常情况下，血液中的Hcy在酶和维生素B6、叶酸的辅助下参与机体转硫基、转甲基过程，并被降解为半胱氨酸，转换为部分蛋白质。当机体新陈代谢出现障碍时，Hcy会因无法降解而在体内聚集。高浓度的Hcy会对血管内壁造成损害，使血管内膜增厚、粗糙，形成斑块，进而使管腔狭窄甚至阻塞，动脉供血不全，导致动脉粥样硬化和冠心病的发生。大量研究表明，高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的独立危险因素。血浆中约75％的Hcy与白蛋白结合，作为结合态的Hcy；部分以通过二硫键结合的Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在；只有1％～2％以还原态形式存在，且极易被氧化。因此，简单的血清样品测定不能准确测得人体的Hcy水平。
肠道微生物可将人体过量摄入的胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)、左旋肉碱(L-Carnitine)作为碳能量来源，其特有的三甲胺裂解酶可使C-N键断裂，三甲胺(Trimethylamine，TMA)即作为代谢废物释放，通过门脉循环进入肝脏，TMA进一步被肝脏分泌的黄素单氧化酶(主要是FMO3)氧化生成氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide，TMAO)。TMAO可用于胆固醇代谢、胰岛素抵抗、促进血小板高聚集、增加血栓形成、促进血管炎症反应及直接导致动脉斑块形成等方面，可能导致动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压病、卒中等不良心血管事件发生。
肌酐(Creatinine)是肌肉在人体内代谢的产物，其水平与肾功能相关，长期高血压或血性心功能不全会引起肾损伤，进而使肌酐水平升高。
缬氨酸(Valine，Val)、亮氨酸(Leucine，Leu)和异亮氨酸(Isoleucine，Ile)统称为支链氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA)，BCAA水平升高可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)及其下游的核糖体S6激酶1(S6K1)，通过诱导胰岛素受体底物-1(IRS-1)丝氨酸磷酸化，阻断胰岛素信号通路的传导，从而引起胰岛素抵抗。高水平的BCAA也可能会转移至骨骼肌中分解，干扰脂质代谢产物的积累，引起骨骼肌胰岛素抵抗。而胰岛素抵抗是心脑血管疾病独立、重要的危险因素之一，其可通过导致糖代谢异常、脂代谢异常、NO生成减少、诱发高血压、降低纤溶活性等，从而促进心脑血管疾病的发生、发展。此外，临床研究发现苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)和色氨酸(Tryptophan，Trp)的代谢异常也与心脑血管疾病有着密切关联。
目前，针对心脑血管疾病生物标志物的检测主要集中在生物大分子，如静脉血栓栓塞的检测指标-D-二聚体、凝血酶原片段；以及心肌损伤的生物标志物肌钙蛋白(Tn)、肌酸激酶(CK)及其同工酶、乳酸脱氢酶(LDH)、心钠素(ANP)等，而对于代谢物小分子的生物标志物检测方法还不够成熟。现有的针对生物大分子的检测方法大多采用生化法、免疫法等，方法的特异性和准确度较低，无法满足较高的要求。另外，现有的临床心脑血管疾病血液标志物(同型半胱氨酸/胆固醇/脂质等)测定方法对采样的要求较高，需要专业人员及特定场地才能进行采样。因此，亟需一种能够适用于代谢物小分子的、具有较高的特异性和准确度的、对于采样要求较低的生物标志物检测方法。
发明内容
发明要解决的问题
针对上述技术问题，本发明提供了一种同时测定生物样品中的多种小分子生物标志物(包括胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等11种)的方法。该方法能够适用于小分子生物标志物的检测，具有较高的特异性和准确性，且采样操作简单易行。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种测定小分子生物标志物的方法。所述方法包括下列步骤：
1)样品预处理：取包含小分子生物标志物的生物样品，加入内标、提取溶剂以及还原剂，混匀，去除蛋白质，得到待测样品；
2)色谱：对步骤1)中得到的待测样品进行液相色谱分离，色谱条件如下：色谱柱：HILIC色谱柱；流动相：二元流动相，流动相A为水，水中含有5～15mmol/L的甲酸铵或乙酸铵，流动相B为乙腈；流速：0.2～0.5mL/min；进样量：5～10μL；柱温：30～40℃；
3)质谱：对步骤2)中分离得到的组分进行质谱检测，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200～700℃；离子源电压：4500～5500V；碰撞气压：4～6psi；气帘气压：25～35psi；雾化气压：45～55psi；辅助气压：45～55psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式；
4)计算：采用标准曲线法，分别将存在对应关系的小分子生物标志物和内标的色谱峰面积的比值代入相应的标准曲线方程，再分别将无对应内标的小分子生物标志物的色谱峰面积代入相应的标准曲线方程，计算得出小分子生物标志物在生物样品中的浓度。
进一步地，在上述方法中，步骤1)中所述小分子生物标志物有11种，分别如下：胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；所述内标有7种，分别如下：胆碱-d9、甜菜碱-d9、氧化三甲胺-d9、肌酐-d3、左旋肉碱-d3、缬氨酸-1-13C和苯丙氨酸-1-13C；所述还原剂为β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)，优选二硫苏糖醇。
进一步地，在上述方法中，步骤1)中所述生物样品为干血片或血清，优选人源干血片或血清。
进一步地，在上述方法中，步骤1)中所述提取溶剂为甲酸-甲醇、乙酸-甲醇、甲酸-乙腈或乙酸-乙腈。
进一步地，在上述方法中，步骤1)中所述去除蛋白质通过离心机或蛋白过滤板来完成，优选通过过滤板来完成。
优选地，在上述方法中，步骤2)中所述HILIC色谱柱为Waters ACQUITY BEHHILIC色谱柱。
优选地，在上述方法中，步骤2)中所述液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式，洗脱程序如下：以体积百分比计，从0至1分钟，流动相A为20％，流动相B为80％；从1至2分钟，流动相A由20％变化至30％，流动相B由80％变化至70％；从2至2.5分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；从2.5至3分钟，流动相A由30％变化至20％，流动相B由70％变化至80％；从3至5分钟，流动相A为20％，流动相B为80％。
优选地，在上述方法中，步骤3)中所述多重反应监测涉及的小分子生物标志物和内标以及各自对应的监测离子对、去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)如下：胆碱，m/z 103.8→60.0，101V，25eV；甜菜碱，m/z 118.1→41.9，56V，75eV；氧化三甲胺，m/z 76.0→58.0，41V，27eV；肌酐，m/z 114.0→86.1，46V，17eV；左旋肉碱，m/z 162.0→59.9，61V，29eV；同型半胱氨酸，m/z 136.0→90.0，46V，15eV；亮氨酸/异亮氨酸，m/z 132.2→85.9，21V，15eV；缬氨酸，m/z 118.2→72.0，26V，15eV；苯丙氨酸，m/z 166.1→119.9，46V，19eV；酪氨酸，m/z182.1→165.2，46V，13eV；色氨酸，m/z 205.1→188.1，31V，15eV；胆碱-d9，m/z 113.0→69.0，26V，25eV；甜菜碱-d9，m/z 127.1→68.0，66V，27eV；氧化三甲胺-d9，m/z 85.0→66.0，41V，29eV；肌酐-d3，m/z 117.0→88.9，61V，11eV；左旋肉碱-d3，m/z 165.1→103.1，56V，23eV；缬氨酸-1-13C，m/z 119.0→72.0，41V，15eV；苯丙氨酸-1-13C，m/z 167.1→120.1，41V，19eV。
优选地，在上述方法中，步骤4)中所述对应关系如下：胆碱以胆碱-d9作为内标；甜菜碱以甜菜碱-d9为内标；氧化三甲胺以氧化三甲胺-d9为内标；肌酐以肌酐-d3为内标；左旋肉碱以左旋肉碱-d3为内标；缬氨酸以缬氨酸-1-13C为内标；苯丙氨酸以苯丙氨酸-1-13C为内标。
发明的效果
本发明提供了一种同时测定作为心脑血管疾病检测指标的11种小分子生物标志物的液质联用方法。与现有技术相比，该方法具有适用于小分子生物标志物、样品前处理步骤简便、分析速度快(5分钟内完成测定)、专属性好(采用MRM扫描模式，消除了内源性物质的干扰)、精密度及准确度高等优点。本方法不仅适用于血清样本，而且适用于干血片样本，便于采样，易于运输和保存，采血者顺应性好。另外，在样品前处理步骤中，作为还原剂的二硫苏糖醇(DTT)的引入，使得样品中的结合态同型半胱氨酸(Hcy)及同型半胱氨酸二聚体能够有效地解离为游离态单体，以确保准确测定关键性指标成分Hcy。
附图说明
图1为未加还原剂DTT的待测样品中Hcy的XIC谱图。
图2为加入还原剂DTT的待测样品中Hcy的XIC谱图。
图3为11种小分子生物标志物及7种内标的XIC谱图。
图4为利用本发明的方法测定小分子生物标志物的96孔板排样图。
具体实施方式
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种测定小分子生物标志物的方法。该方法包括下列步骤：
1)样品预处理：取包含小分子生物标志物的生物样品，加入内标、提取溶剂以及还原剂，混匀，去除蛋白质，得到待测样品；
2)色谱：对步骤1)中得到的待测样品进行液相色谱分离，色谱条件如下：色谱柱：HILIC色谱柱；流动相：二元流动相，流动相A为水，水中含有5～15mmol/L的甲酸铵或乙酸铵，流动相B为乙腈；流速：0.2～0.5mL/min；进样量：5～10μL；柱温：30～40℃；
3)质谱：对步骤2)中分离得到的组分进行质谱监测，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200～700℃；离子源电压：4500～5500V；碰撞气压：4～6psi；气帘气压：25～35psi；雾化气压：45～55psi；辅助气压：45～55psi；检测方式，正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式；
4)计算：采用标准曲线法，分别将存在对应关系的小分子生物标志物和内标的色谱峰面积的比值代入相应的标准曲线方程，再分别将无对应内标的小分子生物标志物的色谱峰面积代入相应的标准曲线方程，计算得出小分子生物标志物在生物样品中的浓度。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的小分子生物标志物为胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。需要说明的是，由于亮氨酸和异亮氨酸属于同分异构体，且结构较为近似，因此二者在色谱和质谱行为上具有高度一致性，因此本发明的检测方法将二者合并为一种小分子生物标记物，便于后续数据统计及含量计算。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“胆碱”是指2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“甜菜碱”是指2-(N,N,N-三甲基铵基)乙酸内盐，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“左旋肉碱”是指(R)-3-羟基-4-(N,N,N-三甲基铵基)丁酸内盐，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“氧化三甲胺”是指三甲胺氮氧化物(或三甲胺N-氧化物)，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“肌酐”是指2-亚氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“同型半胱氨酸”是指2-氨基-4-巯基丁酸，其结构如下所示(天然存在的同型半胱氨酸的2位碳原子通常为S构型)。同型半胱氨酸是半胱氨酸的异种，与后者相比，前者在巯基(-SH)之前包含了一个额外的亚甲基(-CH2-)片段，因此又称“高半胱氨酸”。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“亮氨酸”是指2-氨基-4-甲基戊酸，其结构如下所示(天然存在的亮氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“异亮氨酸”是指2-氨基-3-甲基戊酸，其结构如下所示(天然存在的异亮氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“缬氨酸”是指2-氨基-3-甲基丁酸，其结构如下所示(天然存在的缬氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“苯丙氨酸”是指2-氨基-3-苯基丙酸，其结构如下所示(天然存在的苯丙氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“酪氨酸”是指2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸，其结构如下所示(天然存在的酪氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“色氨酸”是指2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸，其结构如下所示(天然存在的色氨酸的2位碳原子通常为S构型)。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的内标为胆碱-d9(Choline-d9)、甜菜碱-d9(Betaine-d9)、氧化三甲胺-d9(TMAO-d9)、肌酐-d3(Creatinine-d3)、左旋肉碱-d3(L-Carnitine-d3)、缬氨酸-1-13C(Val-1-13C)和苯丙氨酸-1-13C(Phe-1-13C)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“胆碱-d9”是指2-羟基-N,N,N-三(三氘代甲基)乙铵，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“甜菜碱-d9”是指2-[N,N,N-三(三氘代甲基)铵基]乙酸内盐，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“左旋肉碱-d3”是指(R)-3-羟基-4-[N,N-二甲基-N-(三氘代甲基)铵基]丁酸内盐，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“氧化三甲胺-d9”是指全氘代三甲胺氮氧化物(或全氘代三甲胺N-氧化物)，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“肌酐-d3”是指2-亚氨基-1-三氘代甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“缬氨酸-1-13C”是指缬氨酸在1位碳上的13C同位素标记物(亦可记作Val-1-13C)，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“苯丙氨酸-1-13C”是指苯丙氨酸在1位碳上的13C同位素标记物(亦可记作Phe-1-13C)，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“还原剂”是用于还原分子间或分子内(例如半胱氨酸或其衍生物)二硫键的物质。血浆中约75％的Hcy与白蛋白结合，作为结合态的Hcy；部分以通过二硫键结合的Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在；只有1％～2％以还原态形式存在，故无法直接测定血浆中Hcy含量。例如，图1显示了没有加入还原剂的样品中Hcy的XIC谱图。由于缺乏还原剂，Hcy大部分以结合态形式存在，游离态形式含量较低，因而无法准确测定。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的还原剂为巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、二硫苏糖醇(dithiothreitol)或三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine)。
在一些优选的实施方案中，上述方法中的还原剂为二硫苏糖醇。结构中包含末端巯基的分子(例如蛋白质中的半胱氨酸及其结构类似物)在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在氧气存在的条件下。而在加入DTT的条件下，就可以降低这种二聚化，通过DTT自身形成包含二硫键的六元环系来避免目标分子形成二聚体。例如，图2显示了加入还原剂(DTT)的样品中Hcy的XIC谱图。与图1相比，由于还原剂能够发挥抗氧化作用，有效地抑制了Hcy结构中的巯基发生分子间或分子内偶联，使得能够测得血清中的Hcy，保证了检测方法的可行性和准确性。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“生物样品”是指采集自生物体、用于特定实验目的的样品，包括(但不限于)植物样品，例如根、茎、叶、花、果实、种子等；动物样品，例如人或其他动物的体液(如尿液、血液、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等)、内脏(如心、肺、肝、胆、脾、胃、肾、胰腺、膀胱、肠等)、毛发、肌肉、骨骼、筋膜、软组织等；以及各种微生物，例如真菌、细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体等。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“干血片”是指将全血收集在专用采血卡纸上(如Whatman903)得到的干燥血斑(dried blood spot，DBS)。比传统方法相比，利用干血片进行血样采集(又称“干血纸片法”)具有血量需求较少、采集存储运输方便等优势。随着串联质谱等技术的发展，干血纸片法在疾病诊断及筛查中的应用价值日渐突显。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的生物样品为干血片。在一些优选的实施方案中，上述方法中的生物样品为人源干血片。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“血清”是指通过自然凝固的方式从血浆中除去纤维蛋白原后分离得到的淡黄色透明液体，具有维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用。
在本发明的另一些实施方案中，上述方法中的生物样品为血清。在另一些优选的实施方案中，上述方法中的生物样品为人源血清。
对于包含蛋白质等大分子化合物的生物样品，本发明采用有机溶剂沉淀法来沉淀蛋白，最后通过离心或过滤的方式加以去除。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的提取溶剂选自下列溶剂体系中的任意一种：甲酸-甲醇、乙酸-甲醇、甲酸-乙腈和乙酸-乙腈。其中，甲酸、乙酸等小分子酸类主要用于调节内标的溶解性，甲醇、乙腈等小分子醇类或腈类主要用于沉淀生物样品中的蛋白质等大分子化合物。在一些优选的实施方案中，上述方法中的混合溶剂为甲酸-甲醇。
在一些更优选的实施方案中，上述方法中的提取溶剂为甲酸-甲醇，其中甲酸的体积百分比为0.1％(即0.1％甲酸-甲醇溶液)。
在本发明的一些实施方案中，上述方法通过离心的方式来去除生物样品中的蛋白质等大分子化合物。在一些优选的实施方案中，上述方法通过离心机来去除蛋白质。通过离心机的离心作用，能够有效沉降样品中的变性蛋白质，而使小分子待测物保留在上清液中。
在本发明的另一些实施方案中，上述方法通过过滤的方式来去除生物样品中的蛋白质等大分子化合物。在另一些优选的实施方案中，上述方法通过蛋白过滤板(例如96孔过滤板)来去除蛋白质。经过蛋白过滤板的过滤作用，能够有效截留样品中的变性蛋白质，而使小分子待测物通过。
超高效液相色谱(ultrahigh performance liquid chromatography，UPLC)借助于高效液相色谱(HPLC)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“HILIC色谱柱”是指一类基于亲水相互作用色谱法(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)的色谱柱。HILIC能够用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质的保留行为，通过采用强极性固定相，并结合由高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现该目的。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的HILIC色谱柱为Waters ACQUITYBEH HILIC色谱柱。在一些优选的实施方案中，上述方法中的HILIC色谱柱为WatersACQUITY BEH HILIC色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)。
为了配合HILIC色谱柱的使用，上述方法中的流动相为水/乙腈二元流动相，并且水中含有用于调节流动相pH值的pH调节剂，例如甲酸铵或乙酸铵。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的水(作为流动相A)中含有5～15mmol/L的甲酸铵。在一些优选的实施方案中，上述方法中的水(作为流动相A)中含有10mmol/L的甲酸铵。
在本发明的另一些实施方案中，上述方法中的水(作为流动相A)中含有5～15mmol/L的乙酸铵。在一些优选的实施方案中，上述方法中的水(作为流动相A)中含有10mmol/L的乙酸铵。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“二元梯度洗脱”(gradient elution，又称梯度淋洗或程序洗脱)是指在同一分析周期中，按照一定程度来不断改变两种流动相的配比，从而使复杂样品中的各个组分能够以各自适宜的容量因子(k)而达到良好的分离目的的洗脱方式。
在一些优选的实施方案中，上述方法中的液相色谱分离采用具有如表1所示的洗脱程序的二元梯度洗脱方式：
表1.二元梯度洗脱的洗脱程序
上述洗脱程序中的百分数均以体积百分比计算。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的流动相的流速为0.2～0.5mL/min。在一些优选的实施方案中，上述方法中的流动相的流速为0.4mL/min。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的进样量为5～10μL。在一些优选的实施方案中，上述方法中的进样量为10μL。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的色谱柱的柱温为30～40℃。在一些优选的实施方案中，上述方法中的色谱柱的柱温为30℃。
经过色谱法分离过程之后，被分离的各种组分将进入下一环节-质谱检测。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的离子源为电喷雾离子源。该类型离子源可以支持正离子及负离子两种检测模式。前者大多适用于碱性样品(尤其是含有仲氨基或叔氨基的样品)以及容易结合质子的部分酸性样品，后者大多适用于酸性样品(尤其是含有氯、溴或多个羟基的样品)以及容易失去质子的部分碱性样品。由于本发明的小分子生物标志物大多含有仲氨基或叔氨基，或者更容易结合质子，因此上述方法中的检测方式采用正离子检测。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的离子源的温度为200～700℃。可以理解的是，离子源的温度将随流动相中的水相比例而变化，水相比例越高，离子源需要的温度也就越高；相反，水相比例越低，离子源需要的温度也就越低。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的离子源的电压为4500～5500V。可以理解的是，离子源的电压过高，将影响检测稳定性，而电压过低，又将影响信号响应。在一些优选的实施方案中，上述方法中的离子源的温度为500℃，电压为5000V。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的碰撞气压为4～6psi，气帘气压为25～35psi，雾化气压为45～55psi，辅助气压为45～55psi。在一些优选的实施方案中，上述方法中的碰撞气压为6psi，气帘气压为30psi，雾化气压为50psi，辅助气压为50psi。在本发明的一些实施方案中，上述方法中使用的碰撞气、气帘气、雾化气和辅助气适用氮气及其他惰性气体。在一些优选的实施方案中，上述方法中使用的碰撞气、气帘气、雾化气和辅助气均为氮气。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“多重反应监测”(multiple reactionmonitoring，MRM)是指一种基于已知信息或假定信息来设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，同时去除大量不符合规则的离子信号的干扰，从而得到所需质谱信息的数据监测及获取方式。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的多重反应监测涉及的小分子生物标志物和内标以及各自对应的监测离子对、去簇电压和碰撞能量如表2所示。
表2.小分子生物标志物及对应的MRM参数情况
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的小分子生物标志物和内标的对应关系如表3所示。
表3.小分子生物标志物与内标的对应关系
以下将结合具体实施例来进一步说明本发明中的技术方案。除非特殊说明，下列实施例中所使用的仪器、试剂及材料均可通过常规商业手段获得。
实施例：生物样品中小分子生物标志物的测定。
1、材料和仪器：
1.1材料：
小分子生物标志物标准品：氢氧化胆碱(作为胆碱供体)，无色液体，46wt％水溶液，购自Sigma公司；甜菜碱，白色粉末，纯度≥99％，购自Aladdin公司；氧化三甲胺，白色粉末，纯度为98％，购自Aladdin公司；肌酐，白色粉末，纯度≥99％，购自TCI公司；左旋肉碱，白色粉末，纯度为99％，购自Aladdin公司；DL-同型半胱氨酸，白色粉末，购自Sigma公司；L-异亮氨酸，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigma公司；L-亮氨酸，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigma公司；L-缬氨酸，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigma公司；L-苯丙氨酸，白色粉末，购自源叶生物公司；L-酪氨酸，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigma公司；L-色氨酸，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigma公司；
内标：胆碱-d9氯化物(作为胆碱-d9供体)，白色粉末，购自CIL公司；甜菜碱-d9盐酸盐(作为甜菜碱-d9供体)，白色粉末，购自CDN公司；氧化三甲胺-d9，白色粉末，购自TRC公司；肌酐-d3，白色粉末，购自CDN公司；左旋肉碱-d3，白色粉末，购自CDN公司；L-缬氨酸-1-13C，白色粉末，纯度为99％，购自CIL公司；L-苯丙氨酸-1-13C，白色粉末，纯度为99％，购自CIL公司；
质控品：NIST SRM 1950血清(简称NIST)，-80℃储存，购自NIST；混合人血清(简称HPS)，-20℃储存，购自Lee BioSolutions公司；
其他：重水，氘原子浓度≥99.9％，购自Sigma-Aldrich公司；超纯水，自制；甲酸，色谱纯，购自Fisher公司；乙酸，色谱纯，购自Fisher公司；甲醇，色谱纯，购自Fisher公司；乙腈，色谱纯，购自Merke公司；甲酸铵，纯度≥99％，购自Sigma-Aldrich公司；乙酸铵，纯度≥99％，购自Sigma-Aldrich公司；DTT，纯度≥99％，购自Sigma-Aldrich公司。
1.2仪器：
E2695型超高效液相色谱仪(UPLC)，购自Waters公司；API 4000型三重四级杆质谱仪，购自AB Sciex公司；MS105DU型分析天平，购自Mettler-Toledo公司；H2O-MA-UV-Tmini型纯水仪，购自Sartoius公司；MB100-4A型恒温振荡仪，购自Thermo公司；GM-0.33A型隔膜真空泵，购自津腾公司；10/20/200/1000μL/5mL移液枪，购自Eppendorf公司。
2、检测条件：
2.1色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITYBEH HILIC色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：流动相A：水(含有10mmol/L的甲酸铵)/流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；流动相组成如表4所示(百分数均以体积百分比计算)。
表4.梯度洗脱方式中的流动相组成
2.2质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子源电压：5000V；离子源温度：500℃；碰撞气(N2)：6psi；气帘气(N2)：30psi；雾化气(N2)：50psi；辅助气(N2)：50psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测(MRM)模式；质谱参数及对应的保留时间如表5所示。
表5.MRM模式下的质谱参数及对应的保留时间
3、实验过程：
3.1溶液配制：
3.1.1标准曲线溶液配制：
分别精密称取12种待测物标准品适量，用纯水溶解后配制成浓度为2mmol/L的待测物标准品储备液(其中亮氨酸/异亮氨酸为二者的等摩尔混合物)。分别取上述待测物标准品储备液适量，混合后用纯水稀释成浓度分别如表6所示的7个浓度梯度的标准曲线溶液。
表6.标准曲线溶液的浓度
3.1.2内标溶液配制：
分别精密称取7种同位素内标标准品适量，用纯水或氘代水溶解后配制成浓度为2mmol/L的内标标准品储备液。分别取上述内标标准品储备液适量，混合后用纯水或氘代水稀释至各个内标化合物响应与其对应标准品的标准曲线中点浓度响应接近。
3.2标准曲线：
11种小分子生物标志物的线性情况如表7所示。
表7.小分子生物标志物的线性方程及定量范围
3.3回收率：
配制低(LQC)、中(MQC)、高(HQC)浓度混合标准品溶液，其中：LQC浓度为标曲定量下限，MQC浓度为标准曲线中浓度，HQC浓度为标曲定量上限的75％。平行取12份样品，加入96孔板中，每3份分别加入空白溶液和低、中、高浓度混合标准溶液，按照前处理步骤处理，回收率结果如表8所示。由表8中的结果可知，11种小分子生物标志物相对于3种浓度质控的回收率均大于80％。
表8.测定方法的回收率结果
3.4精密度：
取回收率项下低、中、高浓度加标溶液进行测定，精密度结果如表9所示。由表9中的结果可知，11种小分子生物标志物相对于3种浓度质控的RSD均小于10％，且中等浓度条件下的RSD小于5％。
表9.测定方法的精密度结果
3.5干血片样品的测定：
(1)如图4所示，将标准曲线溶液(10μL)、干血片样品(直径6mm，n＝12)以及可选的质控溶液(包括3种混标质控以及作为外部质控的NIST和HPS，其中混标质控和外部质控NIST可用于评价准确性，外部质控HPS可用于评价重复性)(10μL)等加入到96孔过滤板中；
(2)向各孔中加入含有内标的0.1％甲酸-甲醇溶液(300μL)，其中：内标浓度根据实际情况确定，以其响应值与其所对应的生物标志物在标准曲线中间浓度点的响应值接近为准；
(3)再向各孔中加入500μmol/L的DTT水溶液(20μL)；
(4)在600rpm转速条件下振摇30min，将提取溶液在0.02MPa压力条件下过滤至96孔收集板，以去除蛋白质等大分子，得到待测样品；
(5)通过液质联用方法进行测定，并分析检测结果。
干血片样品中11种小分子生物标志物的浓度情况如表10所示。
表10.干血片样品中的标志物浓度测定结果
3.6血清样本的测定：
(1)如图4所示，将标准曲线溶液(即7点校准标准)(10μL)、血清样品(10μL，n＝12)以及可选的质控溶液(包括3种浓度质控以及作为外部质控的NIST和HPS，其中混标质控和外部质控NIST可用于评价准确性，外部质控HPS可用于评价重复性)(10μL)等加入到96孔过滤板中；
(2)向各孔中加入含有内标的0.1％甲酸-甲醇溶液(300μL)，其中：内标浓度根据实际情况确定，以其响应值与其所对应的小分子生物标志物在标准曲线中间浓度点的响应值接近为准；
(3)再向各孔中加入500μmol/L的DTT水溶液(20μL)；
(4)在600rpm转速条件下振摇30min，将提取溶液在0.02MPa压力条件下过滤至96孔收集板，以去除蛋白质等大分子，得到待测样品；
(5)通过液质联用方法进行测定，并分析检测结果。
血清样品中11种小分子生物标志物的浓度情况如表11所示。
表11.血清样品中的标志物浓度测定结果
由上述实验结果可知，本发明的检测方法快速、准确、灵敏度高、专属性好、操作简便，为同时测定生物样品中存在的12种小分子生物标志物的浓度提供了一种新方法。该方法不仅适合于测定血清样品，而且适合于测定干血片样品，适用范围得到进一步扩展。利用本发明的检测方法可以有效地了解生物样品中特定标志物的浓度水平，进而可以为心脑血管疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。

Claims (9)

1.一种测定小分子生物标志物的方法，其包括下列步骤：
1)样品预处理：取包含小分子生物标志物的生物样品，加入内标、提取溶剂以及还原剂，混匀，去除蛋白质，得到待测样品；
2)色谱：对步骤1)中得到的待测样品进行液相色谱分离，色谱条件如下：色谱柱：HILIC色谱柱；流动相：二元流动相，流动相A为水，水中含有5～15mmol/L的甲酸铵或乙酸铵，流动相B为乙腈；流速：0.2～0.5mL/min；进样量：5～10μL；柱温：30～40℃；
3)质谱：对步骤2)中分离得到的组分进行质谱检测，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200～700℃；离子源电压：4500～5500V；碰撞气压：4～6psi；气帘气压：25～35psi；雾化气压：45～55psi；辅助气压：45～55psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式；
4)计算：采用标准曲线法，分别将存在对应关系的小分子生物标志物和内标的色谱峰面积的比值代入相应的标准曲线方程，再分别将无对应内标的小分子生物标志物的色谱峰面积代入相应的标准曲线方程，计算得出小分子生物标志物在生物样品中的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述小分子生物标志物有11种，分别如下：胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；所述内标有7种，分别如下：胆碱-d9、甜菜碱-d9、氧化三甲胺-d9、肌酐-d3、左旋肉碱-d3、缬氨酸-1-13C和苯丙氨酸-1-13C；所述还原剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述生物样品为干血片或血清。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述提取溶剂为甲酸-甲醇、乙酸-甲醇、甲酸-乙腈或乙酸-乙腈。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述去除蛋白质通过离心机或蛋白过滤板来完成。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤2)中所述HILIC色谱柱为Waters ACQUITYBEH HILIC色谱柱。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤2)中所述液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式，洗脱程序如下：以体积百分比计，从0至1分钟，流动相A为20％，流动相B为80％；从1至2分钟，流动相A由20％变化至30％，流动相B由80％变化至70％；从2至2.5分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；从2.5至3分钟，流动相A由30％变化至20％，流动相B由70％变化至80％；从3至5分钟，流动相A为20％，流动相B为80％。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤3)中所述多重反应监测涉及的小分子生物标志物和内标以及各自对应的监测离子对、去簇电压和碰撞能量如下：胆碱，m/z 103.8→60.0，101V，25eV；甜菜碱，m/z 118.1→41.9，56V，75eV；氧化三甲胺，m/z 76.0→58.0，41V，27eV；肌酐，m/z 114.0→86.1，46V，17eV；左旋肉碱，m/z 162.0→59.9，61V，29eV；同型半胱氨酸，m/z 136.0→90.0，46V，15eV；亮氨酸/异亮氨酸，m/z 132.2→85.9，21V，15eV；缬氨酸，m/z 118.2→72.0，26V，15eV；苯丙氨酸，m/z 166.1→119.9，46V，19eV；酪氨酸，m/z 182.1→165.2，46V，13eV；色氨酸，m/z205.1→188.1，31V，15eV；胆碱-d9，m/z 113.0→69.0，26V，25eV；甜菜碱-d9，m/z 127.1→68.0，66V，27eV；氧化三甲胺-d9，m/z 85.0→66.0，41V，29eV；肌酐-d3，m/z 117.0→88.9，61V，11eV；左旋肉碱-d3，m/z 165.1→103.1，56V，23eV；缬氨酸-1-13C，m/z 119.0→72.0，41V，15eV；苯丙氨酸-1-13C，m/z 167.1→120.1，41V，19eV。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤4)中所述对应关系如下：胆碱以胆碱-d9作为内标；甜菜碱以甜菜碱-d9为内标；氧化三甲胺以氧化三甲胺-d9为内标；肌酐以肌酐-d3为内标；左旋肉碱以左旋肉碱-d3为内标；缬氨酸以缬氨酸-1-13C为内标；苯丙氨酸以苯丙氨酸-1-13C为内标。
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