CN112305089A - 一种慢性肾病诊断生物标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种慢性肾病诊断生物标记物及其应用，所述生物标记物包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱或甜菜碱中的至少一种。所述标记物可用于在慢性肾病诊断试剂、试剂盒或检测装置的制备中。上述生物标记物的检测方法，包括以下步骤：取待检测对象的体液样本，对所述体液样本中的生物标记物浓度进行定量检测。所述检测方法还包括判定所述生物标记物定量的检测结果是否属于生物标记物的正常水平的步骤。通过检测本发明方案生物标记物的含量并与评价标准进行比较，用于实现慢性肾病的诊断，对于慢性肾病的诊断具有重要意义，同时还为开展相关药物评价和药效物质基础研究奠定了基础；通过取体液即可进行检测，取材方便且创伤性低。

Description

一种慢性肾病诊断生物标记物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种慢性肾病诊断生物标记物及其应用。
背景技术
肾脏是人体的重要器官，其基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。因此，肾脏对于保证机体内环境的稳定，确保新陈代谢得以正常进行具有重要意义。然而，生活方式不健康、免疫系统紊乱、营养缺乏或血液问题等多种因素都会引起肾脏病变。
近年来，肾脏病已经成为继肿瘤、心脑血管病、糖尿病之后，又一威胁人类健康的重要疾病。由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史大于3个月)，包括肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GFR)正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常或不明原因GFR下降超过3个月，即慢性肾脏病(chronic kidneydisease，CKD)。目前，我国成人慢性肾脏病发病率高达10.8％，慢性肾脏病临床症状往往不明显，流行病学调查显示，人群中对慢性肾脏病知晓率仅10％，有30％患者首次就诊时已是慢性肾衰，10％会进展至慢性肾功能衰竭终末期。慢性肾病按疾病等级可分为5期，然而，患者通常在慢性肾病4期之后才出现明显症状，而且一旦进入4期之后疾病进展迅速不可逆转，而现有检测技术水平有限在进入4期以前较难判别，且即使进入了4期也需要通过临床造影技术及病理检测等检测方式，方可实现诊断，这使得检测操作繁琐且周期较长，最终造成慢性肾病诊断困难，且后期的治疗更为困难。因此，若能找出能够用于慢性肾病诊断的生物标记物对于提升慢性肾病诊治率具有重要意义，尤其是若该诊断生物标记物能够通过创伤性低、取材方便的体液检查，即可对慢性肾病进行诊断，将对提高慢性肾病患者生存机率具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种能够用于慢性肾病诊断的生物标记物。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种上述生物标记物的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种慢性肾病诊断生物标记物，所述生物标记物包括氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide，TMAO)、胆碱、左旋肉碱或甜菜碱中的至少一种。
进一步地，所述生物标记物包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱和甜菜碱。
为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：上述生物标记物在慢性肾病诊断试剂、试剂盒或检测装置的制备中的应用。
进一步地，所述试剂盒包括生物标记物的标准品和内标物。
进一步地，所述试剂盒还包括空白血浆对照试剂和检测试剂；优选地，所述检测试剂包括蛋白沉淀液、稀释缓冲液和上样缓冲液。
为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案还可以为：一种慢性肾病诊断生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
取待检测对象的体液样本，对所述体液样本中的生物标记物浓度进行定量检测。
进一步地，所述体液样本为血浆、尿液或组织液中的至少一种。
进一步地，所述检测方法还包括判定所述生物标记物定量的检测结果是否属于生物标记物的正常水平的步骤；优选地，所述生物标记物中包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱和甜菜碱，则所述标记物的正常水平包括：所述氧化三甲胺的浓度低于400ng/ml，所述胆碱的浓度低于1100ng/ml，所述左旋肉碱的浓度低于9000ng/ml，所述甜菜碱的浓度低于7000ng/ml。
进一步地，通过液相色谱与质谱联用仪对所述生物标记物的浓度进行定量检测。
进一步地，所述液相色谱与质谱联用仪检测过程中，色谱条件为：
流动相：A相为乙腈，B相为pH＝3.0且浓度为10mmo/L的甲酸铵溶液，其中，A相与B相按体积比为70％:30％的比例进行等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气：N2；雾化气流速：8L/min；扫描模式：多反应监测模式。
本发明的有益效果在于：本发明方案提供了一种慢性肾病诊断生物标记物及其应用，通过检测本发明方案生物标记物的含量并与评价标准进行比较，可实现各个时期的慢性肾病的诊断，能够区分出慢性肾病的早晚期，对于慢性肾病诊断具有重要意义，同时还为开展相关药物评价和药效物质基础研究奠定了基础；本发明方案的生物标记物，通过取待检测对象的体液即可进行检测，取材方便、创伤性低且能够实现慢性肾病的早期诊断。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验组和对照组血浆中TMAO相对表达量结果图；
图2为本发明实施例2的实验组和对照组血浆中胆碱相对表达量结果图；
图3为本发明实施例3的实验组和对照组血浆中左旋肉碱相对表达量结果图；
图4为本发明实施例4的实验组和对照组血浆中甜菜碱相对表达量结果图；
图5为本发明实施例5的ROC曲线图；
图6为本发明实施例6的早晚期患者血浆中各生物标记物的浓度分布图；
图7为本发明实施例6的生物标记物对慢性肾病晚期患者血浆中生物标记物的ROC曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的实施例一为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括氧化三甲胺。
将该生物标记物用于慢性肾病的诊断，具体包括以下步骤：
S1、实验组样本和对照组样本的制备：
实验组：对已诊断为慢性肾病患者(47人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(64人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
S2、生物标记物浓度的检测：将实验组和对照组样本进行以下实验：
1)溶液配制：
沉淀剂：含20ng/mL内标(TMAO-D9)的乙腈；
稀释液：PBS溶液；
标准品：TMAO浓度分别为500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的50％甲醇溶液。
2)样本检测：取30μL血清或标准应用液，加入3倍体积的除蛋白液漩涡混匀后4℃、13200转/分钟离心15分钟后取上清(约90μL)转移至密封的进样瓶后通过液相色谱质谱联用仪进行检测，以保留时间和质谱图定性，通过内标法定量。
色谱和质谱条件为：
仪器：液相系统：ACQUITY UPLC I-Class(美国Waters公司)，质谱系统：SCIEX6500+(美国SCIEX公司)；
流动相：乙腈：10mmo/L甲酸铵(pH3.0)＝70％:30％(v/v)，等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气(N2)流速：8L/min；进行多反应监测模式扫描。
将实验组(标记为CN)和对照组(标记为CKD)的检测到的TMAO相对表达量检测结果图结果如图1所示，从图1中可以看出在慢性肾病患者和健康受试者中TMAO表达存在显著差异，TMAO在慢性肾病患者中表达量高，由此表明，TMAO可作为慢性肾病诊断生物标记物。
本发明的实施例二为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括胆碱(Choline)。
将该生物标记物用于慢性肾病的诊断，具体包括以下步骤：
S1、实验组样本和对照组样本的制备：
实验组：对已诊断为慢性肾病患者(47人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(64人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
S2、生物标记物浓度的检测：将实验组和对照组样本进行以下实验：
1)溶液配制：
沉淀剂：含20ng/mL内标(Choline-D9)的乙腈；
稀释液：PBS溶液；
标准品：Choline浓度分别为500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的50％甲醇溶液。
2)样本检测：取30μL血清或标准应用液，加入3倍体积的除蛋白液漩涡混匀后4℃、13200转/分钟离心15分钟后取上清(约90μL)转移至密封的进样瓶后通过液相色谱质谱联用仪进行检测，以保留时间和质谱图定性，通过内标法定量。
色谱和质谱条件为：
仪器：液相系统：ACQUITY UPLC I-Class(美国Waters公司)，质谱系统：SCIEX6500+(美国SCIEX公司)；
流动相：乙腈：10mmo/L甲酸铵(pH3.0)＝70％:30％(v/v)，等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气(N2)流速：8L/min；进行多反应监测模式扫描。
将实验组(标记为CN)和对照组(标记为CKD)的检测到的TMAO相对表达量检测结果图结果如图2所示，从图2中可以看出在慢性肾病患者和健康受试者中胆碱表达存在显著差异，胆碱在慢性肾病患者中表达量高，由此表明，胆碱可作为慢性肾病诊断生物标记物。
本发明的实施例三为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括左旋肉碱(L-carnitine)。
将该生物标记物用于慢性肾病的诊断，具体包括以下步骤：
S1、实验组样本和对照组样本的制备：
实验组：对已诊断为慢性肾病患者(47人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(64人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
S2、生物标记物浓度的检测：将实验组和对照组样本进行以下实验：
1)溶液配制：
沉淀剂：含20ng/mL内标(左旋肉碱(L-carnitine)-D3)的乙腈；
稀释液：PBS溶液；
标准品：L-carnitine浓度分别为500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的50％甲醇溶液。
2)样本检测：取30μL血清或标准应用液，加入3倍体积的除蛋白液漩涡混匀后4℃、13200转/分钟离心15分钟后取上清(约90μL)转移至密封的进样瓶后通过液相色谱质谱联用仪进行检测，以保留时间和质谱图定性，通过内标法定量。
色谱和质谱条件为：
仪器：液相系统：ACQUITY UPLC I-Class(美国Waters公司)，质谱系统：SCIEX6500+(美国SCIEX公司)；
流动相：乙腈：10mmo/L甲酸铵(pH3.0)＝70％:30％(v/v)，等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气(N2)流速：8L/min；进行多反应监测模式扫描。
将实验组(标记为CN)和对照组(标记为CKD)的检测到的TMAO相对表达量检测结果图结果如图3所示，从图3中可以看出在慢性肾病患者和健康受试者中左旋肉碱表达存在显著差异，左旋肉碱在慢性肾病患者中表达量高，由此表明，左旋肉碱可作为慢性肾病诊断生物标记物。
本发明的实施例四为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括甜菜碱(Betaine)。
将该生物标记物用于慢性肾病的诊断，具体包括以下步骤：
S1、实验组样本和对照组样本的制备：
实验组：对已诊断为慢性肾病患者(47人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(64人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中，均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
S2、生物标记物浓度的检测：将实验组和对照组样本进行以下实验：
1)溶液配制：
沉淀剂：含20ng/mL内标(甜菜碱Betaine-D9)的乙腈；
稀释液：PBS溶液；
标准品：Betaine浓度分别为500、200、100、50、20、10、5、2ng/mL的50％甲醇溶液。
2)样本检测：取30μL血清或标准应用液，加入3倍体积的除蛋白液漩涡混匀后4℃、13200转/分钟离心15分钟后取上清(约90μL)转移至密封的进样瓶后通过液相色谱质谱联用仪进行检测，以保留时间和质谱图定性，通过内标法定量。
色谱和质谱条件为：
仪器：液相系统：ACQUITY UPLC I-Class(美国Waters公司)，质谱系统：SCIEX6500+(美国SCIEX公司)；
流动相：乙腈：10mmo/L甲酸铵(pH3.0)＝70％:30％(v/v)，等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气(N2)流速：8L/min；进行多反应监测模式扫描。
将实验组(标记为CN)和对照组(标记为CKD)的检测到的TMAO相对表达量检测结果图结果如图3所示，从图3中可以看出在慢性肾病患者和健康受试者中甜菜碱表达存在显著差异，甜菜碱在慢性肾病患者中表达量高，由此表明，甜菜碱可作为慢性肾病诊断生物标记物。
本发明的实施例五为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱和左旋肉碱。对47名慢性肾病患者血浆和64名健康人血浆中的氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱和左旋肉碱浓度进行定量检测后，结合检测结果进行受试者工作特征(receiveroperating characteristic curve，ROC)曲线分析结果如图5所示，根据曲线下面积(areaunder curve，AUC)的大小(介于0.5～1.0之间)确定各物质与慢性肾病的关联性，AUC越大，说明该项指标的诊断效能越大(即诊断准确性越高)，各种指标的AUC值及相关统计学信息如下表1所示：
表1
Figure BDA0002145219370000091
结合表1及图5中可以看出，将氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱和左旋肉碱用于慢性肾病诊断时，虽有不同的诊断效能，但若将氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱和左旋肉碱联合用于慢性肾病诊断时准确性远高于单个标记物。
本发明的实施例六为：一种慢性肾病诊断生物标记物，包括氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱和左旋肉碱。将该慢性肾病诊断生物标记物应用于慢性肾病早期的判定，其中，慢性肾病早期是指进入4期以前，慢性肾病晚期是指4期以后。对47名确诊为慢性肾病患者(处于慢性肾病早期即CKD-1期的患者17名，慢性肾病晚期即CKD-2的患者30名)血浆中的慢性肾病诊断生物标记物浓度进行检测，结果如图6所示，其中，A图为不同病期甜菜碱(Betaine)浓度分布状态图；B图为不同病期胆碱(Choline)浓度分布状态图；C图为不同病期左旋肉碱(L-carnitine)浓度分布状态图；D图为不同病期TMAO浓度分布状态图；从图6中可以看出，这四种物质在慢性肾病早期和晚期人群中浓度差异明显，因此，通过四种物质浓度的分布情况可以实现慢性肾病早晚期的辨别。
结合检测结果对晚期患者(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线分析结果如图7所示，根据曲线下面积(area under curve，AUC)的大小(介于0.5～1.0之间)确定各物质与慢性肾病的关联性，AUC越大，说明该项指标的诊断效能越大(即诊断准确性越高)，各种指标的AUC值及相关统计学信息如下表2所示：
表2
Figure BDA0002145219370000101
结合图7和表2可以看出，将四种标记物结合起来可对晚期的诊断准确率可达100％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种慢性肾病诊断生物标记物，其特征在于：所述生物标记物包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱或甜菜碱中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的慢性肾病诊断生物标记物，其特征在于：所述生物标记物包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱和甜菜碱。
3.一种如权利要求1或2所述的慢性肾病诊断生物标记物在慢性肾病诊断试剂、试剂盒或检测装置的制备中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括生物标记物的标准品和内标物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括空白血浆对照试剂和检测试剂；优选地，所述检测试剂包括蛋白沉淀液、稀释缓冲液和上样缓冲液。
6.一种如权利要求1或2所述的慢性肾病诊断生物标记物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
取待检测对象的体液样本，对所述体液样本中的生物标记物浓度进行定量检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述体液样本为血浆、尿液或组织液中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括判定所述生物标记物定量的检测结果是否属于生物标记物的正常水平的步骤；优选地，所述生物标记物中包括氧化三甲胺、胆碱、左旋肉碱和甜菜碱，则所述标记物的正常水平包括：所述氧化三甲胺的浓度低于400ng/ml，所述胆碱的浓度低于1100ng/ml，所述左旋肉碱的浓度低于9000ng/ml，所述甜菜碱的浓度低于7000ng/ml。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：通过液相色谱与质谱联用仪对所述生物标记物的浓度进行定量检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述液相色谱与质谱联用仪检测过程中，色谱条件为：
流动相：A相为乙腈，B相为pH＝3.0且浓度为10mmo/L的甲酸铵溶液，其中，A相与B相按体积比为70％:30％的比例进行等度洗脱；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；干燥气温度：300℃；雾化气：N2；雾化气流速：8L/min；扫描模式：多反应监测模式。
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