CN114942276A - 一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其应用 - Google Patents

一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学检测分析技术领域，尤其涉及一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其应用。具体步骤包括：S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；S2.配制标准溶液和流动相；S3.将待测液加入超高效液相色谱‑质谱联用仪中进行上机检测。本发明测试结果准确高效，能够有效测试生物样本中的氧化三甲胺，肌酸酐，胆碱，甜菜碱，三甲胺和肉毒碱的浓度；步骤简便，结果稳定，色谱峰峰面积与化合物浓度间呈良好的定量关系，且测试程序仅需12min即可完成，极大程度提高了检测效率，操作可行性强；适用样品广，能够满足靶向代谢组学的分析精度要求。

Description

一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其 应用
技术领域
本发明涉及化学检测分析技术领域，尤其涉及一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其应用。
背景技术
肠道菌群的代谢是生物体内重要的生理过程，往往与全身炎症反应、心力衰竭有着密切的关系。氧化三甲胺(Trimetlylamine-N-oxide，TMAO)作为一类肠源性菌群的相关代谢产物，其合成位置为肝脏；生物体中的生物碱在肠道微生物的作用下转化为三甲胺，在三甲胺氧化酶的作用下转化为氧化三甲胺，之后经过机体循环随体液排出。氧化三甲胺及相关肠群代谢物存在于哺乳动物、植物及真菌中，与机体的多种生物学功能息息相关，如参与细胞分裂、防止蛋白变性、调节渗透压等，现有研究结果显示心血管疾病、动脉硬化、高血压等多种疾病的发生均与TMAO在体内的含量呈现相关关系；可见，TMAO及相关代谢物对于人体生理疾病的预防、监控、诊疗均有重要的参考价值，对于生命科学的研究探索具有深远意义。
现有技术中对氧化三甲胺的分析方法主要有分光光度法，色谱法和毛细管电泳法，分光光度法通过将氧化三甲胺衍生化为黄棕色的二甲氨基二硫代甲酸铜，测试吸光度以量化浓度；但是该方法的灵敏度低，检测结果重现性差，仅适用于饲料及水产动物中氧化三甲胺的检测。毛细管电泳法通过激光诱导荧光检测器的毛细管电泳仪进行检测，但毛细管直径小、光路短、电渗影响因素多等特点使得该方法的数据质量不尽如人意。色谱法又分为气相色谱法和液相色谱法，气相色谱法的灵敏度高，但是因为胺类剂型容易与极性固定相结合，容易在测试过程中出现峰拖尾、重影问题，局限了气相色谱法的应用。液相色谱法通过液体流动相分离目标待测物，具有灵敏度高、仪器便于维护等特点；但是液相色谱仪对低级脂肪胺进行检测时，传统手段需要先对胺类物质进行衍生化处理再进行定量测试，实验过程中容易产生误差；质谱作为一种高特异性、高灵敏度检测分析手段，对待测物进行分析后能够提供丰富的结构信息，将高效分离技术与精确分析手段有效结合能够实现各学科领域分析检测方法的突破性进展。在这样的背景下，将液相-质谱检测方法应用于生物样本，探究一种灵敏度高、检测效率高的的氧化三甲胺及相关代谢物分析方法成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明通过提供一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，解决了现有技术中生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法灵敏度低、适用样品范围窄等问题，实现了一种灵敏度高、检测效率高的生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法。
本发明第一方面提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体步骤包括：
S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；
S2.配制标准溶液和流动相；
S3.将待测液加入超高效液相色谱-质谱联用仪中进行上机检测。
在一种优选的实施方式中，所述生物样本为固体时，S1步骤具体为：向生物样本中加入溶剂一，涡旋，匀浆，超声处理3-10min；在-10～-80℃静置20-120min，过夜，离心，收集上清液即为待测液。
在一种优选的实施方式中，所述溶剂一为乙腈，甲酸，甲醇，乙醇中的一种或多种的组合。
在一种优选的实施方式中，所述生物样本为液体时，S1步骤具体为：解冻生物样品，并加入溶剂二，涡旋，超声，在-10～-80℃静置20-120min，离心，收集上清液即为待测液。
在一种优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪装备有色谱柱，所述色谱柱的规格为100×2.1mm,1.7μm；色谱柱的温度为35-45℃。
在一种优选的实施方式中，所述流动相为流动相A和流动相B；流动相A为甲酸盐水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合物。
在一种优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为4-10℃，进样体积为1-10μL。
在一种优选的实施方式中，所述S3步骤中，超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序为：
0～0.5min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％；
0.5～5min：流动相A为5％→14％，流动相B为95％→86％；
5～5.5min：流动相A为14％→60％，流动相B为86％→40％；
5.5～6min：流动相A为60％→60％，流动相B为40％→40％；
6～6.5min：流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％；
6.5～12min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％。
在一种优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱运行参数为：气帘气20-30psi，离子喷雾电压4000-6000V，离子源温度400-600℃，雾化气20-40psi，辅助气20-40psi。
本发明第二方面提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法的应用，该分析方法应用于生命科学领域研究。
有益效果：
本发明提供的生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法具有以下优点：
(1)本发明测试结果准确高效，能够有效测试生物样本中的氧化三甲胺，肌酸酐，胆碱，甜菜碱，三甲胺和肉毒碱的浓度，对于探究TMAO代谢以及生理活动机制具有重要意义；
(2)本发明步骤简便，结果稳定，色谱峰峰面积与化合物浓度间呈良好的定量关系，且测试程序仅需12min即可完成，极大程度提高了检测效率，操作可行性强；
(3)本发明适用样品广，对于固体样本和液体样本均呈现极低的相对标准偏差，方法针对氧化三甲胺的最低检出限和最低定量限分别为1.2nmol/L和9.7nmol/L，能够满足靶向代谢组学的分析精度要求。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体步骤包括：
S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；
S2.配制标准溶液和流动相；
S3.将待测液加入超高效液相色谱-质谱联用仪中进行上机检测。
在一些优选的实施方式中，所述生物样本为固体时，S1步骤具体为：向生物样本中加入溶剂一，涡旋，匀浆，超声处理3-10min；在-10～-80℃静置20-120min，过夜，离心，收集上清液即为待测液。
进一步优选，所述S1步骤的操作温度全程不超过4℃。
进一步优选，所述S1步骤具体为，取生物样本于2mL离心管中，加入1-3个小钢珠，然后加入溶剂一，涡旋10-45s，于30-50Hz条件下匀浆2-6min，然后冰水浴超声3-10min；重复匀浆和超声操作2-5次，在-20～-60℃静置40-80min，然后在2-5℃，11000-13000rpm条件下离心10-20min，收集上清液即为待测液。
优选的，所述生物样本和溶剂一的固液比为(10-100)：1。
更优选的，所述生物样本和溶剂一的固液比为50：1(mg/mL)。
在一些优选的实施方式中，所述溶剂一为乙腈，甲酸，甲醇，乙醇中的一种或多种的组合。
进一步优选，所述溶剂一为乙腈水溶液；乙腈的浓度为70-100％VOL；
更进一步优选，所述溶剂一中含有0.1％VOL的甲酸。
在一些优选的实施方式中，所述生物样本为液体时，S1步骤具体为：解冻生物样品，并加入溶剂二，涡旋，超声，在-10～-80℃静置20-120min，离心，收集上清液即为待测液。
进一步优选，所述生物样本为液体时，S1步骤具体为：将生物样品在冰水浴中解冻，涡旋20-45s，转移至离心管中，加入0.1％VOL的甲酸水溶液，然后加入溶剂二，涡旋20-50s，冰水浴超声5-15min，在-20～-60℃静置40-80min，在2-5℃，11000-13000rpm条件下离心10-20min，收集上清液即为待测液。
在一些优选的实施方式中，所述溶剂二为0.1％VOL甲酸的乙腈溶液。
进一步优选，所述生物样本，甲酸水溶液和溶剂二的体积比为1：(3-6)：(15-25)。
更进一步优选，所述生物样本，甲酸水溶液和溶剂二的体积比为1：4：20。
三甲胺在生物组织酶作用下转化为次级代谢产物氧化三甲胺，对于胺类化合物的检测是判断代谢紊乱疾病的热门方向，而现有技术通常以海产品、环境样品为基准进行测定，而生物样品的复杂性有别于其它样品，在样品预处理和检测过程中对分析方法的要求均明显更高。现有方法在对氧化三甲胺进行检测时往往采用柱前衍生话方法，增加了实验误差的引入风险。本发明通过实验研究发现，采用乙腈提取液对生物样本进行待测物质提取，并通过匀浆-超声-静置-离心的特定操作顺序，能够提升提取液对生物样本细胞组织的破坏程度，促使氧化三甲胺以及肌酸酐、胆碱、甜菜碱、三甲胺、肉毒碱等目标待测物最大程度溶出；通过特定的前处理方法，本方法不仅能够对固体生物样本中的氧化三甲胺进行检测，还能够对液体、尤其是血清中的氧化三甲胺和相关代谢物进行有效检测。
在一些优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪装备有色谱柱，所述色谱柱的规格为100×2.1mm,1.7μm；色谱柱的温度为35-45℃。
优选的，所述色谱柱的型号为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide。
在一些优选的实施方式中，所述标准溶液的配制方法为：准确称取标准物质固体于容量瓶中，加入溶剂三配制成10mmol/L的标准品储备液；取对应量标准品储备液于容量瓶中配置成浓度范围在0-10mmol/L的一系列标准溶液。
当生物样本为固体时，溶剂三为80％VOL乙腈水溶液(含1％VOL的甲酸)；当生物样本为液体时，溶剂三为0.1％VOL甲酸的乙腈溶液。
所述标准物质为肌酸酐(Creatinine)，胆碱(Choline)，甜菜碱(Betaine)，三甲胺(TMA)，氧化三甲胺(TMAO)和肉毒碱(L-Carnitine)。
进一步优选，所述标准溶液的浓度范围为0-1mmol/L
在一些优选的实施方式中，所述流动相为流动相A和流动相B；流动相A为甲酸盐水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合物。
进一步优选，所述流动相A为甲酸铵/甲酸水溶液；流动相B为0.1-2％VOL甲酸乙腈。
优选的，甲酸铵的浓度为8～12mmol/L，甲酸的浓度为0.5-2％VOL。
在一些优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为4-10℃，进样体积为1-10μL。
在一些优选的实施方式中，所述S3步骤中，超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序为：
0～0.5min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％；
0.5～5min：流动相A为5％→14％，流动相B为95％→86％；
5～5.5min：流动相A为14％→60％，流动相B为86％→40％；
5.5～6min：流动相A为60％→60％，流动相B为40％→40％；
6～6.5min：流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％；
6.5～12min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％。
所述流动相A和流动相B的百分比为体积百分比。
在一些优选的实施方式中，所述流动相的流速为200-600μL/min；进一步优选，所述流动相的流速为400μL/min。
同时对多种目标待测物进行检测时，需要控制各物质出峰的分离度；分离度较低时各个峰之间交错重叠，所得到的峰面积结果不能够客观表征待测物的真实浓度。采用上述方法对生物样本进行前处理不仅提升了目标化合物的溶出，同时不可避免地在溶剂中引入了杂质，对基线干扰严重，测试结果难以保持稳定重现性。本发明经过大量实验探究发现，当如上设置超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序，尤其是流动相的流速为400μL/min时，能够明显提升氧化三甲胺以及肌酸酐、胆碱、甜菜碱、三甲胺、肉毒碱的分离情况，各目标化合物的色谱分离情况佳、峰形好，所得到的数据结果重现性好，RSD能够低于3％，色谱峰面积与待测化合物浓度间呈良好的定量关系，生物样本的测试结果可靠性提升。
在一些优选的实施方式中，所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱为SCIEX6500QTRAP+高灵敏度质谱仪，该质谱仪装备有三重四极杆质谱仪，IonDrive Turbo V ESI离子源，并以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
进一步优选，所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱运行参数为：气帘气20-30psi，离子喷雾电压4000-6000V，离子源温度400-600℃，雾化气20-40psi，辅助气20-40psi。
进行超高效液相色谱-质谱分析之前，将目标化合物标准溶液引入质谱中。针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其MRM参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析。本发明中所有质谱数据的采集及目标化合物的定量分析工作均通过SCIEX AnalystWork Station Software(Version 1.6.3)和Sciex MultiQuantTM 3.0.3来完成。
本发明采用液相色谱仪和高灵敏度质谱仪联用，并设置特定的质谱仪运行参数，将流动相分离出的待测物质转化为带电荷的离子，按照质荷比有序排列，所得到的标准曲线线性关系好，避免了基质效应对测定结果产生的误差，提升了分析方法的准确性。经过大量实验探究发现，当离子源温度为400-600℃，尤其是480℃时，目标化合物的检出限能够低至1.22nmol/L，且目标化合物的平均回收率能够达到99％，对于液体血清样本和固体小鼠粪便样本中的目标化合物的测试结果准确可靠，能够满足靶向代谢组学分析的要求。
本发明第二方面提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法的应用，该分析方法应用于生命科学领域研究。
实施例
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，所述提取物的提取方法均为常规的提取方法。
实施例1.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体步骤包括：
S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；
S2.配制标准溶液和流动相；
S3.将待测液加入超高效液相色谱-质谱联用仪中进行上机检测。
所述生物样本为人体血清，来源于上海阿趣生物科技有限公司；测试前于-80℃避光保存。
S1步骤具体为：将生物样品在冰水浴中解冻，涡旋30s，转移至离心管中，加入0.1％VOL的甲酸水溶液，然后加入溶剂二，涡旋30s，冰水浴超声10min，在-40℃静置60min，过夜，在4℃，12000rpm条件下离心15min，收集上清液即为待测液。
所述溶剂二为0.1％VOL甲酸的乙腈溶液。
所述生物样本，甲酸水溶液和溶剂二的体积比为1：4：20。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪装备有色谱柱，所述色谱柱的规格为100×2.1mm,1.7μm；色谱柱的温度为40℃。
所述色谱柱的型号为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide。
所述标准溶液的配制方法为：准确称取标准物质固体于容量瓶中，加入溶剂三配制成各标准物质的浓度梯度均为10mmol/L的标准品储备液；取对应量标准品储备液于容量瓶中配置成各标准物质的浓度梯度均为0，0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L的标准溶液。
所述溶剂三为0.1％VOL甲酸的乙腈溶液。
所述标准物质为肌酸酐，胆碱，甜菜碱，三甲胺，氧化三甲胺和肉毒碱。
所述流动相为流动相A和流动相B；流动相A为甲酸盐水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合物。
所述流动相A为10mmol/L的甲酸铵/1％VOL甲酸水溶液；流动相B为1％VOL甲酸乙腈。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为4℃，进样体积为1μL。
所述S3步骤中，超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序为：
0～0.5min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％；
0.5～5min：流动相A为5％→14％，流动相B为95％→86％；
5～5.5min：流动相A为14％→60％，流动相B为86％→40％；
5.5～6min：流动相A为60％→60％，流动相B为40％→40％；
6～6.5min：流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％；
6.5～12min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％。
所述流动相A和流动相B的百分比为体积百分比。
所述流动相的流动速度为400μL/min。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱为SCIEX 6500 QTRAP+高灵敏度质谱仪，该质谱仪装备有三重四极杆质谱仪，IonDrive Turbo V ESI离子源，并以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱运行参数为：气帘气25si，离子喷雾电压5500V，离子源温度480℃，雾化气30psi，辅助气30psi。
实施例2.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体步骤包括：
S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；
S2.配制标准溶液和流动相；
S3.将待测液加入超高效液相色谱-质谱联用仪中进行上机检测。
所述生物样本为小鼠粪便，来源于上海阿趣生物科技有限公司；测试前于-80℃避光保存。
所述S1步骤具体为，取生物样本于2mL离心管中，加入2个小钢珠，然后加入溶剂一，涡旋30s，于40Hz条件下匀浆5min，然后冰水浴超声5min；重复匀浆和超声操作3次，在-40℃静置60min，然后在4℃，12000rpm条件下离心15min，收集上清液即为待测液。
所述生物样本和溶剂一的固液比为50：1。
所述溶剂一为乙腈水溶液；乙腈的浓度为80％VOL。
所述溶剂一中含有0.1％VOL的甲酸。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪装备有色谱柱，所述色谱柱的规格为100×2.1mm,1.7μm；色谱柱的温度为40℃。
所述色谱柱的型号为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide。
所述标准溶液的配制方法为：准确称取标准物质固体于容量瓶中，加入溶剂三配制成各标准物质的浓度梯度均为10mmol/L的标准品储备液；取对应量标准品储备液于容量瓶中配置成各标准物质的浓度梯度均为0，0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L的标准溶液。
所述溶剂三为80％VOL乙腈水溶液(含0.1％VOL的甲酸)。
所述标准物质为肌酸酐，胆碱，甜菜碱，三甲胺，氧化三甲胺和肉毒碱。
所述流动相为流动相A和流动相B；流动相A为甲酸盐水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合物。
所述流动相A为10mmol/L的甲酸铵/1％VOL甲酸水溶液；流动相B为1％VOL甲酸乙腈。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为4℃，进样体积为1μL。
所述S3步骤中，超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序为：
0～0.5min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％；
0.5～5min：流动相A为5％→14％，流动相B为95％→86％；
5～5.5min：流动相A为14％→60％，流动相B为86％→40％；
5.5～6min：流动相A为60％→60％，流动相B为40％→40％；
6～6.5min：流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％；
6.5～12min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％。
所述流动相A和流动相B的百分比为体积百分比。
所述流动相的流动速度为400μL/min。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱为SCIEX 6500 QTRAP+高灵敏度质谱仪，该质谱仪装备有三重四极杆质谱仪，IonDrive Turbo V ESI离子源，并以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱运行参数为：气帘气25si，离子喷雾电压5500V，离子源温度480℃，雾化气30psi，辅助气30psi。
实施例3.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：所述生物样本，甲酸水溶液和溶剂二的体积比为1：4：15。
实施例4.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例2；不同点在于：所述生物样本和溶剂一的固液比为10：1。
实施例5.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：S1步骤中离心速度为13500rpm。
实施例6.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例2；不同点在于：所述S1步骤具体为，取生物样本于2mL离心管中，加入2个小钢珠，然后加入溶剂一，涡旋30s，然后冰水浴超声5min；重复匀浆和超声操作3次，在-40℃静置60min，然后在4℃，12000rpm条件下离心15min，收集上清液即为待测液。
实施例7.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：所述流动相的流动速度为500μL/min。
实施例8.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：色谱柱的温度为45℃。
实施例9.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为10℃
实施例10.
本实施例提供了一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，具体实施方式同实施例1；不同点在于：所述生物样本为人体血浆，来源于上海阿趣生物科技有限公司。
性能测试方法
数据离散度：
对实施例1-10的每组实施例样品设置10份平行样品，测试完成后计算每组实施例平行样本中目标化合物(氧化三甲胺，肌酸酐，胆碱，甜菜碱，三甲胺，肉毒碱)的浓度之和，计算平行样品目标化合物浓度之和的相对标准偏差STD；回收率R：
将0.2mmol/L标准溶液作为待测样品按照实施例1-10的分析方法进行检测，得到目标化合物中氧化三甲胺的测试结果Cx，回收率R＝|0.2-Cx|/0.2*100％。
最低定量限LOQ和最低检出限LOD：
将Milli Q水作为待测样本，(1)按照实施例1-10的分析方法进行前处理并上机检测，每个实施例分析方法平行测定20次，计算目标化合物氧化三甲胺浓度的相对标准偏差RSD1，计算最低定量限LOQ＝3*RSD1；(2)按照实施例1-10的分析方法直接上机检测(即未经过前处理)，每个实施例分析方法平行测定20次，计算目标化合物氧化三甲胺浓度的相对标准偏差RSD2，计算最低检出限LOD＝3*RSD2。
性能测试数据
表1.性能测试结果
Figure BDA0003121381170000121
Figure BDA0003121381170000131
最后指出，前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1.对生物样本进行前处理，得到待测液；
S2.配制标准溶液和流动相；
S3.将待测液加入超高效液相色谱-质谱联用仪中进行上机检测。
2.根据权利要求1所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述生物样本为固体时，S1步骤具体为：向生物样本中加入溶剂一，涡旋，匀浆，超声处理3-10min；在-10～-80℃静置20-120min，离心，收集上清液即为待测液。
3.根据权利要求2所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述溶剂一为乙腈，甲酸，甲醇，乙醇中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述生物样本为液体时，S1步骤具体为：解冻生物样品，并加入溶剂二，涡旋，超声，在-10～-80℃静置20-120min，过夜，离心，收集上清液即为待测液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱联用仪装备有色谱柱，所述色谱柱的规格为100×2.1mm,1.7μm；色谱柱的温度为35-45℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述流动相为流动相A和流动相B；流动相A为甲酸盐水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱联用仪的进样温度为4-10℃，进样体积为1-10μL。
8.根据权利要求6任一项所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述S3步骤中，超高效液相色谱-质谱联用仪的梯度洗脱程序为：
0～0.5min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％；
0.5～5min：流动相A为5％→14％，流动相B为95％→86％；
5～5.5min：流动相A为14％→60％，流动相B为86％→40％；
5.5～6min：流动相A为60％→60％，流动相B为40％→40％；
6～6.5min：流动相A为60％→5％，流动相B为40％→95％；
6.5～12min：流动相A为5％→5％，流动相B为95％→95％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱联用仪中的质谱运行参数为：气帘气20-30psi，离子喷雾电压4000-6000V，离子源温度400-600℃，雾化气20-40psi，辅助气20-40psi。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法的应用，其特征在于，该分析方法应用于生命科学领域研究。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080161228A1 (en) * 2006-09-15 2008-07-03 Metabolon Inc. Methods of identifying biochemical pathways
CN109239212A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 一种测定小分子生物标志物的方法
CN111983112A (zh) * 2020-09-09 2020-11-24 南京诺禾致源生物科技有限公司 血清中tmao及其相关代谢物的检测方法
CN112730706A (zh) * 2021-02-04 2021-04-30 麦特绘谱生物科技（上海）有限公司 一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080161228A1 (en) * 2006-09-15 2008-07-03 Metabolon Inc. Methods of identifying biochemical pathways
CN109239212A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 一种测定小分子生物标志物的方法
CN111983112A (zh) * 2020-09-09 2020-11-24 南京诺禾致源生物科技有限公司 血清中tmao及其相关代谢物的检测方法
CN112730706A (zh) * 2021-02-04 2021-04-30 麦特绘谱生物科技（上海）有限公司 一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUHAMMAD ZUBAIR ISRAR等: "Association of gut-related metabolites with outcome in acute heart failure", AMERICAN HEART JOURNAL *
陈偲等: "测定血清游离胆碱、甜菜碱、三甲胺和胺 氧化三甲UPLC-MS/MS", 中国公共卫生 *

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