CN112180005B - 一种预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用 - Google Patents

一种预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于保留时间预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用。所述方法针对不同类型的生物样本，采用超高效液相色谱‑高分辨质谱仪，以全扫描与非数据依赖性数据采集模式进行数据采集，利用化合物的精确质量偏差和特征碎片离子两个判定依据，初步鉴定生物样本中的酰基肉碱，然后基于鉴定数据建立保留时间预测模型，筛除假阳性结果。本发明建立了基于非数据依赖性数据采集和保留时间预测模型的方法联用，极大提高生物样本中酰基肉碱的检测通量和总检出数量，提高了鉴定结果的可靠性。该方法具有高通量、稳定性好、定性结果准确率高、便捷和适应性强的优点。

Description

一种预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用
技术领域
本发明属于分析化学和疾病代谢组学技术领域，具体涉及一种基于保留时间预测辅助质谱特征信息鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用。
背景技术
肉碱的化学结构是L-3-羟基-4-三甲基氨基丁酸。酰基肉碱是一类重要的内源性代谢物，在脂肪酸β-氧化和支链氨基酸代谢过程中起到了重要的作用，其代谢轮廓在体内的不正常分布会引发糖尿病等多种疾病，所以对人体内酰基肉碱的代谢轮廓分析有利于疾病的早期筛查和诊断。但酰基肉碱的种类繁多，在生物样本中酰基肉碱的鉴定一直受限于标准物质稀缺和数据库覆盖狭隘等问题，丞需建立一种高通量的定性鉴定方法来发现和鉴别酰基肉碱类化合物。
数据依赖性采集(DDA)技术广泛地被应用于代谢组学和分析化学中非靶向化合物的特征碎片的监测，而多反应监测(MRM)和平行反应监测(PRM) 等采集技术则被用于已知特征的靶向监测。有报道使用数据依赖性分析方法采集酰基肉碱的质谱信息，然而，数据依赖性采集方法在二级质谱信息的采集上存在歧视效应，无法获得响应较低的酰基肉碱特征碎片信息，化合物的覆盖面也因此受到了限制。
虽然脂类化合物的碳链长度和碳链上的双键数量这两个参数经常被用来建立模型，预测化合物的保留时间，目前尚无理想的酰基肉碱化合物的预测模型。文献报道使用预测油水分配系数CLogP建立酰基肉碱保留时间模型辅助定性的方法，也有使用化合物分子量建立模型的方法，然而不论酰基肉碱的CLogP 还是分子量均与其酰基链上的碳原子数量有较高的相关性而可互相替代。同时，这些模型对长链，特别是含20个碳原子数量以上的脂肪链的脂质的时间预测偏差较大，预测能力有限。因此，需要一种覆盖面广的采集方式，结合准确度高的时间预测模型来发现和鉴定酰基肉碱，同时避免过程中的方法歧视和化合物覆盖狭隘等问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种基于保留时间预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法及其应用。该方法利用非依赖性数据采集模式分析生物样本，基于质谱特征初步鉴定样品中的酰基肉碱，然后基于鉴定数据中酰基肉碱上酰基链的碳原子数量和双键数量建立与化合物的相对累积洗脱强度的保留时间预测模型，通过酰基肉碱的预测保留时间辅助定性。该方法的前处理简单且对样品中酰基肉碱的覆盖全面，采用非依赖性数据采集模式，具有无化合物歧视、信息获取全面和高灵敏度的优点。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种基于保留时间预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法，步骤如下：
(1)生物血液样本：取50mg±1mg的血液样本于1.5mL离心管中，加入1mL体积比为2∶1的氯仿/甲醇，放置于涡旋仪上涡旋5min，加入200μL 的超纯水，涡旋混匀，8000rpm离心5min，将上层提取液作为亲水组分，下层提取液作为疏水组分，分别将其转移至两个1.5mL离心管中，在45℃、3000 rpm和0.1psi的条件下将提取液浓缩至近干；
生物肝脏样本：取20mg±0.5mg的生物肝脏于1.5mL离心管中，加入 70μL体积比1∶1的甲醇/水，加入氧化锆小球，采用组织研磨仪在60Hz的条件下研磨提取20s，重复两次；将上述提取后的样品放入离心机中，在4℃， 13000rpm的条件下离心20min，取50μL离心后肝脏的上清液作为亲水组分；在提取后剩余的肝脏残渣中加入70μL的甲基叔丁基醚，重复之前肝脏的研磨和离心步骤，再将50μL肝脏的上清液作为疏水组分转移至1.5mL离心管中；在45℃，3000rpm和0.1psi的条件下将肝脏的亲水组分和疏水组分的提取液浓缩至近干；
(2)血液和肝脏的亲水组分用250μL的95％乙腈复溶，疏水组分用250μL 体积比1∶1∶2的水/乙腈/异丙醇混合溶液复溶，待进样分析。
(3)对于生物样本的亲水/疏水组分，采用超高效液相色谱-高分辨质谱的全扫描模式-数据非依赖性采集数据，同时非靶向采集酰基肉碱的一级和二级质谱信息；
①液相色谱条件：Waters Acquity CSH C18色谱柱2.1×100mm，1.7μm；柱温为55℃；流动相：A相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比6∶4的乙腈/水混合液，B相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比9∶1的异丙醇/乙腈混合液；流量设置为0.4mL/min；洗脱梯度为：0-2.0min，40％-43％B；2.0-2.1 min，43％-50％B；2.1-12.0min，50％-54％B；12.0-12.1min，54％-70％B；12.1-18.0 min，70％-99％B；18.0-18.1min 99％-40％B；18.1-20.0min，40％B；
②质谱条件：ESI源，正离子模式，喷雾电压：3300V；鞘气，辅助气，吹扫气分别为40、10、1；接口温度、辅助气温度分别为300、350℃；碰撞能量为30eV，40eV，50eV；
(4)基于获得的化合物的一级质谱特征相对预测值的质量偏差，以及二级质谱信息中特征碎片离子的匹配度，将满足以下条件的化合物初步定性为酰基肉碱：
①一级质谱特征离子的质量偏差相对预测值小于5ppm；
②特征二级质谱碎片必须含有m/z 85.0284，m/z 60.0808两个特征离子，且离子的质量偏差小于5ppm；
(5)基于初步定性的酰基肉碱数据及定性数据中阳性酰基肉碱的酰基链的碳原子数量和双键数量，建立与酰基肉碱的相对累积洗脱强度的保留时间预测模型；
①酰基肉碱的酰基链的碳原子数量和双键数量与酰基肉碱相对洗脱强度的预测模型的公式为：
ε°RC＝aXCN+bXDB+c (1)，
或Log(ε°RC)＝aXCN+bXDB+c (2)。
其中，XCN为酰基肉碱酰基链上的碳原子数量，XDB为酰基肉碱酰基链上的双键数量，ε°RC为酰基肉碱的相对累积洗脱强度。如果用于拟合线性方程的酰基肉碱数据为正态分布，则ε°RC无需进行Log转化，即使用公式(1)进行计算；如果数据为非正态分布，则ε°RC需要进行Log转化，即使用公式(2)进行计算， a、b、c为拟合常数。
酰基肉碱的拟合公式根据其化合物结构不同分为非羟基取代、单羟基取代和二羧基/二羧基-羟基取代三类，非羟基取代酰基肉碱的拟合方程见公式(3)；单羟基取代酰基肉碱的方程见公式(4)；二羧基/二羧基-羟基取代酰基肉碱的方程见公式(5)。
Figure BDA0002660799450000041
②酰基肉碱在洗脱时间中有机溶剂的相对累积洗脱强度(ε°RC)的公式为：
Figure BDA0002660799450000042
其中，ε°i代表了不同有机溶剂在C18色谱柱的反相色谱体系中的洗脱强度，方法中乙腈的洗脱强度为3.1，异丙醇的洗脱强度为8.3，υ(t)i代表了该有机溶剂在酰基肉碱的洗脱时间中消耗的总体积，ε°ref代表了参考物质的累积洗脱强度；
③通过相对累积洗脱强度与酰基肉碱保留时间的关系计算酰基肉碱的保留时间，公式为：
Figure BDA0002660799450000043
其中，A、B、C三个常量的值对应的ε°RC值范围为：
Figure BDA0002660799450000044
(6)最后若酰基肉碱的保留时间预测值与真实值的相对偏差小于20％，而且绝对偏差小于1.0min，即认定酰基肉碱为阳性结果，否则认为是假阳性结果。
进一步的，所述生物样本还包括人体或动物的尿液、血液、组织、细胞和其提取液。
本发明还提供了所述的基于保留时间预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法在用于检测或筛查代谢异常相关的酰化肉碱生物标记物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明所述的基于保留时间预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法相比传统方法避免了仪器采集酰基肉碱二级特征时的歧视问题，增加了酰基肉碱覆盖，并基于相对累积洗脱强度这一参数建立的保留时间预测模型，其相比传统预测方法对长链酰基肉碱的预测更为准确。本发明建立了基于非数据依赖性数据采集和保留时间预测模型的方法联用，极大提高生物样本中酰基肉碱的检测通量和总检出数量，本方法具有高通量、稳定性好、定性结果准确率高、便捷和适应性强的优点。
附图说明
图1：酰基肉碱的鉴定流程图。
图2：十四烯酰基肉碱的质谱鉴定图谱。
图3：非羟基取代的酰基肉碱的相对累积洗脱强度ε°RC与碳链上碳原子数量的线性关系。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
基于混合生物样本，全扫描-数据非依赖采集模式分析，保留时间预测的方法对大鼠肝脏内酰基肉碱进行鉴定，步骤如下(图1)：
(1)样本预处理：取20±0.5mg的大鼠肝脏于1.5mL离心管中，加入70 μL体积比1∶1的甲醇/水混合液，加入氧化锆小球，采用组织研磨仪在60Hz的条件下研磨提取20s，重复操作两次。将上述提取后的样品放入离心机中，在 4℃，13000rpm的条件下离心20min；取50μL离心后的上清液置于1.5mL 的离心管中，放入真空浓缩离心机中，在45℃，3000rpm和0.1psi的条件下将提取液浓缩至近干，用250μL的95％乙腈复溶，作为亲水组分，待进样。在提取后剩余的肝脏残渣加入70μL的甲基叔丁基醚，重复之前的研磨、离心和浓缩步骤，最后用250μL体积比1∶1∶2的水/乙腈/异丙醇混合液复溶，作为疏水组分，待进样。
(2)液相色谱条件：WatersAcquity CSH C18色谱柱2.1×100mm，1.7μm；柱温为55℃；流动相：A相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比6∶4的乙腈/水混合液，B相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比9∶1的异丙醇/乙腈混合液；流量设置为0.4mL/min；洗脱梯度为：0-2.0min，40％-43％B；2.0-2.1 min，43％-50％B；2.1-12.0min，50％-54％B；12.0-12.1min，54％-70％B；12.1-18.0 min，70％-99％B；18.0-18.1min 99％-40％B；18.1-20.0min，40％B。
(3)质谱条件：ESI源，正离子模式，喷雾电压：3300V；鞘气，辅助气，吹扫气分别为40、10、1；接口温度、辅助气温度分别为300、350℃；碰撞能量为30eV，40eV，50eV。
(4)生物样本分析：对于大鼠肝脏的亲水/疏水组分样本，采用全扫描-数据非依赖性扫描方式采集数据，同时非靶向采集化合物的一级和二级质谱信息。
(5)酰基肉碱定性：对上述化合物的质谱信息，基于化合物的一级质谱特征预测列表(表1)和特征二级质谱碎片，将满足以下条件的化合物定性为酰基肉碱：
①一级特征离子的质量偏差相对预测值小于5ppm；
②特征二级质谱碎片必须含有m/z 85.0284，m/z 60.0808两个特征离子，质量偏差小于5ppm。
图2为十四烯酰基肉碱的质谱鉴定图谱，其分子式为C21H39NO4，[M+H]+离子的精确质量为370.2946，在一级质谱图上发现了两个与十四烯酰基肉碱母离子预测值匹配的色谱峰，对两个特征的二级质谱图分析得出位于0.88min色谱峰的二级特征匹配了m/z85.0284，m/z 60.0808两个特征离子，而位于1.28min 色谱峰的二级特征没有发现特征离子，由此初步定性0.88min的特征为十四烯酰基肉碱。
(6)保留时间模型的建立：基于初步定性的酰基肉碱数据，根据不同取代基将酰基肉碱分为非羟基取代、单羟基取代、二羧基/二羧基-羟基取代三个类别，用三个类别酰基肉碱的数据分别建立相对累积洗脱强度-酰基链长度和双键数的二元一次线性方程；由于数据的相对累积洗脱强度是偏差分布，所以作Log 转换以提升线性拟合度。基于数据在线性方程中的绝对偏差，在多次的线性拟合过程中，逐步剔除偏差大于1.0、0.8、0.6、0.4、0.2的数据点，直到线性方程中所有数据点的偏差均小于0.2时认为线性方程满足要求。
非羟基取代酰基肉碱的拟合方程见公式1；单羟基取代酰基肉碱的方程见公式2；二羧基/二羧基-羟基取代酰基肉碱的方程见公式3，其中，XCN为酰基肉碱酰基链上的碳原子数量，XDB为酰基肉碱酰基链上的双键数量，ε°RC为酰基肉碱的相对累积洗脱强度。
Figure BDA0002660799450000071
酰基肉碱的相对累积洗脱强度与其酰基链长度相关性的线性曲线如图3所示，图中显示了非羟基取代的烷烃酰基肉碱在不同双键数量条件下，相对累积洗脱强度和碳链上碳原子数量具有线性关系。
(7)基于模型预测的化合物辅助鉴定：基于酰基肉碱的线性方程，代入酰基肉碱的酰基链的碳原子数量和双键数，计算出化合物的Log(ε°RC)值，再依据公式4中化合物ε°RC与化合物累积洗脱强度
Figure BDA0002660799450000075
的关系，通过公式5 得出保留时间的预测值。其中，公式5中涉及的A、B、C三个常量的值在不同的预测ε°RC值范围也不同，其数值和对应的范围参照公式6中所示。如果保留时间的预测值与真实值的相对偏差小于20％，而且绝对偏差小于1.0min，即认为酰基肉碱为阳性结果，否则认为是假阳性结果。
Figure BDA0002660799450000072
Figure BDA0002660799450000073
Figure BDA0002660799450000074
在公式中，ε°i代表了不同有机溶剂在C18色谱柱的反相色谱体系中的洗脱强度，方法中乙腈的洗脱强度为3.1，异丙醇的洗脱强度为8.3；υ(t)i代表了该有机溶剂在酰基肉碱的洗脱时间中消耗的总体积。
采用本发明的鉴定方法，分别从鼠肝脏亲水和疏水组分中分别鉴定了115 种和132种酰基肉碱，结果详见表2～表3。
实施例2
基于混合生物样本，全扫描-数据非依赖采集模式分析，保留时间预测的方法对人体血液样本中酰基肉碱的鉴定，步骤如下：
(1)样本预处理：
取50±1mg的人血样本于1.5mL离心管中，加入1mL体积比为2∶1的氯仿/甲醇混合液，放置于涡旋仪上涡旋5min，加入200μL的超纯水，涡旋混匀后在8000rpm的条件下离心5min，将上层提取液作为亲水组分、下层提取液作为疏水组分，分别将其转移至两个1.5mL离心管中，在45℃，3000rpm和 0.1psi的条件下将提取液浓缩至近干，亲水组分用250μL的95％乙腈复溶，疏水组分用250μL体积比1∶1∶2的水/乙腈/异丙醇混合液复溶，待进样。
(2)液相色谱条件：WatersAcquity CSH C18色谱柱2.1×100mm，1.7μm，柱温为55℃，流动相：A相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比6∶4的乙腈/水混合液，B相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比9∶1的异丙醇/乙腈混合液；流量设置为0.4mL/min；洗脱梯度为：0-2.0min，40％-43％B；2.0-2.1 min，43％-50％B；2.1-12.0min，50％-54％B；12.0-12.1min，54％-70％B；12.1-18.0 min，70％-99％B；18.0-18.1min 99％-40％B；18.1-20.0min，40％B。
(3)质谱条件：ESI源，正离子模式，喷雾电压：3300V；鞘气，辅助气，吹扫气分别为40、10、1；接口温度、辅助气温度分别为300，350℃；碰撞能量为30eV，40eV，50eV。
(4)生物样品分析：对人体血液的亲水/疏水组分样本，采用全扫描-数据非依赖性扫描方式采集数据，同时非靶向采集酰基肉碱的一级和二级质谱信息。
(5)酰基肉碱定性：对上述酰基肉碱的质谱和保留时间信息，基于酰基肉碱的一级质谱特征预测列表(表1)、特征二级质谱碎片和预测保留时间(计算同实施例1)，将满足以下条件的酰基肉碱定性为阳性结果：
①一级特征离子的质量偏差相对预测值小于5ppm；
②特征二级质谱碎片必须含有m/z 85.0284，m/z 60.0808两个特征离子，质量偏差小于5ppm；
③酰基肉碱保留时间的预测值与真实值(试验值)的相对偏差小于20％，而且绝对偏差小于1.0min。
采用本发明的鉴定方法，分别从人体血液的亲水和疏水组分中鉴定出44种和145种酰基肉碱物质，具体结果见表4和表5。
表1酰基肉碱的一级质谱特征预测列表
Figure BDA0002660799450000081
Figure BDA0002660799450000091
Figure BDA0002660799450000101
Figure BDA0002660799450000111
Figure BDA0002660799450000121
Figure BDA0002660799450000131
Figure BDA0002660799450000141
表2大鼠肝脏亲水组分中的酰基肉碱
Figure BDA0002660799450000142
Figure BDA0002660799450000151
Figure BDA0002660799450000161
Figure BDA0002660799450000171
表3大鼠肝脏疏水组分中的酰基肉碱
Figure BDA0002660799450000181
Figure BDA0002660799450000191
Figure BDA0002660799450000201
Figure BDA0002660799450000211
Figure BDA0002660799450000221
Figure BDA0002660799450000231
表4人血亲水组分中的酰基肉碱
Figure BDA0002660799450000232
Figure BDA0002660799450000241
表5.人血疏水组分中的酰基肉碱
Figure BDA0002660799450000242
Figure BDA0002660799450000251
Figure BDA0002660799450000261
Figure BDA0002660799450000271
Figure BDA0002660799450000281
Figure BDA0002660799450000291
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种预测鉴定生物样本中酰基肉碱的方法，其特征在于：所述方法的步骤如下：
(1)收集生物样本并处理，分别提取出亲水组分和疏水组分，经浓缩后，所述亲水组分用乙腈复溶，所述疏水组分用水/乙腈/异丙醇混合溶液复溶；
(2)对于生物样本的亲水/疏水组分，采用超高效液相色谱-高分辨质谱的全扫描模式-数据非依赖性的采集模式，非靶向地采集化合物的一级和二级质谱特征信息；
(3)基于步骤(2)获得的化合物的一级质谱特征相对预测值的质量偏差，以及二级质谱信息中特征碎片离子的匹配度，对化合物进行酰基肉碱初步定性；
(4)基于初步定性数据中阳性酰基肉碱的酰基链的碳原子数量和双键数量，建立与酰基肉碱相对累积洗脱强度的预测模型，然后基于酰基肉碱的预测保留时间，辅助初步定性结果的鉴定并排除假阳性结果；
①酰基肉碱的酰基链的碳原子数量和双键数量与酰基肉碱相对洗脱强度的预测模型的公式为：
ε°RC＝aXCN+bXDB+c (1)，
或Log(ε°RC)＝aXCN+bXDB+c (2)；
其中，XCN为酰基肉碱酰基链上的碳原子数量，XDB为酰基肉碱酰基链上的双键数量，ε°RC为酰基肉碱的相对累积洗脱强度；如果用于拟合线性方程的酰基肉碱数据为正态分布，则ε°RC无需进行Log转化，即使用公式(1)进行计算；如果数据为非正态分布，则ε°RC需要进行Log转化，即使用公式(2)进行计算，a、b、c为拟合常数；
酰基肉碱的拟合公式根据其化合物结构不同分为非羟基取代、单羟基取代和二羧基/二羧基-羟基取代三类，非羟基取代酰基肉碱的拟合方程见公式(3)；单羟基取代酰基肉碱的方程见公式(4)；二羧基/二羧基-羟基取代酰基肉碱的方程见公式(5)；
Figure FDA0003739575090000011
②酰基肉碱在洗脱时间中有机溶剂的相对累积洗脱强度(ε°RC)的公式为：
Figure FDA0003739575090000021
其中，ε°i代表了不同有机溶剂在C18色谱柱的反相色谱体系中的洗脱强度，方法中乙腈的洗脱强度为3.1，异丙醇的洗脱强度为8.3，υ(t)i代表了该有机溶剂在酰基肉碱的洗脱时间中消耗的总体积，ε°ref代表了参考物质的累积洗脱强度；
③通过相对累积洗脱强度与酰基肉碱保留时间的关系计算酰基肉碱的保留时间，公式为：
Figure FDA0003739575090000022
其中，A、B、C三个常量的值对应的ε°RC值范围为：
Figure FDA0003739575090000023
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中酰基肉碱初步定性的条件为：
(1)一级质谱特征离子的质量偏差相对预测值小于5ppm；
(2)特征二级质谱碎片必须含有m/z 85.0284，m/z 60.0808两个特征离子，且离子的质量偏差小于5ppm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中酰基肉碱假阳性的鉴定排除条件为：所述保留时间的预测值与真实值的相对偏差小于20％，且绝对偏差小于1.0min，即认定为酰基肉碱为阳性结果，否则认为是假阳性结果。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中超高效液相色谱-高分辨质谱的条件为：
(1)液相色谱条件：Waters Acquity CSH C18色谱柱2.1×100mm，1.7μm；柱温为55℃；流动相：A相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比6:4的乙腈/水混合液，B相为含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的体积比9:1的异丙醇/乙腈混合液；流量设置为0.4mL/min；洗脱梯度为：0-2.0min，40％-43％B；2.0-2.1min，43％-50％B；2.1-12.0min，50％-54％B；12.0-12.1min，54％-70％B；12.1-18.0min，70％-99％B；18.0-18.1min 99％-40％B；18.1-20.0min，40％B；
(2)质谱条件：ESI源，正离子模式，喷雾电压：3300V；鞘气，辅助气，吹扫气分别为40、10、1；接口温度、辅助气温度分别为300、350℃；碰撞能量为30eV，40eV，50eV。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中生物样本包括人体或动物的尿液、血液、组织和细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中亲水组分和疏水组分的浓缩条件为45℃，3000rpm和0.1psi。
7.权利要求1所述的方法在用于检测或筛查代谢异常相关的酰化肉碱生物标记物中的应用。
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