CN114062531A - 一种类风湿关节炎早期滑膜液诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种类风湿关节炎滑膜液早期诊断试剂盒及其应用,该诊断试剂盒包括用于检测标志物池中物质的试剂,所述标志物池包括以下物质:N‑α‑乙酰‑L‑精氨酸、苯丙氨酸、8‑异前列腺素、肌苷、2',3'‑环胞嘧啶苷酸、次黄嘌呤和鸟嘌呤。本发明提供了一种滑膜液中新的代谢组的标志物池以及相应的诊断试剂盒,该试剂盒通过检测滑膜液中的代谢物,可用于早期类风湿关节炎的诊断,准确率高,可以尽可能早地发现类风湿关节炎,并进行分型,区分类风湿关节炎与骨关节炎,对疾病尽早干预治疗。
Description
技术领域
本发明属于生命科学或检验方法技术领域,涉及一种类风湿关节炎早期滑膜液诊断试剂盒及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
Rheumatoid arthritis(RA)是一种关节滑膜恶性病变为主要特征的慢性自身免疫性疾病,影响全球约1%的人。该病的高破坏性最终可导致进行性功能障碍,全身性并发症和过早死亡。然而,对RA发病机制的认识尚不充分,缺乏不同分期诊断工具,阻碍了有效管理。目前,临床上对于RA的检测通常通过检测患者外周血中的类风湿因子(RF-IgM)、抗环状瓜氨酸(CCP)抗体、类风湿性因子IgG及IgA等方式与临床症状结合,来判断是否患类风湿关节炎。类风湿关节炎与骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的临床症状相似,不易区分。因此,理解RA发病机制中起作用的复杂分子过程,以及寻找对其不同分期诊断和监测有用的新的特异性标志物十分重要。
关节是由关节软骨、关节囊和含有滑膜液(Synovial Fluid,SF)的关节腔三部分组成。SF是由滑膜细胞分泌到关节腔内的一种富含蛋白质的液体。由于它与关节软骨、骨头表面和内膜的滑膜细胞直接接触,所以SF预计可以反映在不同生理和病理生理条件下关节的生化状态。
组学技术作为有用的工具被广泛应用于分子分析、biomarker的识别以及各种疾病的病理生理过程的检查。然而,由于疾病的生化调节通常为多个层面复杂的调节,单一组学研究数据的生物学解释较为困难。
发明内容
针对以上背景技术,发明人认为在疾病状态下,SF成分的变化反映了大关节结构内的病理生理事件,且SF是血液的超滤液,对维持关节内环境稳定至关重要,因此本发明的发明人将SF作为关节疾病候选标志物的来源。
本发明中,运用代谢组学,全面分析关节腔环境的变化了解RA的发展。按照美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿联盟(EULAR)提出的2010年分类标准分为RAI、RAII和RAIII,结合RA临床表型分析出必要识别的RA新标志物池。研究结果有助于对RA发病机制的全面认识。
鉴于上述理由,本发明的发明人发明了以新的滑膜液标志物池作为类风湿关节炎早期诊断试剂盒以及相关的应用。
具体的,本发明采用以下技术方案:
在本发明的第一个方面,提供一种如下述物质作为标志物池在制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂或早期诊断试剂盒的应用,其特征是,所述标志物池包括以下物质:N-α-乙酰-L-精氨酸(N-alpha-Acetyl-L-arginine)、苯丙氨酸(Phenylalanylphenylalanine)、8-异前列腺素(8-Isoprostane)、肌苷(Inosine)、2',3'-环胞嘧啶苷酸(2',3'-CyclicCMP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)和鸟嘌呤(Guanine)。
上述标志物池的组成成分具体作用如下:N-alpha-Acetyl-L-arginine用于区分RA与OA,即OA患者的SF中高表达,而RA患者的SF中则不显著;Phenylalanylphenylalanine与8-Isoprostane为RAI型患者SF标志物;Inosine、2',3'-CyclicCMP和Hypoxanthine为RAII型患者SF标志物;Guanine为RAIII型患者SF标志物。
在本发明的第二个方面,提供一种用于类风湿关节炎的早期诊断试剂盒,该诊断试剂盒包括用于检测滑膜液中标志物池中物质的试剂,所述标志物池包括以下物质:N-alpha-Acetyl-L-arginine、Phenylalanylphenylalanine、8-Isoprostane、Inosine、2',3'-CyclicCMP、Hypoxanthine和Guanine。
在本发明的第三个方面,一种筛选或鉴定治疗早期类风湿关节炎试剂或药物的方法,该方法包括检测滑膜液中标志物池中物质含量水平变化的步骤,所述标志物池包括以下物质:N-alpha-Acetyl-L-arginine、Phenylalanylphenylalanine、8-Isoprostane、Inosine、2',3'-CyclicCMP、Hypoxanthine和Guanine。
进一步地,所述筛选或鉴定治疗早期类风湿关节炎试剂或药物的方法,包括以下步骤:
(1)检测类风湿关节炎试验对象滑膜液中的标志物池表达(或含量)水平;
(2)给药:给予类风湿关节炎试验对象候选试剂或候选药物;
(3)检测给药后的类风湿关节炎试验对象滑膜液中标志物池含量水平,比较两次检测标志物池中物质表达(或含量)水平的变化。
在本发明的第四个方面,提供一种筛选上述标志物池的分析方法,该方法包括以下步骤:
将OA患者滑膜液样本和RA患者滑膜液样本分别采用有机溶剂进行前处理,应用超高液相色谱-质谱方法实现对前处理后的样本中的化学成分的分离与测定,然后对获得的OA患者滑膜液样本和RA患者滑膜液样本的UHPLC-MS原始数据进行预处理,最后应用多元统计分析方法和单变量分析方法筛选出上述标志物池。
为了尽可能多的获取滑膜液样本的代谢物信息,优选地,前处理过程包括:分别抽取OA患者和RA患者关节腔内的滑膜液200μl,样本收到后,立即保存在-80℃低温冰箱中,直至实验检测。将样本冰水浴解冻,涡旋30s,取100μL样本于1.5mLEP管中;加400μL含有内标的提取液(甲醇乙腈体积比=1:1),涡旋30s,冰水浴超声10min;置于-40℃冰箱1h。将样品溶液在4℃,12000rpm离心10min。然后取100μL上清液至进样瓶中,待上机检测。
为了使滑膜液代谢物样本中的各个化合物都得到分离和鉴定,需要选择合适的色谱和质谱分析条件。本发明针对滑膜液样本化学成分的特点,探究了超高效液相色谱条件的试验条件,筛选出使分析样品各组分分离效果较好的超高效液相色谱条件。本发明使用EXIONLC System(SCIEX)超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为含0.1v/v%甲酸的水溶液,B相为乙腈。柱温箱温度为40℃,样品盘设为4℃,进样体积为2μL。
本发明使用装备IonDrive Turbo VESI离子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四极杆质谱仪,以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下:Curtain Gas=40psi,IonSpray Voltage=±4500V,Temperature=475℃,Ion Source Gas 1=30psi,IonSource Gas 2=30psi。
优选地,获得的UHPLC-MS原始数据由ProteoWizard转为mzXML文件,由R软件包XCMS(v3.2)进行分析。数据预处理包括峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正、峰积分等。
优选地,为保证代谢组学数据的重现性,排除了质控样品中的相对标准导数(RSDs)大于30%的峰。通过使用R软件包CAMERA对左边的峰进行注释,与库中的保留时间(RT)和质量与电荷的比率(m/z)指标进行比较。之后,我们得到了由峰强度、RT和m/z组成的数据,并进一步去除50%以上样品中缺失的峰(强度=0)。在用内标峰强度进行归一化后,进行了多变量和单变量分析。
优选地,所述多元统计分析方法为正交-偏最小二乘投影判别分析(OPLS-DA)方法。
优选地,所述单变量分析方法为Wilcoxon-Mann-Whitney检验方法。
进一步优选地,在OPLS-DA分析中设置VIP值大于1且单变量分析中P值小于0.05。
与本发明人知晓的相关技术相比,本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果:
本发明提供了一种滑膜液中新的代谢组的标志物池以及相应的诊断试剂盒,该试剂盒通过检测SF中的代谢物,可用于早期类风湿关节炎的诊断,准确率高,可以尽可能早地发现类风湿关节炎,并进行分型,区分类风湿关节炎与骨关节炎,对疾病尽早干预治疗。本发明通过代谢组学进行多组学数据综合分析,有助于识别潜在的生物学关系,并提高对整个生物学机制的理解。
附图说明
构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1A和图1B提取离子色谱图示例;标准品溶液(图1A)及样品(图1B)提取离子色谱图。图中各色谱峰依次见图。
图2是本发明OA、RAI、RAII、RAIII组标志物的含量变化。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
筛选滑膜液标志物池的分析方法
受试者:RA患者、OA患者。
分别抽取受试者关节腔内的滑膜液200μl,样本收到后,立即保存在-80℃低温冰箱中,直至实验检测。将样本冰水浴解冻,涡旋30s,取100μL样本于1.5mLEP管中;加400μL含有内标的提取液(甲醇乙腈体积比=1:1),涡旋30s,冰水浴超声10min;置于-40℃冰箱1h。将样品溶液在4℃,12000rpm离心10min。然后取100μL上清液至进样瓶中,待上机检测。
本发明使用EXIONLC System(SCIEX)超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITYUPLC BEH Amide(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为含0.1v/v%甲酸的水溶液,B相为乙腈。柱温箱温度为40℃,样品盘设为4℃,进样体积为2μL。
本发明使用装备IonDrive Turbo V ESI离子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四极杆质谱仪,以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下:Curtain Gas=40psi,IonSpray Voltage=±4500V,Temperature=475℃,Ion Source Gas 1=30psi,IonSource Gas 2=30psi。
LC-MS代谢组学数据分析。获得的原始数据由ProteoWizard转为mzXML文件,由R软件包XCMS(v3.2)进行分析。数据预处理包括峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正、峰积分等。为保证代谢组学数据的重现性,排除了质控样品中的相对标准导数(RSDs)大于30%的峰。通过使用R软件包CAMERA对左边的峰进行注释,与库中的保留时间(RT)和质量与电荷的比率(m/z)指标进行比较。之后,我们得到了由峰强度、RT和m/z组成的数据,并进一步去除50%以上样品中缺失的峰(强度=0)。在用内标峰强度进行归一化后,进行了多变量和单变量分析。多变量统计分析,如PCA和OPLS-DA,是由SIMCA软件(Umetrics,瑞典)进行的。同时,应用单变量分析(Wilcoxon-Mann-Whitney检验)来确定不同的代谢物。在OPLS-DA分析中VIP值大于1且单变量分析中P值小于0.05的代谢物被确定为明显改变的代谢物,即为标志物池,包括以下物质:N-alpha-Acetyl-L-arginine、Phenylalanylphenylalanine、8-Isoprostane、Inosine、2',3'-Cyclic CMP、Hypoxanthine和Guanine。
实施例2
本发明的试剂盒应用方法为:
分别抽取受试者关节腔内的滑膜液200μl,样本收到后,立即保存在-80℃低温冰箱中,直至实验检测。将样本冰水浴解冻,涡旋30s,取100μL样本于1.5mLEP管中;加400μL含有内标的提取液(甲醇乙腈体积比=1:1),涡旋30s,冰水浴超声10min;置于-40℃冰箱1h。将样品溶液在4℃,12000rpm离心10min。然后取100μL上清液至进样瓶中,待上机检测。
准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中,分别配制成10mmol/L的标准品储备液。取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中,配制成混合标准溶液。依次稀释该标准溶液得到一系列校准溶液,标准品信息如表1所示。
表1标准品信息
本发明使用EXIONLC System(SCIEX)超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITYUPLC BEH Amide(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为含0.1v/v%甲酸的水溶液,B相为乙腈。柱温箱温度为40℃,样品盘设为4℃,进样体积为2μL。
本发明使用装备IonDrive Turbo V ESI离子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四极杆质谱仪,以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下:Curtain Gas=40psi,IonSpray Voltage=±4500V,Temperature=475℃,Ion Source Gas 1=30psi,IonSource Gas 2=30psi。
进行UHPLC-MS/MS分析之前,将目标化合物标准溶液引入质谱中。针对每个目标化合物,对其MRM参数进行优化,具体参数见表2。
表2 MRM参数
编号 | 化合物 | 英文名 | Prec Ion | Prod Ion | Polarity |
1 | N-乙酰基-L-精氨酸 | N-alpha-Acetyl-L-arginine | 215 | 173 | Negative |
2 | 胞苷2′:3′-环一磷酸单钠盐 | Cytidine 2',3'-cyclic phosphate | 304 | 110 | Negative |
3 | 烟酰胺 | Niacinamide | 123 | 80 | Positive |
4 | 肌苷 | Inosine | 267 | 135 | Negative |
5 | 次黄嘌呤 | Hypoxanthine | 135 | 92 | Negative |
6 | 苯丙氨酸-苯丙氨酸 | Phenylalanylphenylalanine | 313 | 120 | Positive |
7 | 腺苷 | Adenosine | 268 | 136 | Positive |
8 | 鸟嘌呤 | Guanine | 150 | 107 | Negative |
采用前文所描述的方法对校准溶液进行UPLC-MRM-MS/MS分析。校准后,将校准溶液依次稀释2倍后进行UHPLC-MRM-MS分析,通过其信噪比来计算方法的检出限和定量限。方法最低检出限(LLOD)定义为信噪比为3时所对应的化合物浓度,方法最低定量限(LLOQ)定义为信噪比为10时所对应的化合物浓度(US FDA guideline for bioanalytical methodvalidation)。
方法的精密度通过QC样品重复进样的标准相对偏差(RSD)来评估。准确度通过QC样品的加标回收率(Recovery)来评估,测得浓度与加标浓度的百分比值即为加标回收率。
标准品溶液及样品提取离子色谱图(EICs)如图1A和图1B所示,从中可以看出:一、本发明所采用分析方法,大部分目标化合物均呈现出对称的色谱峰;二、很好地实现了各个目标化合物的色谱分离;三、目标化合物在生物样品与标准品溶液中的保留时间及色谱峰形均无明显差异。
目标化合物的定量参数见表3,其最低检出限(LLODs)在0.02-9.77nmol/L之间,最低定量限(LLOQs)在0.03-19.53nmol/L之间,回归系数均在0.9947以上(详细校准曲线见表3)。
表3目标化合物的定量参数
QC样品的回收率(recovery)及标准相对偏差(RSD)见表4,QC样品重复进样次数为30次。如表中所示,所有目标化合物的平均回收率在96.8%-110.2%之间,标准相对偏差均小于10.8%。
表4 QC样品的回收率(recovery)及标准相对偏差(RSD)
以上数据表明,本方法能够在以上所示的浓度范围内,准确可靠地检测出样品中的目标代谢物含量。进而分析得到标志物池指标。
实施例3
本发明的发明人从风湿免疫科和骨科收集了175例RA患者关节腔滑膜液样本进行检测分析,同时收集了64例OA患者关节腔滑膜液样本为对照组。依照试剂盒具体实施方法,结果如图2所示:其中N-alpha-Acetyl-L-arginine在OA患者SF中表达水平明显高于RA患者,因此N-alpha-Acetyl-L-arginine用于区分RA与OA,即OA患者的SF中高表达,而RA患者的SF中表达不显著;Phenylalanylphenylalanine,8-Isoprostane则在RAI型患者SF中高表达,在其余患者SF中含量较低,因此将Phenylalanylphenylalanine与8-Isoprostane作为RAI型患者SF标志物;Inosine,2',3'-Cyclic CMP,Hypoxanthine在RAII型患者SF中高表达,在其余患者SF中含量较低,因此Inosine,2',3'-Cyclic CMP,Hypoxanthine为RAII型患者SF标志物;Guanine在RAIII型患者SF中高表达,在其余患者SF中含量较低,因此Guanine为RAIII型患者SF标志物。说明滑膜液中的上述物质与类风湿关节炎相关。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种如下述物质作为标志物池在制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂或早期诊断试剂盒的应用,其特征是,所述标志物池包括以下物质:所述标志物池包括以下物质:N-α-乙酰-L-精氨酸(N-alpha-Acetyl-L-arginine)、苯丙氨酸(Phenylalanylphenylalanine)、8-异前列腺素(8-Isoprostane)、肌苷(Inosine)、2',3'-环胞嘧啶苷酸(2',3'-Cyclic CMP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)和鸟嘌呤(Guanine)。
2.如权利要求1所述的应用,其特征是,N-alpha-Acetyl-L-arginine用于区分RA与OA,即OA患者的SF中高表达,而RA患者的SF中则不显著;Phenylalanylphenylalanine与8-Isoprostane为RAI型患者SF标志物;Inosine、2',3'-Cyclic CMP和Hypoxanthine为RAII型患者SF标志物;Guanine为RAIII型患者SF标志物。
3.一种用于类风湿关节炎的早期诊断试剂盒,其特征是,该诊断试剂盒包括用于检测滑膜液中权利要求1所述的标志物池中物质的试剂。
4.一种筛选或鉴定治疗早期类风湿关节炎试剂或药物的方法,其特征是,该方法包括检测滑膜液中权利要求1所述的标志物池中物质含量水平变化的步骤。
5.如权利要求4所述的方法,其特征是,所述筛选或鉴定治疗早期类风湿关节炎试剂或药物的方法,包括以下步骤:
(1)检测类风湿关节炎试验对象滑膜液中的标志物池表达或含量水平;
(2)给药:给予类风湿关节炎试验对象候选试剂或候选药物;
(3)检测给药后的类风湿关节炎试验对象滑膜液中标志物池表达或含量水平,比较两次检测标志物池中物质表达或含量水平的变化。
6.一种筛选权利要求1所述标志物池的分析方法,其特征是,该方法包括以下步骤:
将OA患者滑膜液样本和RA患者滑膜液样本分别采用有机溶剂进行前处理,应用超高液相色谱-质谱方法实现对前处理后的样本中的化学成分的分离与测定,然后对获得的OA患者滑膜液样本和RA患者滑膜液样本的UHPLC-MS原始数据进行预处理,最后应用多元统计分析方法和单变量分析方法筛选出所述标志物池。
7.如权利要求6所述的分析方法,其特征是,前处理过程包括:分别抽取OA患者和RA患者关节腔内的滑膜液200μl,样本收到后,立即保存在-80℃低温冰箱中,直至实验检测;将样本冰水浴解冻,涡旋30s,取100μL样本于1.5mL EP管中;加400μL含有内标的提取液(甲醇和乙腈体积比=1:1),涡旋30s,冰水浴超声10min;置于-40℃冰箱1h;将样品溶液在4℃,12000rpm离心10min;然后取100μL上清液至进样瓶中,待上机检测。
8.如权利要求6所述的分析方法,其特征是,超高效液相色谱条件为:使用EXIONLCSystem(SCIEX)超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITY UPLC BEHAmide(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离;液相色谱A相为含0.1%甲酸的水溶液,B相为乙腈;柱温箱温度为40℃,样品盘设为4℃,进样体积为2μL。
9.如权利要求6所述的分析方法,其特征是,质谱条件为:本项目使用装备IonDriveTurboV ESI离子源的SCIEX 6500QTRAP+三重四极杆质谱仪,以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析;离子源参数如下:Curtain Gas=40psi,IonSpray Voltage=±4500V,Temperature=475℃,Ion Source Gas 1=30psi,Ion Source Gas 2=30psi。
10.如权利要求6所述的分析方法,其特征是,获得的UHPLC-MS原始数据由ProteoWizard转为mzXML文件,由R软件包XCMS(v3.2)进行分析;数据预处理包括峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正、峰积分;
优选地,排除了质控样品中的相对标准导数(RSDs)大于30%的峰;通过使用R软件包CAMERA对左边的峰进行注释,与库中的保留时间(RT)和质量与电荷的比率(m/z)指标进行比较;之后,获得由峰强度、RT和m/z组成的数据,并进一步去除50%以上样品中缺失的峰(强度=0);在用内标峰强度进行归一化后,进行了多变量和单变量分析;
优选地,所述多元统计分析方法为正交-偏最小二乘投影判别分析(OPLS-DA)方法;
优选地,所述单变量分析方法为Wilcoxon-Mann-Whitney检验方法;
进一步优选地,在OPLS-DA分析中设置VIP值大于1且单变量分析中P值小于0.05。
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CN202111184041.7A CN114062531A (zh) | 2021-10-11 | 2021-10-11 | 一种类风湿关节炎早期滑膜液诊断试剂盒及其应用 |
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CN202111184041.7A CN114062531A (zh) | 2021-10-11 | 2021-10-11 | 一种类风湿关节炎早期滑膜液诊断试剂盒及其应用 |
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Cited By (1)
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CN115097044A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-23 | 山西中医药大学 | 粪菌移植通过肠道菌群干预类风湿关节炎模型的构建方法 |
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中国科协学会学术部: "医院临床检验技术操作规范与实(化)验室管理全书", vol. 2, 中国科学技术出版社, pages: 110 - 113 * |
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