CN108414651A

CN108414651A - 衍生化多种有机酸测定试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN108414651A
Application number: CN201810133982.XA
Authority: CN
Inventors: 杨江涛; 赵明; 林珊珊; 戴子鹏; 孙智勇; 黄丽娟
Original assignee: Shenzhen Love Bay Medical Laboratory Laboratory
Current assignee: Shenzhen Love Bay Medical Laboratory Laboratory
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明涉及气质联用诊断试剂盒技术领域，公开一种衍生化多种有机酸测定试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括校正品、内标物质控品混标，肟化试剂，萃取液，衍生化试剂，空白试剂，酸碱pH试纸，干燥剂，玻璃内插管；通过采用试剂盒检测有机酸含量，不仅可以节约检测前配置检测有机酸所用试剂的时间，而且，避免了不同工作人员与不同条件下人为配置试剂的误差，并且采用试剂盒检测有机酸的结果满足回收率和准确率的要求。

Description

衍生化多种有机酸测定试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及气质联用诊断试剂盒技术领域，具体涉及一种衍生化多种有机酸测定试剂盒及其使用方法。

背景技术

遗传性代谢病(inborn error of metabolism，IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环等多种物质代谢的疾病。其单一病种患病率较低，但由于种类繁多，总体发病率较高。该类疾病通常表现为不明原因的反复呕吐、抽搐、肌张力低下、智力发育落后等。遗传性代谢病的诊断主要依赖实验室的特异性检查，GC-MS技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。

人体尿液中含有有机酸等内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些有机化合物在尿液中浓度通常高于其在血清和其他组织体液，另外尿标本最易于收集，为非侵入性操作性技术，为国内外研究者所认同。二十世纪我国对遗传代谢性疾病仅能进行初步检测，依赖欧日美等发达国家的检测技术且需将标本送至国外合作单位方可确诊；近十年来我国引进气相色谱—质谱联用(gaschromatography massspectrometry，GC-MS)尿有机酸检测方法开始逐步应用于有机酸类遗传代谢性疾病的筛查、监测和诊断。

目前，新生儿遗传代谢性疾病的筛查、监测和诊断主要采用两种方法，分别为：串联质谱法检测干血斑中多种氨基酸、肉碱和各实验室自配试剂进行气相色谱质谱检测尿滤纸中有机酸；其中串联质谱法检测主要针对于氨基酸、酰基肉碱相关的疾病特异性较强，准确率高，但针对于有机酸相关的遗传代谢病特异性不高，易出现误诊、漏诊的可能。各实验室自配试剂进行气相色谱质谱检测有机酸因各医院、实验室配制条件参差不齐，且存在人为配制试剂的误差，没有统一的质控品检测线，从而无法保证实验结果的准确性。气相色谱质谱尿液有机酸检测所需的十余种试剂，配制复杂费时，且易造成试剂浪费，污染环境。另外，该传统的气相色谱质谱尿液有机酸检测实验前处理过程需要4-5个小时，耗时太长，不利于遗传代谢病疑似阳性患儿的及时治疗。

实现本发明实施例的过程中，发明人发现相关技术中至少存在如下问题：

检测有机酸所用的试剂配制复杂、费时，而且配制时存在一定的人为配置误差，影响测试结果的准确性。

发明内容

本发明实施例提供一种衍生化多种有机酸测定试剂盒及其使用方法，解决了检测有机酸时所用的试剂配置复杂、费时，使得测试结果误差较小，测试结果满足回收率和准确率的要求。

为了解决上述技术问题，本发明实施例采用的一个技术方案是：

第一方面，本发明提供一种衍生化多种有机酸测定试剂盒，包括：校正品、内标物质控品混标，肟化试剂A，肟化试剂B，萃取液，衍生化试剂，空白试剂，酸碱pH试纸，干燥剂，玻璃内插管；所述校正品采用C9-C28的正构烷烃混合标准品稀释液，所述内标物质控品混标包括：纯乙酸乙酯，十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷，其中纯乙酸乙酯为稀释液，所述衍生化试剂包括N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷；所述N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为(90—99)：(1—10)。

优选地，述N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为99:1。

优选地，所述正构烷烃标准品浓度为8-12mg/L。

优选地，所述肟化试剂A为盐酸羟胺，所述盐酸羟胺的含量为4％-6％；所述盐酸羟胺用于参与肟化反应。

优选地，所述盐酸羟胺的含量为5％。

优选地，所述肟化试剂B为盐酸，所述盐酸含量为5-10N，所述盐酸用于调节肟化反应液的pH值。

优选地，所述盐酸含量为6N。

优选地，所述空白试剂为乙酸乙酯，所述乙酸乙酯用于清洗进样口残留的有机物。

优选地，所述干燥剂为无水氯化钙或氧化钙，所述干燥剂用于提供一个相对的干燥的环境。

第二方面，本发明提供一种以上所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(a)添加内标/质控品操作:将每个样本分别加入40ul内标品、质控品混合液；(b)肟化反应操作：根据样本尿肌酐浓度差异，分别用超纯水定容总体积到2ml，振荡30s充分混匀；加入1ml5％盐酸羟铵，塑料离心管盖盖密封，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，室温下(20-26℃)反应20分钟；加入550ul优级纯盐酸(6N)盐酸密封、避光保存，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，用广泛PH试纸检测，对比观察比色卡，呈玫红色，pH＝1-4；(c)萃取操作：每个样本加入3ml乙酸乙酯，振荡60s混匀，样本置于台式低速离心机中离心，设置离心转速为4000r/min，离心时间5min，将上清液转移至备用10mL离心管中；重复上述离心萃取操作一次。二次萃取提高有机酸提取率；(d)氮气吹干：在60℃条件下，氮吹大约30min；(e)硅烷化反应：从氮吹仪上取出样本，加入100ulBSTFA:TMCS(99:1)硅烷化试剂，在电热恒温培养箱中70℃反应30分钟；(f)转移上机：取出样本冷却至室温，转移样本至1.5ml进样瓶中的玻璃内插管中，放置自动进样器托盘，在自动进样器托盘1号位放入空白试剂进样瓶，2号位放入校正品，上机分析；其中，GC部分条件为：进样方式采用分流模式；分流比为10:1；进样口温度为280℃；升温程序为100℃保持4分钟，以4℃/分钟速率升至280℃，保持11分钟；流量控制方式采用恒线速度；MS部分条件为：离子源温度为200℃；接口温度为280℃；采样方式为Scan；间隔时间为0.50s；扫描速度为1000；开始m/z为50；结束m/z为500。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果为：通过提供一个有机酸检测所用的试剂盒，试剂盒内包括检测所有有机酸的试剂，不仅可以节约检测前配置检测有机酸所用试剂的时间，而且，避免了不同工作人员与不同条件下人为配置试剂的误差，同时，采用试剂盒检测有机酸的结果满足回收率和准确率的要求。

附图说明

图1为尿素酶含量为20μL时的总离子流色谱图；

图2为尿素酶含量为30μL时的总离子流色谱图；

图3为尿素酶含量为0μL时的总离子流色谱图；

图4为氢氧化钠含量为400μL时的总离子流色谱图；

图5为氢氧化钠含量为200μL时的总离子流色谱图；

图6为氢氧化钠含量为0μL时的总离子流色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的衍生化多种有机酸测定试剂盒包括：校正品、内标物质控品混标，肟化试剂，萃取液，衍生化试剂，空白试剂，酸碱pH试纸，干燥剂，玻璃内插管。

本发明中，衍生化多种有机酸测定试剂盒中所用的药品及仪器如表1所示。

表1检测有机酸所用药品及仪器

药品及仪器名称	级别	产地
			十七烷酸	>98％	Sigma-Aldrich
二十四烷	99％	Sigma-Aldrich
			托品酸	98％	Sigma-Aldrich
盐酸羟胺	98％	西亚试剂
			浓盐酸	ACS reagent,37％	Sigma-Aldrich
丙酮	HPLC级	CNW
			乙酸乙酯	HPLC级	CNW
无水氯化钙	96％	Sigma-Aldrich
			衍生化试剂	BSTFA-TMCS(99:1)	Sigma-Aldrich
C₇-C₄₀正构烷烃混标	1000mg/L于己烷	CNW
			pH试纸	pH1-10	MERCK
气相色谱质谱联用仪	GC-MS-QP2010	SHIMADZU
			自动进样器	GC-2010	SHIMADZU

其中，校正品采用C9-C28的正构烷烃混合标准品稀释液，正构烷烃标准品用于定性校正，正构烷烃标准品的浓度为8-12mg/L，本实施例中优选10mg/L。

通过正己烷稀释正构烷烃标准品至浓度10mg/L，根据正构烷烃混标的保留指数和保留时间校正90种有机酸的保留时间，再利用有机酸谱库对样本中有机酸进行双重定性，确保检测的准确性。

上述内标物质控品混标包括：纯乙酸乙酯，十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷，其中纯乙酸乙酯为稀释液。

上述十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷的结构相对比较稳定并且不会与目标有机酸发生反应，而且十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷的出峰时间分布在目标有机酸的前期、中期和后期，比较容易区分，其中，2-苯基-3-羟基丙酸及二十四烷作为质控品可更为准确的检测实验过程与仪器状态是否合格。

通过稀释液乙酸乙酯将十七烷酸、2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷稀释至浓度分别为0.5mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml的混合标准液，其中，2-苯基-3-羟基丙酸也称托品酸。

肟化试剂A采用盐酸羟胺，将盐酸羟胺与超纯水混合配置而成，盐酸羟胺的含量为4％-6％，本实施例中优选盐酸羟胺的含量为5％，盐酸羟胺用于发生肟化反应。

肟化试剂A可用于大幅度缩短肟化反应时间，本实施例中肟化反应时间可由60分钟缩短至20分钟。

肟化试剂B采用盐酸，将浓盐酸与超纯水混合配制而成，其中，盐酸含量为5N-10N，优选盐酸含量为6N，盐酸用于调节反应过程中的pH值，起到中和的作用，可以理解的是，盐酸用于终止肟化反应，当肟化反应液的pH值为1-4时，肟化反应终止，优选pH值为3时，肟化反应终止。

肟化反应为含有羰基的化合物(如醛、酮类)与羟胺作用而生成含有C＝NOH基的化合物的反应，本实施例中肟化试剂A用于进行肟化反应，提高反应速率，降低反应所用的时间。肟化试剂B起到中和的作用，用于终止肟化反应。

本实施例中萃取液由HPLC级乙酸乙酯纯溶液配置而成。乙酸乙酯用于萃取有机酸，乙酸乙酯毒性小，沸点低，便于萃取后将乙酸乙酯与有机酸分离。

衍生化试剂主要作用是把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。

本实施例中衍生化试剂采用N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(BSTFA)与三甲基氯硅烷(TMCS)；三甲基氯硅烷可以衍生酰胺以及仅由BSTFA衍生的仲胺和受阻羟基，因此，TMCS的加入有助于增加BSTFA的反应性，提高有机酸检测的精确度。

此外，BSTFA和TMCS混合可作为很好的溶剂，具有良好的溶解性能，可作为甲硅烷基化试剂而无需额外的溶剂，可溶于最常用的甲硅烷基溶剂。

其中，N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为(90—99)：(1—10)，此时，BSTFA的反应性最好；优选N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为99:1。

上述三甲基氯硅烷的加入量为1-20％，有助于提高BSTFA的反应性。

pH试纸用于肟化反应终止反应定性样本酸碱度，当pH值在1-4之间时，肟化反应终止，优选pH值为3时，肟化反应终止。

空白试剂由丙酮纯溶液配制而成，由于丙酮试剂易与有机物发生取代反应，有助于清除进样口及色谱柱中的有机物残留，保证各样本之间无交叉污染，提高检测结果准确性与稳定性。

干燥剂用于营造一个相对的干燥的环境，避免衍生化试剂开盖使用后保存不善，遇水分解，影响实验结果的准确性。本实施例中干燥剂采用：无水氯化钙、氧化钙或硫酸镁中的一种或几种，本发明实施例优选无水氯化钙。

玻璃内插管用于检测时向仪器内进样，其中，玻璃内插管为200μl，解决了100μl样本液面过低的问题，同时更换一次性内插管也大大节约了更换进样瓶的经济成本，或者避免了清洗进样瓶的复杂操作。

本发明提供的使用上述试剂盒检测衍生化多种有机酸的使用方法包括以下步骤：

①添加内标/质控品操作

②肟化反应操作

③萃取操作

④氮气吹干

⑤硅烷化反应

⑥转移上机

首先，将每个样本分别加入40ul内标品、质控品混合液，其次，根据样本尿肌酐浓度差异，分别用超纯水定容总体积到2ml，振荡30s充分混匀。

然后，将上述样本液转移至塑料离心管中，加入1ml 5％的盐酸羟胺，用塑料离心管盖密封，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，室温下(20-26℃)反应20分钟。

继续加入550ul优级纯盐酸(6N)密封、避光保存，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，用pH试纸检测，对比观察比色卡，呈玫红色，pH＝3，则肟化反应终止。

将上述样本中分别加入3ml乙酸乙酯，振荡60s混匀，样本置于台式低速离心机中离心，设置离心转速为4000r/min，离心时间为5min。将上清液转移至备用10mL离心管中。

重复上述离心萃取操作一次，因为二次萃取能够提高有机酸的提取率。

在60℃条件下，氮吹大约30min，通过氮吹浓缩上述有机酸萃取液，去除萃取时的乙酸乙酯基质，只留下需要的有机酸成分，使测试结果更加精准。

从氮吹仪上取出样本，加入100ul BSTFA:TMCS(99:1)硅烷化试剂，在电热恒温培养箱中70℃反应30分钟。

取出样本冷却至室温，转移样本至1.5ml进样瓶中的玻璃内插管中，放置自动进样器托盘，在自动进样器托盘1号位放入空白试剂进样瓶，2号位放入校正品，上机分析。

本发明中仪器分析的条件如下：

1.GC部分条件

采用GC分析时所采用的进样方式为分流模式，测试过程中的分流比为10:1，进样口的温度设置为280℃，升温程序先将温度升温至100℃，然后保持4分钟，4分钟后以每分钟4℃的速率升至280℃，在该温度下保持11分钟；其中，采用的流量控制方式为恒线速度法进行控制。

2.MS部分条件

采用MS分析时所用离子源温度为200℃，接口温度设置为280℃，采样方式为Scan，每间隔0.5s扫描一次，扫描速度为1000，开始测试时m/z为50；结束时m/z为500。

本发明实施例检测所用的试剂配制过程如下：

尿素酶：加入13.5mL超纯水；(冷冻保存-20℃)。

内标配制：十七烷酸(0.5mg/ml)、二十四烷(0.5mg/ml)和托品酸(1mg/ml)的乙酸乙酯混合液：分别称取25.0mg十七烷酸，25.0mg二十四烷和50.0mg托品酸，用乙酸乙酯定容到50ml，混匀(冷藏保存)。

盐酸羟铵(5％)：称取盐酸羟铵5g加入到100ml超纯水中，混匀。

5N氢氧化钠(20％NaOH)：称取取氢氧化钠20g加入到100ml水中，混匀。

正构烷烃：(10mg/L)用HPLC级正己烷将标样从1000mg/L稀释到10mg/L，即稀释100倍(冷藏保存)。

本发明衍生化多种有机酸测定试剂盒(气质联用法)90种疾病特征有机酸如表2所示。

表2衍生化多种有机酸名称

实施例1、肟化反应时间的确定

本实施例用来说明本发明的串联质谱衍生化多种有机酸检测用试剂盒及其使用方法。

按照如下方法分别使用试剂盒和传统测试有机酸的方法测试有机酸的含量。

尿液样本处理过程如下：

1.测定尿肌酐含量，取含有0.2mg肌酐的尿样备用。

(生化仪肌酐浓度换算：mg/ml＝umol/L X 113.1X 10^-6)

2.加入40ul内标

3.用超纯水定容到2ml

4.加入1ml 5％盐酸羟胺，室温反应60min。

5.加入550ul优级纯盐酸，充分振荡后，用广泛pH试纸检测，显示酸性。

6.用3ml乙酸乙酯萃取，充分混匀后，4000转离心5min，转移到一干洁离心管。

7.重复上步萃取离心操作一次，转移到同一干洁离心管。

8.在60℃条件下，氮吹至干。

9.加入100ul BSTFA:TMCS(99:1)，在70℃反应30分钟后，转移上机。

采用上述上机所用测试条件进行测试。

其中，传统测试有机酸的方法中肟化反应的时间为60min，现采用试剂盒内所配好的试剂对尿液样本进行测试。

取同一尿液样本，分别采用60min、50min、40min、30min、20min肟化反应时间进行实验，实验结果如表3所示。

表3肟化反应时间确定结果

由表1可知，肟化反应时间为60min得到的90种有机酸数据结果与肟化反应时间为20min、30min、40min和50min的实验结果近乎相同，且回收率和准确率均满足要求，因此，确定优化肟化反应的时间为20min。

通过采用试剂盒测试尿液样品中的有机酸含量，不仅节省检测所用试剂的配制时间，而且缩短了肟化反应时间，节省了检测所用时间，同时，采用试剂盒检测的有机酸的结果符合回收率和准确率的要求。

实施例2、尿素酶反应的优化实验

本实施例用来说明本发明的串联质谱衍生化多种有机酸检测用试剂盒及其应用。

尿液样本处理过程如下：

1.测定尿肌酐含量，取含有0.2mg肌酐的尿样备用。

(生化仪肌酐浓度换算：mg/ml＝umol/L X 113.1X 10^-6)

2.加入0ul尿素酶并且混匀，置于恒温培养箱中37℃反应30分钟。

3.加入40ul内标。

4.用超纯水定容到2ml。

5.加入1ml 5％盐酸羟胺，室温反应60min。

6.加入550ul优级纯盐酸，充分振荡后，用广泛pH试纸检测，显示酸性。

7.用3ml乙酸乙酯萃取，充分混匀后，4000转离心5min，转移到一干洁离心管。

8.重复上步萃取离心操作一次，转移到同一干洁离心管。

9.在60℃条件下，氮吹至干。

10加入100ulBSTFA:TMCS(99:1)，在70℃反应30分钟后，转移上机。

采用上述上机所用测试条件进行测试。

传统测试有机酸的方法中通常加入尿素酶，传统尿素酶的含量为20μl，而本发明实施例提供的试剂盒内不包含尿素酶，现在取同一尿液样本，分别提供20μl尿素酶、30μl尿素酶和0μl尿素酶添加实验，进行实验数据对比，测试结果如表4所示。

表4尿素酶反应的优化实验结果

由表4，图1，图2和图3可知，没有添加尿素酶的实验方案也可得到理想的实验结果，得到90种有机酸数据结果与传统方法添加尿素酶实验结果近乎相同，回收率和准确率均满足要求，在基于海量GC-MS检测数据的国内新生儿有机酸参考范围内，可以有效筛查与疾病相关的90种特征有机酸指标。

通过采用试剂盒测试尿液样品中的有机酸含量，去除尿酶素，可以节省尿酶素反应的时间，从而节省了检测所用时间，同时，采用试剂盒检测的有机酸的结果符合回收率和准确率的要求。

实施例3、氢氧化钠优化实验

尿液样本处理过程如下：

1.测定尿肌酐含量，取含有0.2mg肌酐的尿样备用。

(生化仪肌酐浓度换算：mg/ml＝umol/L×113.1X 10^-6)

2.加入40ul内标。

3.用超纯水定容到2ml。

4.加入1ml 5％盐酸羟胺和0ul NaOH，室温反应60min。

7.重复上步萃取离心操作一次，转移到同一干洁离心管。

8.在60℃条件下，氮吹至干。

9.加入100ulBSTFA:TMCS(99:1)，在70℃反应30分钟后，转移上机。

采用上述上机所用测试条件进行测试。

传统测试有机酸的方法中通常加入氢氧化钠，传统氢氧化钠的含量为200μl，而本发明实施例提供的试剂盒内不包含氢氧化钠，现在取同一尿液样本，分别提供200μl氢氧化钠、400μl氢氧化钠和0μl氢氧化钠添加实验，进行实验数据对比，测试结果如表5所示。

表5氢氧化钠优化实验结果

由表5，图4，图5和图6可知，优化去除添加氢氧化钠的实验方案，可得到理想的实验结果，得到90种有机酸数据结果与传统方法添加氢氧化钠实验结果近乎相同，回收率和准确率均满足要求，在基于海量GC-MS检测数据的有机酸参考范围内，可以有效筛查与疾病相关的90种特征有机酸指标。

通过采用试剂盒测试尿液样品中的有机酸含量，去除氢氧化钠，可以缩短肟化反应的时间，从而节省了检测所用时间，同时，采用试剂盒检测的有机酸的结果符合回收率和准确率的要求。

有益效果：通过提供一个有机酸检测所用的试剂盒，试剂盒内包括检测所有有机酸的试剂，不仅可以节约检测前配置检测有机酸所用试剂的时间，而且，避免了不同工作人员与不同条件下人为配置试剂的误差，同时，采用试剂盒检测有机酸的测试结果满足回收率和准确率的要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种衍生化多种有机酸测定试剂盒，其特征在于，包括：校正品、内标物质控品混标，肟化试剂A，肟化试剂B，萃取液，衍生化试剂，空白试剂，酸碱pH试纸，干燥剂，玻璃内插管；

所述校正品采用C9-C28的正构烷烃混合标准品稀释液，

所述内标物质控品混标包括：纯乙酸乙酯，十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷，其中纯乙酸乙酯为稀释液，

所述衍生化试剂包括N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷；

所述N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为(90—99)：(1—10)。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的体积比为99:1。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述正构烷烃标准品浓度为8-12mg/L。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肟化试剂A为盐酸羟胺，所述盐酸羟胺的含量为4％-6％；所述盐酸羟胺用于参与肟化反应。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述盐酸羟胺的含量为5％。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肟化试剂B为盐酸，所述盐酸含量为5-10N，所述盐酸用于调节肟化反应液的pH值。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述盐酸含量为6N。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述空白试剂为乙酸乙酯，所述乙酸乙酯用于清洗进样口残留的有机物。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述干燥剂为无水氯化钙或氧化钙，所述干燥剂用于提供一个相对的干燥的环境。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)添加内标/质控品操作:将每个样本分别加入40ul内标品、质控品混合液；

(b)肟化反应操作：根据样本尿肌酐浓度差异，分别用超纯水定容总体积到2ml，振荡30s充分混匀；

加入1ml 5％盐酸羟铵，塑料离心管盖密封，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，室温下(20-26℃)反应20分钟；

加入550ul盐酸(6N)密封、避光保存，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，用广泛pH试纸检测，对比观察比色卡，呈玫红色，pH＝1-4；

(c)萃取操作：每个样本加入3ml乙酸乙酯，振荡60s混匀，样本置于台式低速离心机中离心，设置离心转速为4000r/min，离心时间5min，将上清液转移至备用10mL离心管中；

重复上述离心萃取操作一次；

(d)氮气吹干：在60℃条件下，氮吹30min；

(e)硅烷化反应：从氮吹仪上取出样本，加入100ul BSTFA:TMCS(99:1)硅烷化试剂，在电热恒温培养箱中70℃反应30分钟；

(f)转移上机：取出样本冷却至室温，转移样本至1.5ml进样瓶中的玻璃内插管中，放置自动进样器托盘，在自动进样器托盘1号位放入空白试剂进样瓶，2号位放入校正品，上机分析；

其中，GC部分条件为：进样方式采用分流模式；分流比为10:1；进样口温度为280℃；升温程序为100℃保持4分钟，以4℃/分钟速率升至280℃，保持11分钟；流量控制方式采用恒线速度；

MS部分条件为：离子源温度为200℃；接口温度为280℃；采样方式为Scan；间隔时间为0.50s；扫描速度为1000；开始m/z为50；结束m/z为500。