CN117214314B - 一种有机酸含量检测盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种有机酸含量检测盒及检测方法，该机酸含量检测方法，包括以下步骤：向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液；向混合液中加入3‑8mol/L苛性钠，调节PH为7.2‑7.5，然后加入3‑5mg/mL盐酸羟胺，进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；向反应溶液中加入盐酸终止肟化酰基化反应加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液；向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量。该方法利用肟化酰基化反应和衍生化反应将目标有机酸转化为稳定的化合物，通过萃取和质谱分析技术实现对有机酸含量的准确测定。该方法具有选择性、灵敏度高和准确性强的特点，并可用于有机酸含量的定量分析。

Description

一种有机酸含量检测盒及检测方法

技术领域

本申请涉及有机酸检测领域，具体而言，涉及一种检测方法。

背景技术

遗传性代谢病(inborn error of metabolism，IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环等多种物质代谢的疾病。其单一病种患病率较低，但由于种类繁多，总体发病率较高。该类疾病通常表现为不明原因的反复呕吐、抽搐、肌张力低下、智力发育落后等。遗传性代谢病的诊断主要依赖实验室的特异性检查，GC-MS技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能；

人体尿液中含有有机酸等内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些有机化合物在尿液中浓度通常高于其在血清和其他组织体液，另外尿标本最易于收集，为非侵入性操作性技术，为国内外研究者所认同。二十世纪我国对遗传代谢性疾病仅能进行初步检测，依赖欧日美等发达国家的检测技术且需将标本送至国外合作单位方可确诊；近十年来我国引进气相色谱—质谱联用(gaschromatography massspectrometry，GC-MS)尿有机酸检测方法开始逐步应用于有机酸类遗传代谢性疾病的筛查、监测和诊断。但是上述方法的灵敏度和准确性较差，且配制时存在一定的人为配置误差，影响测试结果的准确性。

发明内容

本申请的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述。本申请的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围。

为了解决以上背景技术部分提到的技术问题，本申请一方面提供了一种有机酸含量检测方法，包括以下步骤：

向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液；

向很混合液中加入3-8mol/L苛性钠，调节PH为7.2-7.5，然后加入3-5mg/mL盐酸羟胺，进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量。

盐酸羟胺在碱性条件下先与有机酸反应形成肟化产物，然后盐酸羟胺中的胺基会与肟化产物中的氮原子发生酰化反应，形成酰化肟化产物(acylated oxime)。盐酸羟胺引入胺基到肟化产物中，形成酰化肟化产物。这样可以改变有机酸分子的化学性质，使其具有更好的稳定性和检测性能，以便在后续的分析过程中准确测定有机酸的含量。

将pH值调节在7.2-7.5的范围内。这种碱性条件有助于促进盐酸羟胺与有机酸中的羰基发生反应，形成肟化产物。

有机酸目标物包括5-羟吲哚乙酸、犬尿喹啉酸、2-甲基马尿酸、3,4-二羟基苯丙酸、黄尿酸、亚胺甲基谷氨酸、喹啉酸、吡啶甲酸、葡萄糖酸、苯丙酸、丙三羧酸、D-阿拉伯糖、柠苹酸、酒石酸、2,3-二羟基-2-甲基丁酸、4-羟基环己基乙酸、4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮、2-甲基丁基甘氨酸。

进一步地，内标溶液包含重量比例如下的组分：内标溶液包含重量比例如下的组分：3，4-二羟基肉桂酸35-45％；蜡酸15-25％；水杨酸35-40％。

3，4-二羟基肉桂酸被用作内标溶液的组分之一，

进一步地，内标溶液的浓度为0.6-1.2mg/mL。

进一步地，衍生化试剂包括N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，二者的重量比例为85～90∶10～15。

三甲基氯硅烷通常作为N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(简称为MSTFA)的催化剂使用，它可以加速酸性物质与MSTFA的反应速度，提高反应效率。三甲基氯硅烷具有碱性，可以中和反应体系中的酸性物质，从而促进酰化反应的进行。

盐酸通过调节pH和催化反应促进肟化酰基化反应的进行，而MSTFA和三甲基氯硅烷则在衍生化反应中发挥着酰化和催化的作用，使酸性物质形成易挥发的衍生化产物，以提高分析的灵敏度和准确性。这些反应和作用共同构成了有机酸含量检测方法中的关键步骤，并为后续质谱分析提供了适宜的样品处理。

进一步地，N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的重量比例为88～90∶10～12。

进一步地，向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应中，反应温度40-60℃，反应时间20-40min。

进一步地，萃取溶剂包括乙酸乙酯和乙醚。

进一步地，用质谱分析仪检测有机酸目标物含量步骤中，柱温箱起始温度60-70℃，以6-8℃/min升温至280-300℃，然后再以10-15℃/min升温至310-320℃。

本申请的另一方面提供了一种有机酸含量的检测盒，包括：

壳体，被构造为形成一个恒温腔；

旋转轴，转动设置于恒温腔的底部，通过底部设置的驱动件驱使旋转轴转动；

支撑盘，固设于旋转轴的侧壁，形成若干个用于放置试管的安装槽；

震动组件，设置于支撑盘内，用于驱使安装槽内的试管的震荡处理；

添加组件，设置于恒温腔的内定壁；用于添加内标品、质控品混合液或超纯水；

其中，震动组件包括转动设置于安装槽内的震动盘和设置于震动盘上用于安装试管的安装环；安装环可移动的设置于震动盘上，且采用弹性件连接；震动盘可转动的设置于安装槽内，以使震动盘旋转的过程中产生的离心力驱使安装环在震动盘内往复移动；

上述结构中，由于在震动盘上设置了安装环，震动盘是可以旋转的，而安装环可以在震动盘上移动，并且通过弹性件连接；因此在震荡的时候，首先支撑盘的旋转所产生的离心力能使试管内的混合液向远离旋转轴中心轴线的方向荡动；而震动盘的自转能使试管内的混合液产生旋转；此外，安装环在离心力的作用下使得往复移动，更加使得试管内的混合液产生震动；提高了对混合液的震动效果；本申请从多方向对混合液进行震荡，有效地提高了震荡效率，一方面混合液的震荡时间减少，另一方面能提高均匀性；进一步的能力提高检测效率。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

另外，贯穿附图中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素。应当理解附图是示意性的，元件和元素不一定按照比例绘制。

在附图中：

图1是本申请有机酸含量检测方法的流程示意图；

图2是根据本申请实施例的整体示意图；

图3是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了支撑组件和添加组件的安装结构；

图4是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了固定齿轮和固定齿环的安装结构；

图5是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了开口和密封门的结构；

图6是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了震动盘和安装环的安装结构；

图7是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了震动盘和安装环的半剖爆炸示意图；

图8是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了移动槽和限位槽的结构；

图9是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了定料腔和活塞件的安装结构；

图10是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了震动盘的结构；

图11是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了升降盘和添料盒的安装结构；

图12是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了升降盘结构；

图13是实施例的一部分的结构示意图，主要示出了弹性件结构。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的实施例。虽然附图中显示了本公开的某些实施例，然而应当理解的是，本公开可以通过各种形式来实现，而且不应该被解释为限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了更加透彻和完整地理解本公开。应当理解的是，本公开的附图及实施例仅用于示例性作用，并非用于限制本公开的保护范围。

另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要注意，本公开中提及的“第一”、“第二”等概念仅用于对不同的装置、模块或单元进行区分，并非用于限定这些装置、模块或单元所执行的功能的顺序或者相互依存关系。

需要注意，本公开中提及的“一个”、“多个”的修饰是示意性而非限制性的，本领域技术人员应当理解，除非在上下文另有明确指出，否则应该理解为“一个或多个”。

本申请提供了一种有机酸含量检测方法，包括以下步骤：

向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液；

向很混合液中加入3-8mol/L苛性钠，调节PH为7.2-7.5，然后加入3-5mg/mL盐酸羟胺，进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量。

有机酸目标物包括5-羟吲哚乙酸、犬尿喹啉酸、2-甲基马尿酸、3，4-二羟基苯丙酸、黄尿酸、亚胺甲基谷氨酸、喹啉酸、吡啶甲酸、葡萄糖酸、苯丙酸、丙三羧酸、D-阿拉伯糖、柠苹酸、酒石酸、2，3-二羟基-2-甲基丁酸、4-羟基环己基乙酸、4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮、2-甲基丁基甘氨酸。

下面详细描述下有机酸目标物。

中文名称：2，3-二羟基-2-甲基丁酸

英文名称：2，3-dihydroxy-2-methylbutyric acid

分子量：134

衍生化后分子式：C₁₄H₃₄O₄Si₃

衍生化后分子量：350

特征离子对：306，117

保留时间：20.675min

相关疾病：

线粒体短链烯酰CoA水合酶1缺乏症

英文名称：Short-Chain Enoyl-Coa Hydratase 1 Deficiency

简称：ECHS1D；SCEH

遗传方式：常染色体隐性遗传

疾病类型：单基因，基因位置：10q26.3

疾病简介：线粒体短链烯酰辅酶A水合酶1缺乏症是一种严重的常染色体隐性遗传的出生缺陷，该疾病影响缬氨酸代谢。临床症状包括但不限于基底神经节的脑损伤、神经衰弱、精神运动发育迟缓、肌张力减退、痉挛、血清和脑血清液乳酸含量升高。

发病机制：

脂肪酸先活化成脂肪酰辅酶A，进入线粒体进行B氧化，脂酰辅酶A在线粒体中经过脱氢、加水、再脱氢、硫解，生成一分子的乙酰CoA和一个少两个碳的新的脂酰CoA，催化第二步加水反应的是短链烯酰辅酶A水合酶，它催化反式2，3不饱和脂酰辅酶A衍生物水合生成3-羟酰基辅酶A。

短链烯酰辅酶A水合酶(SCEH/ECHS1)是催化线粒体脂肪酸氧化代谢的一个关键酶；由ECHS1基因编码，在线粒体脂肪酸β氧化途径的第二步中起作用。

指标二：

中文名称：4-羟基环己基乙酸

英文名称：4-hydroxycyclohexylacetic acid

分子量：158

分子式：C₈H₁₄O₃

分子结构式：

衍生化后分子式：C₁₄H₃₀O₃Si₂

衍生化后分子量：302

特征离子对：287，197

保留时间：28.283min

质谱图：

相关疾病：

乙酸尿症(霍金森尿症)

英文名称：Hawkinsinuria

遗传方式：常染色体显性遗传，致病基因定位于：12q24.31

疾病简介：又称4-羟苯丙酮丙酮糖酰化酶缺乏症，是一种引起酪氨酸代谢紊乱的常染色体显性遗传病。

发病机制：

正常情况下，酪氨酸的代谢异常涉及4-羟基苯丙酮酸二氧合酶(HPPD)的转化。完全缺乏这种酶会导致酪氨酸血症。在极少数情况下，该酶仍能产生反应性中间体1，2-环氧苯乙酸，但不能将此中间体转化为尿黑酸。该中间产物与谷胱甘肽自发反应形成(2-L-cystein-S-yl-1，4-dihydroxy-cyclohex-5-en-1-yl acetic acid，即hawkinsin)

临床表现：发病多在婴幼儿时时期，成年人期虽有Hawkinsin和4HCAA被检测到，但无明显症状；伴有代谢性酸中毒；头发稀疏、发育不良；体内酪氨酸水平升高；伴有轻度或无神经系统紊乱。

实验室检测指标：

指标三：

中文名称：4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮

英文名称：4-Hydroxy-6-methyl-2-pyrone

分子量：126.11

分子式：C6H6O3

CAS号：675-10-5

衍生化后分子式：C₉H₁₄O₃Si

衍生化后分子量：198

特征离子对：198，183

保留时间：24.535min

质谱图：

相关疾病：

线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶缺乏症

英文名称：Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coA synthasedeficiency

遗传方式：常染色体隐性遗传，致病基因定位于1p12

OMIM：605911

疾病简介：线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶(HMCS2)缺乏症是由于HMGCS2基因变异导致的罕见酮体生成障碍疾病，于1997年首次被发现，HMCSD发病率极低，已经报道的病例在全球不超过100例。

发病机制：HMCS2是脂肪酸合成酮类化合物的限速酶。由于线粒体HMG-CoA合成酶(HMGS)缺陷导致低血糖时脂肪利用和酮体产生异常，不能自身代偿，出现严重低血糖并伴有游离脂肪酸增高。临床表现：HMGCS2缺乏导致酮体生成障碍及体内多种酸性代谢产物堆积，可导致肝细胞受损，蛋白分解增多从而使血氨增高，低酮性低血糖及严重酸中毒可导致脑损伤及心肌受损，严重时可发生昏迷甚至猝死，HMCSD死亡率达20％，死亡往往与饥饿、超负荷运动、发热等应激状态下出现的非酮症性低血糖有关。

实验室检测指标：

	特异性标记物	非特异性标记物
			LC-MS/MS		C2/C0异常升高
GC-MS	4-羟基-6-甲基-2-吡咯酮	二羧酸异常升高

参考值范围初步确立：

1、阴性样本统计

2、阳性样本统计：

3、参考值范围初步确立

序号	有机酸名称	正常参考值	阈值下限	阈值上限
					136	4-羟基环己基乙酸	0	0	3.00
137	2，3-二羟基-2-甲基丁酸盐	0	0	1.00
					138	4-羟基-6-甲基-2-吡喃	0	0	2.00

指标四：

中文名称：2-甲基丁基甘氨酸(2-MBG)

英文名称：2-methylbutyrylglycine

分子量：159

分子式：C₇H₁₃NO₃

分子结构式：

衍生化后分子式：C₁₃H₂₉NO₃Si₂

衍生化后分子量：303

特征离子对：288，186

保留时间：24.333min

相关疾病：

2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症

英文名称：2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency

简称：SBCADD

遗传方式：常染色体隐性遗传

基因突变位点：c.303+3A＞G，1165AG/848AGb，908GC/908GCc，443CT/443CT，1102TC/1102TC

疾病简介：2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症，又称短支链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SBCADD)(OMIM61006)，是一种常染色体隐性遗传病，由l-异亮氨酸降解途径缺陷导致2-甲基丁酰甘氨酸的尿排泄增加。酶的缺陷是由于SBCAD基因(ACADSB)的破坏造成的。临床症状通常分为2种类型，一种是无症状型，另一种患者表现为发育迟缓和神经系统症状，如自闭症、肌张力减退、嗜睡、癫痫、斜视等。发病机制：

支链氨基酸l-异亮氨酸的分解代谢主要通过s途径发生，但也通过次要的r途径发生。SBCAD的缺乏导致其底物2-甲基丁基辅酶a的线粒体内积累。通过线粒体酶酰基辅酶a：甘氨酸-n-酰基转移酶(甘氨酸-N-酰化酶)与甘氨酸进行酯化，形成2-MBG。

SBCAD酶对R-途径中的R-2-MBG脱氢起作用，则在SBCADD中不会产生2-EHA。但通过我们对SBCADD尿液中的2-羟甲基丁酸观察表明，一种不同或替代酶具有通过r途径增加通量，可作为积累的s途径代谢物溢流的安全阀，从而减轻SBCADD的严重程度。认识到(2-羟甲基丁酸2-hydroxymethyl-butyric acid-2)/(2-ethylhydracrylic acid 2-乙基丙酸)可作为一种诊断标志物，可以提高SBCADD的检测水平，并改善其临床表型的定义。

实验室检测指标：

2、阳性样本统计：

实施例1

一种有机酸含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液，其中，内标溶液包含重量比例如下的组分：3，4-二羟基肉桂酸35％；蜡酸15％；水杨酸40％，混合为浓度为1.2mg/ml的水溶液，内标溶液的浓度为0.6mg/mL；

向很混合液中加入3mol/L苛性钠，调节PH为7.2，然后加入3mg/mL盐酸羟胺进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液，萃取溶剂包括乙酸乙酯和乙醚；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，衍生化试剂包括N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，二者的重量比例为85∶15反应温度40℃，反应时间20min。

再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量，其中，柱温箱起始温度60℃，以6℃/min升温至280℃，然后再以10℃/min升温至310℃。

实施例2

一种有机酸含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液，其中，内标溶液包含重量比例如下的组分：3，4-二羟基肉桂酸45％；蜡酸25％；水杨酸35％,混合为浓度为1.8mg/ml的水溶液，内标溶液的浓度为1.2mg/mL；

向很混合液中加入8mol/L苛性钠，调节PH为7.5，然后加入加入5mg/mL盐酸羟胺，进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液，萃取溶剂包括乙酸乙酯和乙醚；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，衍生化试剂包括N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，二者的重量比例为90∶10反应温度60℃，反应时间40min。

再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量，其中，柱温箱起始温度70℃，以8℃/min升温300℃，然后再以15℃/min升温至320℃。

对比例

向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液，其中，内标溶液为2-苯基丁酸溶液；

向很合液中加入0.5mg/mL盐酸羟胺溶液和5mol/L氢氧化钠溶液，进行肟化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液，萃取溶剂包括乙酸乙酯和乙醚；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，衍生化试剂为BSTFA，反应温度40℃，反应时间20min。

再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量，其中，柱温箱起始温度60℃，以6℃/min升温至280℃，然后再以10℃/min升温至310℃。

实施例1-2和对比例检测到的浓度，与标准值对比，获得提取效率，见下表。

本申请还提供了一种有机酸含量检测盒，包括：壳体1、旋转轴2、支撑盘4、震动组件5、添加组件6；

壳体1被构造为具有一个恒温腔a1，恒温腔a1内具有恒温功能；该壳体1外形优选为圆柱形；壳体1的侧边部分形成进入恒温腔a1的开口a11，该开口a11处还设有密封门12；密封门12的一处铰接在开口a11的侧边上；更具体的说，开口a11的侧壁形成阶梯形，密封门12的侧边与开口a11相对应，以使密封门12关闭时，密封门12的外壁与壳体1的外壁平齐；

恒温腔a1的底部且位于中心位置设置旋转轴2，该旋转轴2部分插入恒温腔a1的底部以使以壳体1中轴线为旋转中心旋转；更具体的说，壳体1的底部设有电机3，电机3的输出轴与旋转轴2连接，以使驱使旋转轴2转动；

旋转轴2的侧壁固设有支撑盘4，该支撑盘4上形成若干个用于放置试管的安装槽a4，本实施例以六个为例，具体数量可根据实际工艺设定；安装槽a4内设置用于驱使试管震荡的震动组件5；

震动组件5包括转动设置于安装槽a4内的震动盘50和设置于震动盘50上用于安装试管的安装环51；安装环51可移动地设置于震动盘50上，且采用弹性件52连接，以使震动盘50旋转的过程中产生的离心力驱使安装环51在震动盘50内往复移动；安装环51的内环壁具有圆弧的弹性片511；通过弹性片511的设置能将试管夹在安装环51的中心位置；

震动盘50可转动地设置于安装槽a4内；更具体的说，震动盘50的外壁形成固定齿轮53；恒温腔a1的内壁上设有固定齿环54；支撑盘4上设有与固定齿轮53和固定齿环54同时啮合的对接齿轮55；当旋转轴2旋转的时候，对接齿轮55与固定齿环54啮合带动震动盘50上的固定齿轮53旋转，以使能同时带动所有的震动盘50旋转；

更具体的说，震动盘50表面部分贯穿并沿震动盘50径向方向延伸部分形成供安装环51沿震动盘50径向往复移动的移动槽a50；位于移动槽a50内壁部分内凹，且内凹部分沿移动槽a50的延伸部分延伸形成限位槽a51；安装环51的外壁形成插入限位槽a51内的凸块512，以使安装环51沿移动槽a50的延伸方向移动；该凸块512的表面与限位槽a51的内壁表面接触；其中，凸块512沿限位槽a51长度方向的两侧均设有与限位槽a51内壁连接的弹性件52；

更具体的说，弹性件52为固设于限位槽a51侧壁上的固定套521，该固定套521内滑动设置固定杆522；该固定杆522与凸块512固连；固定杆522位于固定套521内的端部通过弹簧523与固定套521的底壁固连；在震动盘50旋转的时候，会产生离心力，离心力会使安装环51在移动槽a50内往复无规律的移动；如此便会产生震动，起到对试管内混液震荡效果；

在其他实施例中，凸块512的上下两侧壁与限位槽a51的内壁具有一定的间距；固定杆522与凸块512形成铰接，固定套521与限位槽a51侧壁形成铰接；在震动盘50旋转的时候，离心力带动安装环51移动；移动的时候，由于凸块512的上下两侧壁与限位槽a51的内壁具有一定的间距；因此还会上下不间断地震动，如此安装环51便能带动试管做上下移动和往复运动，便进一步地产生了震动；有效地提高了震荡的效果。

安装槽a4的内顶壁和内底壁部分内凹形成环槽a41；震动盘50与其中一个环槽a41相对的表面部分凸起形成与该环槽a41相对应的凸环501；该凸环501插入该环槽a41部分，插入该环槽a41的端部与环槽a41的通过弹簧523连接；未设有凸环501的环槽a41底部形成若干个凸台42，该凸台42沿环槽a41的圆周方向均匀分布；该凸台42的侧边与环槽a41的底部圆弧对接；震动盘50与凸台42相对的表面形成抵杆502；抵杆502插入设有凸台42的环槽a41内，且与凸台42表面抵触；如此在震动盘50旋转的时候，抵触杆会间断的与凸台42抵触，从而抵触安装环51沿震动盘50的轴向方向往复震动；提高震荡的效果，由于震荡效果提高了便能缩短震荡时间；提高了检测的效率。

恒温腔a1的内顶壁设置用于定量添加标品、质控品混合液或超纯水的添加组件6，该添加组件6包括：升降盘61、添料盒63、料盒64；

恒温腔a1的内定壁上移动设置升降盘61；具体的说，壳体1的上端面安装有供升降盘61沿旋转轴2轴向方向移动的电动伸缩杆62；其中，升降盘61上开设有与安装槽a4相对应的相嵌槽a61；相嵌槽a61内嵌设添料盒63，壳体1上端装有两个料盒64；该两个料盒64分别装有用于添加内标品、质控品混合液和有超纯水；更具体的说，添料盒63形成两个定料腔a63，添料盒63底部且位于两个定料腔a63底部的添料管65；两个定料腔a63分别用管道66与两个料盒64连接；定料腔a63内设有用于将定料腔a63内的内标品、质控品混合液和超纯水挤压到添料管65内的活塞件67；管道66将内标品、质控品混合液和有超纯水，分别注入两个定料腔a63内进行备料；当安装槽a4内装满试管的时候，可通过活塞件67将定料腔a63内的内标品、质控品混合液和有超纯水一并注入试管100内；实现了自动加料；

在其他实施例中，添料盒63所形成的定料腔a63为若干个，数量以需要家添加的不同物料的种类数量相等。

更具体的说，活塞件67包括滑动设置于定料腔a63内的活塞板671；管道66贯穿活塞板671并连通活塞板671的底部；其中，位于活塞板671上管道66的开口a11处设有单向阀672；该单向阀672仅供管道66内内标品、质控品混合液和超纯水进入到定料腔a63内；

作为一种改进的，两块活塞板671上均设有定位杆673；定位杆673由电动伸缩器674控制移动，以使活塞板671在定料腔a63内的任意高度定位；如此便能控制定料腔a63的容积，方便操作人员调整剂量；更具体的说，安装环51上设有计重器，该计重器与填充超纯水的定料腔a63内的活塞板671上的定位杆673电连；具体的说，首先向试管内加入内标品、质控品混合液，然后计重器反应试管内的混合液的重量；数据反应至填充超纯水的定料腔a63内的活塞板671上的定位杆673，驱使活塞板671移动，确定定料腔a63的容量；该容量能定量超纯水，以使加入的超纯水后试管内的混合液始终在2ml。

一种有机酸含量检测方法，包括以下步骤：

a1、将每个样本分别加入40ul内标品、质控品混合液，其次，根据样本尿肌酐浓度差异，分别用超纯水定容总体积到2ml，放入震荡机中振荡30s充分混匀；其中，内标物质控品混标包括：纯乙酸乙酯，十七烷酸，2-苯基-3-羟基丙酸和二十四烷，其中纯乙酸乙酯为稀释液；

a2、将上述样本液转移至塑料离心管中，加入1ml 5％的盐酸羟胺，用塑料离心管盖密封，置于涡旋振荡器上，振荡60s充分混匀，室温下反应20分钟；

a3、将上述样本中分别加入3ml乙酸乙酯，振荡60s混匀，样本置于台式低速离心机中离心，设置离心转速为4000r/min，离心时间为5min；将上清液转移至备用10mL离心管中；重复上述离心萃取操作一次，因为二次萃取能够提高有机酸的提取率；

a4、在60℃条件下，氮吹大约30min，通过氮吹浓缩上述有机酸萃取液，去除萃取时的乙酸乙酯基质，只留下需要的有机酸成分，使测试结果更加精准；

a5、从氮吹仪上取出样本，加入100ul硅烷化试剂，在电热恒温培养箱中70℃反应30分钟；

a6、取出样本冷却至室温，转移样本至1.5ml进样瓶中的玻璃内插管中，放置自动进样器托盘，在自动进样器托盘1号位放入空白试剂进样瓶，2号位放入校正品，上机分析；其中，校正品采用C9-C28的正构烷烃混合标准品稀释液，正构烷烃标准品用于定性校正，正构烷烃标准品的浓度为13mg/L。

具体的说，在本实施例中，根据a1步骤中分别将待检测尿液、内标溶液，放入料盒64内；移动活塞板671限定定料腔a63的容积，并将待检测尿液、内标溶液填充至该定料腔a63内；将试管放在安装环内，启动电动伸缩杆62驱使升降盘61下降；将待检测尿液、内标溶液注入试管100内；此时计重器向填充超纯水的定料腔a63内的活塞板671上的定位杆673反馈，定位杆673根据此时试管100的重量自动驱使活塞板671移动限定定料腔a63的容量，以使加入超纯水后试管内的总含量保持在容总体积到2ml；添加完成后，再次启动电动伸缩杆62驱使升降盘61远离试管100；启动电机驱动旋转轴2旋转，并带动支撑盘4旋转；旋转的时候产生的离心力迫使试管100内混合液在试管内混荡；同时对接齿轮55与固定齿环54啮合，驱使固定齿轮53旋转，震动盘50开始自转，震动盘50产生的离心力能驱使安装环51在震动盘50的径向方向移动，并在弹性件的作用下开始往复移动；如此相当与对试管100内的混合液左右摇晃；在震动盘50自转的时候，抵杆502不断与凸台42抵触，驱使震动盘50在轴向方向上震动；因此试管100在左右摇晃的同时上下震动，同时支撑盘4产生的离心力能加剧混合液的晃动效果；如此便有效的提高了震荡效果；这样就可以减少工艺中震动的时间，提高了工艺效率。

步骤a2中，加入3-8mol/L盐酸，启动电机驱动旋转轴2旋转，振荡30s～60s充分混匀，室温下反应20分钟；继续加入3-5mg/mL水合肼和1-2mg/mL丙酰氯，启动电机驱动旋转轴2旋转，振荡30s～60s充分混匀形成反应溶液。

以上描述仅为本公开的一些较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开的实施例中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离上述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开的实施例中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (4)

1.一种有机酸含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 向待检测尿液中加入内标溶液，混合均匀得到混合液；

向混合液中加入3-8mol/L苛性钠，调节PH为7.2-7.5，然后加入3-5mg/mL盐酸羟胺，进行肟化酰基化反应，得到反应溶液；

向反应溶液中加入盐酸终止肟化酰基化反应加入萃取溶剂，离心后取上层的有机相溶液；

向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应，再用质谱分析仪检测有机酸目标物含量；

有机酸目标物包括5-羟吲哚乙酸、犬尿喹啉酸、2-甲基马尿酸、3,4-二羟基苯丙酸、黄尿酸、亚胺甲基谷氨酸、喹啉酸、吡啶甲酸、葡萄糖酸、苯丙酸、丙三羧酸、D-阿拉伯糖、柠苹酸、酒石酸、2 ,3-二羟基-2-甲基丁酸、4-羟基环己基乙酸、4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮、2-甲基丁基甘氨酸；

衍生化试剂包括N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，二者的重量比例为85~90：10~15；

萃取溶剂包括乙酸乙酯；

用质谱分析仪检测有机酸目标物含量步骤中，柱温箱起始温度60-70℃，以6-8℃/min升温至280-300℃，然后再以10-15℃/min升温至310-320℃。

2.根据权利要求1所述的有机酸含量检测方法，其特征在于，内标溶液的浓度为0.6-1.2mg/mL，内标溶液包含重量比例如下的组分：3，4-二羟基肉桂酸35-45％；蜡酸15-25％；水杨酸35-40％ ,混合为浓度为1.2-1.8mg/ml的水溶液。

3.根据权利要求1所述的有机酸含量检测方法，其特征在于，N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的重量比例为95~98∶5~2。

4.根据权利要求1所述的有机酸含量检测方法，其特征在于，向有机相溶液加入衍生化试剂进行反应中，反应温度40-60℃，反应时间20-40min。