CN108977436A - 生物核酸dna快速释放提取试剂以及制备方法和应用 - Google Patents

生物核酸dna快速释放提取试剂以及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种生物核酸DNA快速释放提取试剂，由A溶液和B溶液组成，A溶液和B溶液按常规制剂方法制成。A溶液由莎梵婷或OrfamideA、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇或甲醇、无菌水按常规制剂方法制成；B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水按常规制剂方法制成。使用时将A溶液和B溶液混合。该提取试剂可用于下游PCR反应以及在实时荧光定量PCR检测中应用。

Description

生物核酸DNA快速释放提取试剂以及制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到生物核酸DNA快速释放提取试剂以及制备方法和应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，稳定的Taq DNA聚合酶的发现为PCR技术的发展奠定了基础。由于Taq DNA聚合酶活性条件限制，PCR技术要求使用纯净的核酸提取样本。目前，常用的生物核酸释放提取方法包括：碱裂解法、酚抽提法、硅胶膜离心柱、磁珠法等。其中，碱裂解法通常采用具有腐蚀性的氢氧化钠变性后再用酸中和沉淀；酚抽提法步骤复杂，采用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提，化学毒性大；硅胶膜离心柱，采用高分子树脂膜截留纯化DNA，全过程须多次高速离心换管，耗时较长；磁珠法采用磁珠吸附，溶剂洗脱的方法提取DNA，操作过程需要使用磁套和磁体吸附，限制了操作通量，通常需要借助全自动磁珠提取仪来完成。这些生物DNA提取方法，如果手工操作，则耗时较长、操作过程复杂，对操作人员要求高，不利于技术推广或日常研究应用；如果仪器操作，则需要使用价格昂贵、精密度高的大型设备，且需要耗费大量一次性耗材，小规模实验室无法负担。目前，商用生物核酸DNA释放提取试剂盒一般采用硅胶膜离心柱和磁珠法，操作过程复杂，需多次开管、洗涤、分离，要求操作人员熟练地掌握工艺流程以及仪器的操作过程，容易造成PCR检测环境核酸污染，导致实验结果的不确定性，全过程须多次高速离心换管，耗时较长，不利于技术推广或日常研究应用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述现有生物核酸DNA提取试剂盒的缺陷，提供一种高效的生物核酸DNA快速释放提取试剂。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种生物核酸DNA快速释放提取试剂的制备方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为生物核酸DNA快速释放提取试剂提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是由A溶液和B溶液组成；
A溶液由莎梵婷或OrfamideA、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇或甲醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷或OrfamideA的摩尔浓度为0.01～1mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.347～70mmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.01％～2％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％～2％，乙醇或甲醇的体积浓度为0.01％～1％。
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为10～500mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1～10mmol/L，氯化镁摩尔浓度为0.01～10mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
本发明的A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：7.14～1153。
上述的生物核酸DNA快速释放提取试剂的制备方法由下述步骤组成：
(1)配制A溶液
将莎梵婷或OrfamideA用乙醇或甲醇充分溶解，加入无菌水，再加入十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚，搅拌溶解，制备成A溶液，在A溶液中，莎梵婷或OrfamideA的摩尔浓度为0.01～1mmol/L，乙醇或甲醇的体积浓度为0.01～1％，十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.347～70mmol/、二甲基亚砜的体积浓度为0.01％～2％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％～2％。
(2)配制B溶液
在容量瓶中加入无菌水，加入氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁，搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0～8.5，制备成B溶液，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为10～500mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1～10mmol/L，氯化镁的摩尔浓度为0.01～10mmol/L。
上述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在下游PCR反应中的用途。
其使用方法步骤如下：
(1)将离体的血液、唾液、尿液、粪便或者鼻咽拭子样本常温静置5～30分钟。
(2)向反应管中加人A溶液1～10μL，再加人步骤1样本上清1～10μL，室温静置5～20分钟。
(3)向反应管中加人B溶液，A溶液与B溶液的体积比为1：1，充分混匀后产生白色沉淀，静置，取上清，制成含有检测目标基因的待检样品，用于后续PCR检测。
上述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在下游PCR反应中的用途，所述的下游PCR反应为实时荧光定量PCR检测。
上述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在实时荧光定量PCR检测中的用途，使用方法步骤如下：
(1)将离体的血液样本常温静置5～30分钟。
(2)向反应管中加人A液1～10μL，再加人步骤1样本上清1～10μL，室温静置5～20分钟。
(3)向反应管中加人B液，A溶液与B溶液的体积比为1：1，充分混匀后产生白色沉淀，静置，取上清用于实时荧光定量PCR检测。
(4)实时荧光定量PCR检测
按照实时荧光定量PCR检测试剂盒操作规程，对上述已处理样本进行检测。
对离体的唾液、尿液、粪便、者鼻咽拭子样本检测方法与离体血液的检测方法相同。
由于本发明采用配制的A溶液、B溶液，实现了在单一反应管中释放生物细胞核酸分子并对其进行去除干扰PCR反应的杂质，高效、便捷、无损的释放提取生物核酸DNA分子用于下游核酸实验。全过程在一个反应管中30分钟完成,消除了管间交叉污染，减少了实验室环境污染，降低了提取反应时间，无中间环节损失，提取产物回收效率高，操作简便，对操作人员技术要求低，便于基层推广，适用于PCR反应、环介导等温扩增反应、实时荧光定量PCR反应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的生物核酸DNA快速释放提取试剂由A溶液和B溶液组成。
A溶液由莎梵婷、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷的摩尔浓度为0.1mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为347μmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.1％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％，乙醇的体积浓度为0.5％，上述原料配比中的乙醇可以用等体积的甲醇替换。
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为400mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L，氯化镁摩尔浓度为3mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
上述A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：1153。
上述试剂的制备方法由下述步骤组成：
(1)配制A溶液
将莎梵婷用乙醇充分溶解，加入无菌水，再加入莎梵婷、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚，搅拌溶解，制备成A溶液，在A溶液中，莎梵婷的摩尔浓度为0.1mmol/L，乙醇的体积浓度为1％，十二烷基硫酸钠的质量浓度为347μmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.1％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％。
(2)配制B溶液
在容量瓶中加入无菌水，加入氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁，搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0～8.5，制备成B溶液，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为400mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为10mmol/L，氯化镁的摩尔浓度为3mmol/L。
使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合，A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：1153。
实施例2
本实施例的生物核酸DNA快速释放提取试剂由A溶液和B溶液组成。
A溶液由莎梵婷、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇或甲醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷的摩尔浓度为0.01mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为347μmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.01％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为1.0％，乙醇的体积浓度为0.01％。
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为10mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L，氯化镁摩尔浓度为0.01mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：28.8。
实施例3
本实施例的生物核酸DNA快速释放提取试剂由A溶液和B溶液组成。
A溶液由莎梵婷、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷的摩尔浓度为1mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为70mmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为2％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为2％，乙醇的体积浓度为1％；
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为500mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为5mmol/L，氯化镁摩尔浓度为10mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：7.14。
实施例4
本实施例的生物核酸DNA快速释放提取试剂由A溶液和B溶液组成。
A溶液由莎梵婷、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇或甲醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷的摩尔浓度为0.01mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为20mmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.01％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为1.0％，乙醇的体积浓度为0.01％。
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为300mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1mmol/L，氯化镁摩尔浓度为0.01mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：15。
实施例5
在以上的实施例1～4的A溶液的原料配比中，所用的莎梵婷用等摩尔OrfamideA替换，OrfamideA由圣克鲁斯生物技术(北京)公司销售，在A溶液中，OrfamideA的浓度与莎梵婷相同。其它原料以及在A溶液中的浓度与相应的实施例相同。
在B溶液的原料配比中，所用的原料以及在B溶液中的浓度与相应的实施例相同。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比与相应的实施例相同。
实施例6
在实施例1的A溶液的原料配比中，所用原料以及用量与实施例1相同。在B溶液的原料配比中，所用原料与实施例1相同。在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为2.48mmol/L，其它原料的浓度与实施例1相同。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：7.14。
实施例7
在实施例1的A溶液的原料配比中，所用原料以及用量与实施例1相同。在B溶液的原料配比中，所用原料与实施例1相同，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为400mmol/L，其它原料的浓度与实施例1相同。
其制备方法与实施例1相同。使用时，将A溶液与B溶液按体积比为1：1混合。A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：1153。
实施例8
生物核酸DNA快速释放提取试剂在实时荧光定量PCR检测中的用途。其使用方法步骤如下：
(1)含有乙肝病毒的人血清样本室温静置5～30分钟；
(2)向反应管中加人A液1～10μL，再加人步骤1样本上清1～10μL，室温静置5～20分钟；
(3)向反应管中加人B液，A溶液与B溶液的体积比为1:1，充分混匀后产生白色沉淀，静置，取上清用于实时荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA。
(4)实时荧光定量PCR检测
按照实时荧光定量PCR检测试剂盒操作规程，具体方法如下；
①取出实时荧光定量PCR包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀备用。
②根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A、B、C、D数量，按比例(反应液43μl/样本+酶混合液2μl/样本)取相应量的反应液，酶混合液由纽英伦生物技术(北京)有限公司销售，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
③每个PCR反应管中加入步骤(3)产生的待测样本、生理盐水作为阴性对照、定量值为5*10E5拷贝/mL为阳性对照以及定量参考品A、B、C、D各5μl，吸打3-5次混匀。
④每管加入PCR-mix 45μl，盖上管盖，2000rpm离心10秒。
⑤将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照、定量参考品A、B、C、D以及未知样本，并设置样本名称及定量参考品浓度。
⑥荧光通道选择FAM通道
⑦设定循环参数：设定循环参数见表1。
表1设定循环参数
检测结果：反应结束后，仪器自动保存结果，用仪器的软件进行分析，记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过定量参考品定标值，求得各样本的定值结果见表2。
表2各样本的定值结果
编号 样本浓度(拷贝/mL) 本发明试剂(测量浓度)(拷贝/mL)
A 4*10E7 标准品
B 4*10E6 标准品
C 4*10E5 标准品
D 4*10E4 标准品
1 2.36*10E5 1.02*10E5
2 6.83*10E7 3.60*10E7
3 1.03*10E4 7.36*10E3
4 3.36*10E5 1.68*10E5
5 3.21*10E3 1.22*10E3
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的生物核酸DNA快速释放提取试剂，并采用实施例7的方法与磁珠法、煮沸法、硅胶膜离心柱对乙肝病毒血清样本进行了DNA对比提取实验，实验情况如下。
选取6份浓度为：1.73*10E7、1.81*10E6、4.95*10E5、5.29*10E4、8.10*10E2、2.48*10E1的乙肝病毒DNA血清样本，分别采用磁珠法、煮沸法、硅胶膜离心柱、本发明方法试剂进行DNA对比提取实验，再用商业实时荧光定量PCR试剂盒按试剂盒的操作方法定量。
实验结果见表3。
表3本发明试剂与现有方法对HBV血清中DNA对比提取实验结果
注：“/”表示未测出。
由表3可见，本发明试剂系统提取效率与磁珠法相当，优于煮沸法和硅胶膜离心柱。
(2)提取血清中乙肝病毒DNA实验
采用本发明试剂8次重复提取血清样本乙肝病毒DNA，检测其中的浓度为2.9*10E5，使用市售的乙肝病毒DNA定量检测试剂盒，按试剂盒的操作规程对上述DNA溶液进行检测，同一样本8次检测的变异系数<1％，浓度变异系数<30％，重复性好。说明本发明试剂能够有效地收集到血清样本中的乙肝病毒DNA。
(3)腺病毒DNA提取实验
选取10份咽拭子阳性样本，3份阴性对照咽拭子样本，3份空白水对照样本，分别采用磁珠法、煮沸法、硅胶膜离心柱、本发明试剂进行腺病毒DNA对比提取实验，用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的环介导等温扩增试剂盒按试剂盒的操作方法进行定性检测。
检测结果见表4。
表4采用本发明试剂与现有的方法检测腺病毒DNA对比实验结果
编号 样本定性结果 磁珠法 煮沸法 硅胶膜离心柱 本发明试剂
1 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
2 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
3 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
4 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
5 阳性 阳性 阳性 / 阳性
6 阳性 阳性 / 阳性 阳性
7 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
8 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
9 阳性 阳性 / 阳性 阳性
10 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
11 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
12 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
13 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
14 空白 阴性 阴性 阴性 阴性
15 空白 阴性 阴性 阴性 阴性
16 空白 阴性 阴性 阴性 阴性
由表4可见，本发明试剂提取腺病毒DNA的效率与磁珠法相当，优于煮沸法和硅胶膜离心柱。

Claims (7)

1.一种生物核酸DNA快速释放提取试剂，其特征在于：由A溶液和B溶液组成；
A溶液由莎梵婷或OrfamideA、十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚、乙醇或甲醇、无菌水制成，在A溶液中，莎梵婷或OrfamideA的摩尔浓度为0.01～1mmol/L，十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.347～70mmol/L，二甲基亚砜的体积浓度为0.01％～2％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％～2％，乙醇或甲醇的体积浓度为0.01％～1％；
B溶液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、盐酸、无菌水制成，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为10～500mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1～10mmol/L，氯化镁摩尔浓度为0.01～10mmol/L，盐酸用于调节PH值至8.0～8.5。
2.根据权利要求1所述的核酸DNA快速释放提取试剂，其特征在于:所述的A溶液中的十二烷基硫酸钠与B液中氯化钾摩尔浓度的比为1：7.14～1153。
3.一种权利要求1生物核酸DNA快速释放提取试剂的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)配制A溶液
将莎梵婷或OrfamideA用乙醇或甲醇充分溶解，加入无菌水，再加入十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、聚乙二醇对异辛基苯基醚，搅拌溶解，制备成A溶液，在A溶液中，莎梵婷或OrfamideA的摩尔浓度为0.01～1mmol/L，乙醇或甲醇的体积浓度为0.01～1％，十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.347～70mmol/、二甲基亚砜的体积浓度为0.01％～2％，聚乙二醇对异辛基苯基醚的体积浓度为0.1％～2％；
(2)配制B溶液
在容量瓶中加入无菌水，加入氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、氯化镁，搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0～8.5，制备成B溶液，在B溶液中，氯化钾的摩尔浓度为10～500mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为1～10mmol/L，氯化镁的摩尔浓度为0.01～10mmol/L。
4.权利要求1的生物核酸DNA快速释放提取试剂在下游PCR反应中的用途。
5.根据权利要求4所述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在下游PCR反应中的用途，其特征在于使用方法步骤如下：
(1)将离体的血液、唾液、尿液、粪便或者鼻咽拭子样本常温静置5～30分钟；
(2)向反应管中加人A溶液1～10μL，再加人步骤1样本上清1～10μL，室温静置5～20分钟；
(3)向反应管中加人B溶液，A溶液与B溶液的体积比为1：1，充分混匀后产生白色沉淀，静置，取上清，制成含有检测目标基因的待检样品，用于后续PCR检测。
6.根据权利要求4所述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在下游PCR反应中的用途，其特征在于：所述的下游PCR反应为实时荧光定量PCR检测。
7.根据权利要求6所述的生物核酸DNA快速释放提取试剂在实时荧光定量PCR检测中的用途，其特征在于使用方法步骤如下：
(1)将离体的血液样本常温静置5～30分钟；
(2)向反应管中加人A液1～10μL，再加人步骤1样本上清1～10μL，室温静置5～20分钟；
(3)向反应管中加人B液，A溶液与B溶液的体积比为1：1，充分混匀后产生白色沉淀，静置，取上清用于实时荧光定量PCR检测；
(4)实时荧光定量PCR检测
按照实时荧光定量PCR检测试剂盒操作规程，对上述已处理样本进行检测；
对离体的唾液、尿液、粪便、者鼻咽拭子样本检测方法与离体血液的检测方法相同。
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