CN101712954A - 一种核酸快速释放试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
一种核酸释放试剂及方法，该核酸释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl无菌水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl无菌水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成；所述百分比以无菌水体积为计算基准。该核酸释放方法是：取所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，用移液器反复吸打5-10次。本发明核酸释放试剂使用安全，制造成本较低；核酸释放方法操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸快速释放试剂和方法。
背景技术
目前，核酸提取方法主要经历了三个发展阶段：液体方法-离心柱方法-磁珠法。液体方法提取核酸，因其需要氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂而基本废弃；离心柱方法是目前使用最广泛的，相对于液体方法，提取步骤简单；磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，相对于离心柱方法，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，不过产使用的系列试剂产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用安全，操作简便，制造成本较低的核酸释放试剂和方法
本发明之核酸释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl(氯化钾)水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS(十二烷基磺酸钠)、LLS(Lithium lauryl sulfate，十二烷基硫酸锂)、或Chelex-100(Chelex树脂)，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。
配制方法：以无菌水、KCl配制50～200mM/L的KCl溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽浓度达到0.01～0.5mM/L，加入0.01％～2％(质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05％～1％(体积比)的乙醇，混匀，即配成本发明之核酸释放试剂。
所述百分比以无菌水体积为计算基准。
本发明之核酸释放方法是：取所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，待处理样本与核酸释放剂可以是任何比例，较优选的体积比为：待处理样本∶核酸释放剂＝1∶1～3；用移液器反复吸打5-10次，核酸即得到有效地释放。
本发明之核酸释放剂同时能抑制Dnase和Rnase活性，且不对后续实验产生影响。
所述核酸包括DNA和RNA。
本发明之核酸释放试剂采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA、RNA的释放和提取。
本发明之核酸释放方法，可快速释放血清、血浆、尿液、棉拭子、细菌、真菌、组织、植物、口腔细胞、PCR反应产物、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸可用于检测、克隆、序列分析、PCR扩增、分子杂交和cDNA合成等下游实验。
与目前已有的核酸提取方法相比较，本发明无需加热，无需离心，操作格外简便，接近自动化的操作保证了实验结果稳定，避免人工操作引起的差异及错误，可广泛应用于病原微生物的检测，法医学鉴定，组织和血液分型，基因突变的检测等领域。
附图说明
图1(a)为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测HBV DNA标准品的荧光定量PCR扩增曲线；
图1(b)为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测HBV DNA标准品所作标准曲线；
图2为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于重复性检测HCV RNA阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；
图3为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测沙眼衣原体(CT)阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1用于HBV DNA的荧光定量PCR检测实施例
核酸释放试剂配制：0.1mM/L的表面活性肽溶于80mM/L KCl无菌水溶液，加入0.1％(质量体积比)SDS、0.5％(体积)乙醇。所述百分比以无菌水体积为计算基准(下同)。
HBV DNA的荧光定量PCR检测：用带滤芯吸嘴吸取5微升所述核酸释放试剂、5微升待测样本(标准品、阴性、阳性对照，未知浓度的HBV DNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打5次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 单人份用量 |
| (上游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| (下游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| HBV探针HBV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 灭菌纯化水 | 32.1μl |
| 成分 | 单人份用量 |
| h-Taq(5U/ul) | 1ul |
| 总量 | 40μl |
PCR反应程序为：
如附图1(a)、(b)中检测了HBV DNA标准品A、B、C、D，浓度分别为4×107IU/ml、4×106IU/ml、4×105IU/ml、4×104IU/ml，以此标准品浓度做标准曲线，分析斜率为-3.31，一致性系数为0.9995。
实施例2用于HCV RNA的荧光定量PCR检测
核酸释放试剂配制：0.05mM/L的表面活性肽溶于100mM/L KCl无菌水溶液，加入0.01％(质量体积比)LLS、0.05％(体积)乙醇。
用带滤芯吸嘴吸取5微升所述核酸释放试剂，5微升待测样本(标准品、阴阳性对照，已知HCV RNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打8次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
HCV PCR反应液由引物、探针、dNTPs、5×PCR buffer、灭菌纯化水、ROX溶液、酶等组成。每人份HCV PCR反应液40μl，单人份用量配方如下：
| 物料名称 | 单人份用量 |
| 引物HCV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| 引物HCV-R1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| 探针HCV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| 内标引物IC-F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 内标引物IC-R2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 内标探针IC-P1(50pmol/μl) | 0.06μl |
| 物料名称 | 单人份用量 |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| Tth酶(5U/μl) | 1μl |
| 5×PCR buffer | 10μl |
| 灭菌纯化水 | 25.72μl |
| Mn(oAc)2(150mM) | 1ul |
| 总量 | 40ul |
PCR反应程序为：
采用本发明核酸释放试剂及核酸释放方法6次重复性检测浓度为1×104IU/ml阳性样本，从扩增曲线看，基线平整，一直是水平线；指数区较明显，平台区汇于一起，同一个样本6次检测ct值的变异系数＜2％，浓度值变异系数＜50％(参见附图2)。
实施例3用于性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测
核酸释放试剂配制：按实施例1比例配好核酸释放试剂，与水以2∶3的比例将核酸释放试剂进行稀释后使用。
性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测：用棉试子擦净尿道口，再用另一棉试子插入尿道内轻轻转动后取出，将试子置含0.5ml生理盐水的EP管搅拌、挤干后，弃拭子，用带滤芯吸嘴吸取上述含分泌物的样本5μl，加入到所述核酸释放试剂中，用移液枪头吸打10次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40μl已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。针对沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、淋球菌(NGH)和单纯疱疹病毒2型(HSV2)设计相应的引物探针序列，PCR反应各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 单人份用量 |
| (上游)引物F1(50pmol/μl) | 0.16μl |
| (下游)引物F2(50pmol/μl) | 0.16μl |
| 探针P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 灭菌纯化水 | 32.18μl |
| h-Taq(5U/μl) | 1μl |
| 总量 | 40μl |
PCR反应程序为：
应用本发明核酸释放试剂及核酸释放方法对沙眼衣原体DNA进行检测，原液浓度为5×108IU/ml，以生理盐水10倍梯度稀释至5×103IU/ml，同时以生理盐水做阴性对照，从扩增的曲线上看，基线平整，阴性对照(NTC)无模板，不产生引物二聚体，一直是水平线；指数区较明显，斜率大且固定；平台区汇于一起，线性范围广(参见附图3)。
Claims (3)
1.一种核酸释放试剂，其特征在于，由0.01～0.5mM/L(与KCl无菌水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl无菌水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成；所述百分比以无菌水体积为计算基准。
2.种核酸释放方法，其特征在于，取权利要求1所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，用移液器反复吸打5-10次。
3.根据权利要求2所述的核酸释放方法，其特征在于，待处理样本与核酸释放试剂的体积比为：待处理样本∶核酸释放试剂＝1∶1～3。
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