CN106715717B - 使用有机溶剂除去抑制剂的核酸提取 - Google Patents

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Abstract

核酸扩增测试已广泛用于临床实验室。由于不同的不利物质可能共提取和抑制下游应用，从生物材料中提取核酸是有挑战性的。要求保护的本发明涉及在核酸提取之前、期间或之后用于处理样品的组合物和方法。更具体地，要求保护的本发明涉及用于使用低浓度的常见有机溶剂除去核酸扩增抑制剂的组合物和方法。要求保护的本发明可用于从细菌、病毒、寄生物和其它生物材料或基质，包括但不限于粪样品、体液、植物和培养物中提取核酸(DNA/RNA)。该方法是快速、低成本、并且易于在实验室背景中使用的。根据要求保护的本发明提取的核酸可以用于核酸扩增反应。

Description

使用有机溶剂除去抑制剂的核酸提取
发明背景
核酸扩增测试(NAAT)已广泛用于目前的分子诊断学，包括传染病、肿瘤学和药物基因组学。与传统诊断方法相比，它提供了用户友好和准确的结果并且耗时更少。为了进行诸如聚合酶链式反应(PCR)和等温扩增的分子诊断研究，从生物材料，如粪样品和血液样品中提取核酸。已经开发了用于核酸提取的一大批方法，在成本、易于使用、需要的时间、包括使用的有害化学品的材料以及提取的核酸的数量和质量之间产生许多折衷。
当前可用的方法需要长时间的酶促消化、温育、分离和核酸沉淀或洗脱。煮沸步骤也是用于粗制核酸制备物的最常用的方法。在许多情况下，分离的核酸的质量和数量不适于下游应用，如核酸扩增。在扩增和检测特定靶标之前制备核酸样品是分子诊断学的最具挑战性的步骤，这是因为存在于生物样品中的极其多种化合物可以使DNA聚合酶降解和变性，或降低PCR或等温扩增反应中DNA聚合酶的酶促活性。因此，最佳核酸纯化方法可以减少或消除生物样品的组分对扩增的抑制，以实现成功的扩增。需要简单且快速的方法以产生不含扩增抑制剂的质量核酸，所述方法不需要广泛的样品加工并且可以适应于临床实验室。
发明概述
要求保护的本发明涉及在核酸提取之前、期间或之后处理样品的组合物和方法。更具体地，要求保护的本发明涉及使用低浓度的常见有机溶剂除去核酸扩增抑制剂的组合物和方法。可以使用要求保护的本发明从细菌、病毒、寄生物和其它生物材料或基质，包括但不限于粪样品、体液、植物和培养物中提取核酸(DNA/RNA)。本文中所述的方法是快速、低成本、并且易于在实验室背景中使用的。根据要求保护的本发明提取的核酸可以用于核酸扩增反应。要求保护的本发明的目的是提供最佳的核酸纯化方法以减少或消除生物样品的组分对扩增的抑制以实现成功的扩增。
在一个方面，提供了用于处理生物样品以提取核酸的方法。方法包括获得生物样品，并且在包含0.5至20wt.％有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物。方法还包括在15℃至35℃的温度温育混合物5秒至30分钟，以使存在于生物样品中的核酸从生物样品的至少一部分中提取用于进一步加工；并且从生物样品中分离核酸的至少一部分。方法还包括在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释核酸的至少一部分以形成扩增混合物；并且在25℃至70℃将扩增混合物温育1至10分钟。
在另一方面，提供了用于处理生物样品以提取核酸的方法，其包括获得生物样品，所述生物样品包括粪样品；并且在包含0.5至20wt.％的有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物。方法还包括在15℃至70℃的温度温育混合物5秒至30分钟，以使存在于生物样品中的核酸从生物样品的至少一部分提取用于进一步加工。方法还包括从生物样品中分离核酸的至少一部分；并且在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分以形成扩增混合物。
在又一方面，提供了用于处理生物样品以提取核酸的方法。方法包括获得生物样品，所述生物样品包括粪、血液。唾液或尿液中的一种或多种；并且在包含0.5至20wt.％有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物。方法还包括在15℃至35℃的温度温育混合物5秒至30分钟，以使存在于生物样品中的核酸从生物样品的至少一部分中提取用于进一步加工。方法还包括从生物样品中分离核酸的至少一部分。方法还包括对核酸的至少一部分添加有机溶剂至0.5至20wt.％的浓度以形成经处理的核酸；并且在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释经处理的核酸的至少一部分以形成扩增混合物。方法还包括在扩增反应中扩增所述核酸的至少一部分。
附图简述
下面参考附图详细描述要求保护的发明的示例性方面，其中：
图1显示了新的核酸提取方法的示例性步骤，其包括有机溶剂以简化核酸提取而不需要将生物材料煮沸。
图2显示了根据要求保护的发明的方面使用的示例性样品收集装置的组件(assembly)。
图3A-3B描绘了使用粗制DNA的等温扩增的考马斯蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，所述粗制DNA使用要求保护的本发明的方法从不同样品提取。
图4描绘了显示艰难梭菌(C.difficile)RPA等温扩增测定法中对粗制DNA的分析的图。
图5A-5B描绘了显示使用NEAR等温扩增对从粪样品提取的DNA的分析的图。
图6描述了显示用从粪样品提取的DNA进行的沙门氏菌属(Salmonella)RPA测试的图。
图7A-7B描绘了显示在从粪样品提取的DNA中检测志贺毒素stx2基因的RPA测试的图。
图8描绘了从诺如病毒阳性粪便样品提取的RNA的逆转录和PCR分析的考马斯蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
图9描述了显示用从本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中提取的粗制DNA进行PCR扩增的图。
图10描绘了显示通过在核酸提取期间在不同步骤添加有机溶剂可以消除扩增抑制剂的图。
发明详述
在本文中具体描述要求保护的发明的主题以满足法定要求。然而，描述本身并不旨在限制本专利的范围。相反，发明人预期要求保护的主题还可以以其它方式实施，以包括与其它现有或未来技术结合的、与本文档中描述的步骤或步骤组合类似的不同步骤或步骤组合。
以速度和低成本为目标，持续需要新的材料和程序以在较少的时间内提取核酸并降低操作者干预和错误的风险。由于各种抑制剂的存在，人样本，如粪和血液在下游分子应用前对样品制备提出了巨大的挑战。此外，通过煮沸消除核酸扩增的这些抑制剂不适合于需要纯化的RNA的分子测试，因为加热导致RNA降解。在人样本中发现并影响PCR和等温扩增两者的抑制剂包括胆汁盐、复合多糖、血红蛋白/氯化血红素(hemin)、多酚、色素和尿液(urea)。已经致力于开发样品制备方法以克服这些DNA扩增抑制剂的问题，并且已经采用各种技术来降低抑制剂的效应。例如，水性两相系统、过滤、稀释和过滤已经用于促进DNA扩增。10分钟煮沸也是用于粗制细菌DNA制备的非常常见的方法，其对于裂解细胞以释放核酸和减少对下游扩增的抑制非常有效。然而，在临床实验室中将样品煮沸并非安全或方便的。因此，需要一种用于粗制核酸提取的更安全和更容易的方法，因为现有方法是劳动密集的、复杂和/或昂贵的。因此，它们在许多临床实验室背景中不实用。因此，迫切需要从生物样本中提取高质量核酸的简单、易于使用的方法。
本文中描述了新的样品制备方法，其使用与短的且较低温度的温育组合的低浓度的有机溶剂以替换煮沸和其它广泛的步骤(如酶促消化、温育、分离、沉淀和洗脱)，所述步骤广泛用于核酸提取程序以有效消除从生物材料提取的核酸中的抑制因子。要求保护的本发明的方法可以与不同的生物样品如血液、粪、尿液，植物等一起使用。在核酸提取缓冲液中添加低浓度的有机溶剂降低了DNA制备和RNA提取需要的温度，这是因为不再需要煮沸来消除粗制核酸制备物中的扩增抑制。添加有机溶剂可用于在核酸提取方法之前，期间和之后处理样品。可以使用单一溶剂或溶剂的组合。提取缓冲液强烈地裂解细胞，导致核酸释放到提取缓冲液中。有机溶剂有助于在粗制核酸制备中在较低温度降低或除去扩增抑制。与通过活性炭或常规滤器的过滤组合，使样品中的抑制剂与滤器结合和/或在缓冲液中溶解/变性。根据本发明方法提取的核酸适合于随后用于广泛利用的技术，如核酸扩增。如本文中使用的，低浓度的有机溶剂指低于预定阈值的浓度。本文中提供了示例性量。
要求保护的发明的方面涉及用于使用低浓度的有机溶剂以消除核酸扩增抑制剂制备生物样品的方法，所述生物样品意图用于与等温扩增和PCR一起使用。
生物样品包括生物组织、生物组织提取物和生物排泄物、血液或血液的一部分、尿液、粪、唾液、痰、粘液、精液或匀浆组织。因此，其可以是人或动物组织的生物样品，如均质化的肉(例如汉堡包、羔羊肉(lamb)、猪肉、鸡、鱼、蛋)。它还可以是固体样本的提取物，如粪样品或可食用肉样品的水性提取物。此外，生物样品包括植物组织、培养的细菌、培养的病毒、培养的寄生物，和培养的哺乳动物和昆虫细胞。
根据要求保护的本发明的一个方面，提供了一种组合物，其能够(i)除去或灭活存在于生物材料中的化合物，其可能干扰核酸对于下游应用的用途，和(ii)从生物样品提取核酸。
参考图1，方法包括一种含有低百分比的有机溶剂的水性核酸提取缓冲液，其允许无加热的选项，具体地不是95℃或之上。参考图1，在步骤1获得样品的拭子。在步骤2，将样品添加到含有具有低百分比的有机溶剂的核酸提取缓冲液的挤压管，并在刻划线处折断。仍然在步骤2，将活性炭过滤尖端置于挤压管的顶部，并且将挤压管涡旋振荡10秒。在步骤3，将1滴过滤的提取样本挤出到反应管中。将加帽的反应管在65摄氏度温育3分钟，并在步骤4涡旋振荡10秒。然后，反应管中的核酸准备用于下游应用。例如，如步骤5-6中显示，可将50μl提取样本或适当体积的提取样本用于等温扩增或PCR。图1在本质上仅仅是示例性的，并且可以包括对所要求保护的发明的附加方面的修改。例如，加热样品的时间量可以落入不同于3-5分钟的范围内。
现在转到图2，图200描绘了在要求保护的发明中使用的样品收集装置的组件(assembly)。样品收集装置包含：收集样品的拭子210、可以添加到提取管230的顶部的滤器尖端220。提取管230含有用于核酸提取的提取缓冲液。可以将拭子添加到提取管并且在刻划线240处折断，并且留在提取管230内部。在将折断的拭子240放置在提取管230内部后，可以将滤器尖端220添加到提取管的顶部以组装样品收集装置250。
要求保护的发明的一个方面公开了用于从生物样品，特别是粪、血液、唾液、尿液或植物组织的样品制备核酸的方法。可以在含有低百分比(按重量计约0.5％至20％)的常见有机溶剂的提取缓冲液中稀释生物样品。
在要求保护的发明的实践中，低百分比的常见有机溶剂适合于包含在核酸提取缓冲液中。实例是但不限于乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇和二甲基亚砜(DMSO)。这些有机溶剂(单独地或作为混合物一起)是特别令人感兴趣的。使生物样品暴露于的有机溶剂的浓度可以变化，但是可以有效除去抑制的浓度的范围通常会为约0.5％至约20％，在许多情况下为约3％至约10％(均按重量计)。此外，可以使用有机溶剂在核酸提取前预处理生物样品，或添加到提取缓冲液，或在扩增前稀释前添加。添加0.5-20％范围外的有机溶剂是不利的，因为它抑制核酸扩增。
将提取缓冲液中的生物样品在约15℃至约35℃的温度温育约5秒至约30分钟，以使核酸释放到样品流体中。使用活性炭滤器，如包埋有活性炭的Porex玻璃纤维滤器作为滤器(活性炭滤器的孔径可以大于50μm且小于250μm)。将释放的核酸在PBS或水或用于下游应用的合适的扩增反应缓冲液中稀释，并将混合物在25℃至70℃温育1至10分钟。
下游应用包括但不限于等温扩增、PCR(实时PCR或常规PCR)、测序、基因型分型和杂交。等温扩增包括但不限于切口酶相关反应(NEAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、滚环扩增和其它等温扩增方法。用含有低浓度有机溶剂的提取样品在加热或不加热的情况下完成扩增。核酸提取缓冲液可以由通常使用的缓冲液组分组成。
示例性方面的以下列表支持本文中提供的讨论和实施例并且得到本文中提供的讨论和实施例支持。
方面1
1.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品；(b)在包含0.5至20wt.％有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物；(c)在15℃至35℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以使从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步加工；(d)从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；(e)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分以形成扩增混合物；并且(f)在25℃至70℃将扩增混合物温育1至10分钟。
方面2
1.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品，所述生物样品包括粪样品；(b)在包含0.5至20wt.％有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物；(c)在15℃至70℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以使从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步处理；(d)从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；并且(e)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分以形成扩增混合物。
方面3
1.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品，所述生物样品包括粪、血液、唾液或尿液中的一种或多种；(b)在包含0.5至20wt.％有机溶剂的提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物；(c)在15℃至70℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以使从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步处理；(d)从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；(e)将有机溶剂添加至所述核酸的至少一部分，以达到0.5至20wt.％的浓度以形成经处理的核酸；(f)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述经处理的核酸的所述至少一部分以形成扩增混合物；和(g)在扩增反应中扩增所述核酸的至少一部分。
方面4
根据方面1的方法，其中所述生物样品包含一种或多种人样本、细菌、病毒、寄生物、粪样品、体液、植物或培养物。
方面5
根据方面1、2或3的方法，其中所述有机溶剂包括丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或二甲基亚砜(DMSO)中的一种或多种。
方面6
根据方面1、2或3的方法，其中所述提取缓冲液包含3wt.％至10wt.％有机溶剂，其中所述有机溶剂包括乙醇，丙酮或其组合。
方面7
根据方面1、2或3的方法，其中从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分包括用滤器过滤所述混合物。
方面8
根据方面1、2或3的方法，其中所述滤器具有50μm至250μm的孔径。
方面9
根据方面1、2或3的方法，其中所述滤器包括多孔塑料、多孔聚合纤维或多孔玻璃纤维中的一种或多种。
方面10
根据方面1、2或3的方法，其中所述滤器包括包埋有活性炭的玻璃纤维滤器。
方面11
根据方面1、2或3的方法，其中在25℃至70℃将所述生物样品温育3-5分钟。
方面12
根据方面1或2的方法，所述方法还包括在扩增反应缓冲液中稀释核酸的至少一部分之前，将有机溶剂添加至所述核酸的至少一部分，以达到0.5至20wt.％的浓度。
方面13
根据方面12的方法，其中对所述核酸的至少一部分添加有机溶剂包括对所述核酸的至少一部分添加乙醇。
方面14
根据方面1、2或3的方法，其中所述温育温度在50℃和65℃之间。
方面15
根据方面1、2或3的方法，其中添加有机溶剂可以消除加热、酶促消化、温育、分离、核酸沉淀或洗脱中的一种或多种的需要。
方面16
根据方面15的方法，其中所述加热在95℃或之上的温度进行。
方面17
根据方面1、2或3的方法，其中扩增反应缓冲液是适合于等温扩增、PCR、测序、基因型分型和杂交的缓冲液。
方面18
根据方面17的方法，其中等温包括切口酶相关反应(NEAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、滚环扩增和其它等温扩增方法。
方面19
根据方面1或2的方法，所述方法还包括在扩增反应中扩增所述核酸的至少一部分。
方面20
根据方面3或19的方法，其中使用具有有机溶剂的提取缓冲液但不加热进行所述扩增。
方面21
根据方面3或19的方法，其中在加热的情况下使用具有有机溶剂的提取缓冲液进行所述扩增。
方面22
根据方面1、2或3的方法，其中所述提取缓冲液包含用于核酸扩增的提取缓冲液。
要求保护的发明的例示性方面在下文中参考以下实施例详细描述，所述实施例通过例示的方式提供并且不旨在以任何方式限制要求保护的发明。利用下文描述的PCR和等温扩增来评估提取的核酸的质量和数量。
实施例1
在减少或除去核酸等温扩增抑制剂方面比较煮沸与在有机溶剂的情况下的较低温度加热
使用商业的艰难梭菌测试来评估描述的核酸提取方法。测试不同的提取条件，包括煮沸、无加热或在有或没有3％的有机溶剂的情况下65℃，以从粪样本制备核酸用于等温扩增。此测试含有靶物(tcdB基因)和内部对照(IC)的扩增，如图3中显示。图3A显示了在所列条件下使用从艰难梭菌阳性粪样品(样品10233)提取的粗制DNA的等温扩增。在热块上进行反应，并且在1％琼脂糖凝胶上分离扩增产物。在图3A(样品10233)和3B(样品16)中提供了结果。当在无加热的情况下制备DNA(泳道3)时，没有观察到tcdB基因的扩增子(如图3A中显示)。在图3A中，当通过使用煮沸(泳道2)、添加3％乙醇(泳道4)或在不添加有机溶剂的情况下在65℃加热3分钟(泳道5)制备DNA时，扩增的DNA片段的强度在凝胶中是相似的。图3B显示了使用在指定条件下从样品16提取的粗制DNA的等温扩增。在图3B的泳道A-C中检查tcdB基因的扩增。在图3B的泳道D-F中评估内部对照的扩增。在1％琼脂糖凝胶上分离扩增产物。如图3B中显示，当在提取缓冲液中用3％乙醇在65℃将样品16处理3分钟时，tcdB基因和内部对照显显示强的扩增(图3B，泳道A和D)。然而，当在无加热的情况下用3％乙醇或仅65℃加热处理样品16时，没有发生tcdB扩增(图3B，泳道B和C)。结果指示与在65℃温育3-5分钟组合的3％乙醇是最佳的，并且在降低来自用于DNA扩增的样本的抑制方面与煮沸相当。对于一些样品，与煮沸方法相比，在没有加热步骤的情况下在提取缓冲液中添加有机溶剂展现相同量的扩增子。
实施例2
使用人粪样品用或不用乙醇提取进行的核酸等温扩增
使用重组酶聚合酶扩增(RPA)和切口酶相关反应(NEAR)等温扩增在降低对核酸扩增的抑制效应方面评估有机溶剂。遵循图1中显示的程序从具有艰难梭菌感染(CDI)的患者制备粗制粪DNA。对样品6654使用RPA艰难梭菌测试，并且对样品9637、9638、9648、9665和9669应用NEAR艰难梭菌测试。在添加或不添加3％乙醇的情况下使用提取缓冲液，并且在65℃温育5分钟。通过使用RPA和NEAR等温扩增从提取的DNA样品扩增艰难梭菌毒素B基因(tcdB)。通过使用Axxin T16荧光读数器测量扩增产物的相对量(RFU：相对荧光单位)。在图4和图5中提供了结果。图4显示了艰难梭菌RPA等温扩增测定法中粗制DNA的分析。使用补充有3％乙醇的提取缓冲液(实线)或仅使用提取缓冲液(虚线)从样品6654中提取DNA，而图5显示使用NEAR等温扩增从粪样品提取的DNA的分析。在提取缓冲液中没有(图5A)或具有乙醇(图5B)的情况下从5份粪样品(样品9637、9638、9648、9665和9669)中提取粗制DNA。通过使用Axxin T16荧光读数器测量tcdB的扩增。图5中的NTC意指无模板对照，因此没有将模板添加到该反应中。
与提取缓冲液中没有有机溶剂纯化的DNA(图4虚线和图5A)相比，从含有有机溶剂的提取缓冲液中纯化的DNA(图4实线和图5B)给出强烈得多的信号和更快的扩增。这些结果指示通过在提取缓冲液中添加3％乙醇并在65℃温育实质性降低了对DNA扩增的抑制。
实施例3
使用含有细菌和寄生物的人粪样品比较用或不用有机溶剂进行的经提取的DNA的扩增
在本实施例中使用的人粪样品来自感染有艰难梭菌、志贺样毒素产生性大肠杆菌(shiga-like toxin-producing E.coli)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、幽门螺杆菌(H.pylori)、沙门氏菌属(Salmonella)、贾第虫属(Giardia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)和溶组织内阿米巴(E.histolytica)的患者。使用参照图1描述的方法从那些临床样品中提取DNA。还通过使用Biomerieux NucliSENSeasyMAG自动化仪器从那些样品中纯化DNA，并用作用于比较的对照。利用PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)和切口酶相关反应(NEAR)等温扩增来评估提取的核酸的质量和数量。
PCR扩增：
使用IQ效能混合物(power mix)(Bio-Rad)或SYBR绿色主混合物(LifeTechnologies)在管或96孔板中以20μl体积进行PCR反应。在反应中采用针对每种病原体的特异性引物和/或探针。对于SYBR主混合物，PCR扩增之后是解链曲线分析。
进行多重实时PCR以通过使用参照图1描述的方法纯化的DNA来检测贾第虫属、隐孢子虫属和溶组织内阿米巴。对于贾第虫属、隐孢子虫属或溶组织内阿米巴阳性样品，用3％乙醇纯化的粗制DNA和通过Biomerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器纯化的DNA显示相似的DNA扩增。
切口酶扩增反应(NEAR)：
使用Nt.BstNBI(New England Biolabs)和Bst DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)或Manta DNA聚合酶(Enzymatics)以50μl体积进行NEAR反应。在反应中使用靶向艰难梭菌毒素B基因、志贺毒素stx1基因和志贺毒素stx2基因的特异性引物和探针。使用Axxin T16荧光读数器检测扩增信号。在实施例2中已经显示了使用NEAR测试的艰难梭菌阳性粪样品的实例。
重组酶聚合酶扩增(RPA)：
使用由TwistDx制备的冻干材料以50μl体积进行RPA反应。在反应中使用靶向艰难梭菌毒素B基因、志贺毒素stx1基因、志贺毒素stx2基因、弯曲杆菌属16s rRNA基因和沙门氏菌属invA基因的特异性引物和探针。使用Axxin T16荧光读数器检测扩增信号。来自通过使用低百分比的有机溶剂纯化的DNA的毒素B基因、志贺毒素stx1基因、志贺毒素stx2基因、弯曲杆菌属16s rRNA基因和沙门氏菌属invA基因的扩增信号显示与通过使用煮沸法或通过使用商业核酸纯化系统Biomerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器纯化的DNA模板相同的强度。图6和图7中显示了针对沙门氏菌属invA基因(样品3、4、6、7和8)和志贺毒素stx2基因(样品3和12)的RPA测试。图6显示了用从粪样品提取的DNA的沙门氏菌属RPA测试。使用煮沸法(如图6A中显示)或在65℃温育3分钟的情况下使用含有3％乙醇的提取缓冲液(如图6B中显示)从5份沙门氏菌属阳性样品(样品3、4、6、7和8)中提取粗制DNA。显示了来自DNA样品的沙门氏菌属invA基因的扩增曲线。NTC：无模板对照。
图7A和7B显示了检测从粪样品提取的DNA中的志贺毒素stx2基因的RPA测试。使用煮沸法(如图7A中显示)或在65℃温育3分钟的情况下含有3％乙醇的提取缓冲液(如图7B中显示)从两份stx2阳性样品(样品3和12)中提取粗制DNA。显示来自DNA样品的志贺氏stx2基因的扩增曲线。
对于从煮沸法或要求保护的本发明中所述的方法制备的DNA样品，扩增曲线上的扩增起始时间和最高终点读数是相当的。使用要求保护的本发明中呈现的组合物和方法，结果例示了从含有细菌和寄生物的人粪样品中提取的DNA的质量和数量足以进行PCR和等温扩增。
实施例4
使用含有DNA和RNA病毒的培养物和人粪样品比较用或不用乙醇提取的核酸的扩增
提供该实施例以评估缓冲液和程序用于病毒核酸提取的效率。在本实施例中使用腺病毒和诺如病毒阳性临床粪样品。使用参考图1描述的方法从那些样品中提取核酸。使用提取的核酸和靶向腺病毒六邻体(hexon)基因(壳体蛋白II)的特异性引物进行实时PCR，以评估从腺病毒阳性样品提取的核酸的质量和数量。从腺病毒阳性样品提取的粗制DNA显示非常强的腺病毒壳体蛋白II基因的扩增。当在实时PCR中使用相同量的DNA时，通过使用参考图1描述的方法纯化的DNA的阈值循环(Ct)值与用BioMerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器纯化的DNA几乎相同。
图8显示了从诺如病毒阳性粪样品提取的RNA的逆转录和PCR分析。将使用要求保护的本发明中呈现的具有3％乙醇的提取缓冲液从诺如病毒阳性样品提取的RNA与在煮沸、无煮沸或者在无有机溶剂的情况下在65℃温育的情况下提取的RNA进行比较。还使用BioMerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器提取RNA并充当对照。然后，使用具有dsDNA酶的Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNA合成试剂盒进行逆转录。逆转录后，在实时PCR中使用靶向诺如病毒的ORF1区域的3’末端的特异性引物。如图8中显示，扩增来自经有机溶剂处理的样品的诺如病毒的靶区域的331bp条带。以高5倍量的起始材料用BioMerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器纯化的RNA用作对照。与仅用3％乙醇处理的样品相比，煮沸步骤显著降低了来自生物样品的RNA的产率。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。结果证明了，要求保护的发明中呈现的提取缓冲液和方法可强力裂解病毒以释放出完全适合于PCR和逆转录PCR的核酸。
实施例5
本文中公开的核酸制备方法可以应用于植物组织
提供该实施例以使用植物组织测试要求保护的本发明中呈现的提取缓冲液的能力。图9显示了从本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的叶提取的粗制DNA的PCR扩增。使用要求保护的本发明中所述的方法提取粗制植物DNA。肌动蛋白基因的扩增显示为实线。虚线代表无模板对照(NTC)。自本氏烟草植物叶获得生物材料。通过使用研钵研磨叶，并使用含有3％乙醇的提取缓冲液转移(100μg)至挤压简易管。涡旋振荡管，并且将1滴缓冲液通过炭滤器尖端挤压到含有500μl PBS的1.5ml eppendorf管中。在65℃将eppendorf管温育3-5分钟。在SmartCycler上使用提取的DNA和特异性靶向本氏烟草的肌动蛋白基因的引物进行实时PCR分析。植物肌动蛋白基因的成功PCR扩增证明，用要求保护的本发明中所述的方法从植物组织提取的DNA模板可用于PCR反应(如图9中显示)。
实施例6
可以使用本文中公开的DNA提取方法消除或减少血液样品中的扩增抑制剂
提供本实施例以测试血液对DNA扩增的抑制。在该程序中使用掺入有5％浓度的人血液的艰难梭菌阳性临床粪样品。用DNA进行等温反应，所述DNA使用参考图1描述的提取缓冲液和方法从掺杂样品提取。将血液样品的拭子添加到含有具有3％乙醇的提取缓冲液的挤压管中，并将拭子在刻划标记处折断。在将活性炭滤器尖端放置在挤压管的顶部后，将1滴提取缓冲液挤出到反应管。将反应管在65℃温育3分钟后，将50μl提取的DNA用于艰难梭菌RPA反应。提取的核酸能够在等温扩增反应中扩增tcdB基因和内部对照。然而，当对掺入有5％人血液的样品使用没有乙醇的提取缓冲液时，在RPA测试中完全抑制了自粗制DNA扩增艰难梭菌的tcdB基因和内部对照。结果显示要求保护的本发明从血液样品中有效地除去抑制剂。
实施例7
可以在核酸提取过程中的裂解步骤之前，期间和之后添加低百分比的有机溶剂
在该程序中使用的人粪样品来自感染了艰难梭菌的患者。在核酸提取过程中的不同步骤添加有机溶剂。在第一个实验组中，将有机溶剂直接添加到粪样品。将粪样品(100μl)添加到含有250μl具有3％乙醇的PBS的eppendorf管，并涡旋振荡10秒。然后，将它们转移到含有无乙醇的提取缓冲液的挤压简易管。之后，遵循参照图1所述的方法提取DNA。在第二个实验组中，在裂解粪样品后添加乙醇。将粪样品(100μl)添加到含有无乙醇的提取缓冲液的挤压简易管，并且将过滤尖端在管的顶部折断。涡旋振荡挤压简易管，并从管中挤出约100μl裂解的样品。将3％的乙醇添加到100μl裂解的样品并涡旋振荡。将1滴裂解的样品(约25-30μL)在反应管中稀释，并在65℃温育3分钟。然后，将粗制DNA直接用于PCR扩增。在第三个实验组中，对提取缓冲液添加有机溶剂。遵循参考图1所述的方法用含有3％乙醇的提取缓冲液从粪样品中提取粗制DNA。
使用用上文提及的方法制备的粗制DNA和通过TwistDx制备的冻干材料以50μl体积进行RPA反应。在反应中使用靶向艰难梭菌毒素B基因的特异性引物和探针。使用AxxinT16荧光读数器检测来自DNA扩增的信号。在核酸提取期间在不同步骤添加乙醇使得从提取的DNA的扩增的信号强度没有差异；使用用不同程序提取的所有粗制DNA实现成功的扩增(如图10中显示)。
图10显示了可通过在核酸提取期间在不同步骤添加有机溶剂来消除扩增抑制剂。从人粪样品中提取粗制DNA。对提取缓冲液(实线)、稀释的粪样品(虚线)或粪样品裂解物(虚线)添加乙醇(3％)，然后在65℃温育3分钟。用艰难梭菌RPA测定法测量提取的DNA中艰难梭菌毒素B基因的扩增。结果指示使用本发明方法从人粪样品提取的DNA的质量和数量适用于PCR和等温扩增，并且可以在核酸提取之前，在提取期间或提取之后在PCR或等温反应缓冲液中稀释前应用有机溶剂处理。
实施例8
核酸提取缓冲液中乙醇的备选
测试一组有机溶剂作为要求保护的本发明中呈现的核酸提取缓冲液中乙醇的备选；实例包括丙酮、甲醇、异丙醇、丁醇和DMSO。通过使用参考图1描述的方法从两份(样品6654和6799)和两份阴性艰难梭菌样品(样品4268和6901)提取粗制DNA。在不添加有机溶剂的情况下从这四份样品制备的粗制DNA对扩增呈现强烈的抑制效应，导致内部对照的扩增失败(表1，第2栏)。使用每种有机溶剂置换提取缓冲液中的乙醇。采用艰难梭菌RPA测试来评估用不同有机溶剂提取的DNA的质量和数量。艰难梭菌RPA测试评分为(1)失败-检测不到的扩增信号，(2)受损-与对照相比更小的扩增子信号，或(3)标称的-类似于对照的扩增子。在已知的阳性样品的情况下，所有有机溶剂给出强烈的信号。(表1)。这些结果证明了可以在要求保护的本发明中使用有机溶剂，包括乙醇、丙酮、丁醇、DMSO，但不限于这些有机溶剂。
表1.在艰难梭菌RPA测定法中测试乙醇的备选
样品 无溶剂 乙醇 丙酮 DMSO 丁醇
4268(-) 无效 - - - -
6654(+) 无效 +++ ++ + +
6799(+) 无效 +++ +++ ++ +++
6901(-) 无效 - - - -
表2.用范围为0.5％至15％的乙醇浓度的DNA扩增。
Figure BDA0001239256140000151
此外，在提取缓冲液中已经测试了有机溶剂的不同浓度(0.5％至20％)。来自粗制DNA提取物(样品4和16)的艰难梭菌的gluD和tcdB基因的扩增没有显示显著的差异。实时PCR的Ct值对于用不同浓度的乙醇提取的粗制DNA是相似的(表2)。RPA结果显示了提取缓冲液中范围为0.5％至15％的乙醇浓度不干扰DNA扩增(表2)。
实施例9
在多重PCR和多重等温扩增中比较根据要求保护的本发明相对于自动化系统提取的核酸的质量和数量
通过使用要求保护的本发明中呈现的DNA提取缓冲液并且遵循就图1而言描述的程序从志贺毒素基因stx1和stx2阳性的临床粪样品中提取DNA。此外，从BiomerieuxNucliSENS easyMAG纯化的DNA充当对照。在多重PCR和多重RPA反应中利用靶向stx1和stx2基因的特异性引物。使用从那些样品提取的DNA，通过PCR仪在多重PCR中以及通过AxxinT16荧光读数器在多重RPA反应中检测stx1和stx2基因两者的扩增信号。使用要求保护的本发明中呈现的3％乙醇提取的DNA给出与从Bionerieux NucliSENS easyMAG纯化的DNA相同的stx1和stx2扩增信号。这指示通过使用要求保护的本发明的方法提取的粗制核酸的质量和数量等同于从Biomerieux NucliSENS easyMAG自动化仪器中纯化的DNA。
已经关于特定方面描述了本发明，其在所有方面都旨在是说明性的而不是限制性的。由于在不脱离本发明的范围的情况下可以对所要求保护的发明做出许多可能的方面，应当理解，本文中阐述的所有内容应被解释为说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明范围的情况下，替代方面对于本发明所属领域的普通技术人员将变得显而易见。
从上述内容可以看出，要求保护的发明是完全适合于实现上文阐述的所有目的和目标的发明。应当理解，某些特征和子组合是有用的，并且可以在不参考其它特征和子组合的情况下使用。这是预期的并且在权利要求书的范围内。

Claims (19)

1.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品；(b)在提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物，其中所述提取缓冲液包含：(i) 3 wt. %至10wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丙酮或乙醇中的一种或多种；或(ii) 0.5 wt. %至10wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丁醇；(c)在15℃至35℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步加工；(d)通过在65°C加热3至5分钟从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；(e)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分以形成扩增混合物；并且(f)在25℃至70℃将所述扩增混合物温育1至10分钟。
2.权利要求1的方法，其中所述生物样品包含一种或多种人样本、细菌、病毒、寄生物、粪样品、体液、植物或培养物。
3.权利要求1的方法，其中从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分包括用滤器过滤所述混合物。
4.权利要求3的方法，其中所述滤器具有50μm至250μm的孔径。
5.权利要求3的方法，其中所述滤器包括多孔塑料、多孔聚合纤维或多孔玻璃纤维中的一种或多种。
6.权利要求5的方法，其中所述滤器包括包埋有活性炭的玻璃纤维滤器。
7.权利要求1的方法，所述方法还包括在所述扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分之前，将丙酮或乙醇中的一种或多种添加至所述核酸的至少一部分以达到3 wt. %至10 wt. %的浓度，或者将丁醇添加至所述核酸的至少一部分以达到0.5至10wt.%的浓度。
8.权利要求7的方法，其中将丙酮或乙醇中的一种或多种添加至所述核酸的至少一部分包括将乙醇添加至所述核酸的至少一部分。
9.权利要求1的方法，其中所述扩增混合物在50°C-65°C的温度温育。
10.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂的添加能消除对加热、酶促消化、温育、分离、核酸沉淀或洗脱中的一种或多种的需要，其中所述加热是在95℃以上的温度进行。
11.权利要求1的方法，其中扩增反应缓冲液是适合于等温扩增、PCR、测序、基因型分型和杂交的缓冲液。
12.权利要求11的方法，其中等温扩增包括切口酶相关反应(NEAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增和滚环扩增。
13.权利要求1的方法，所述方法还包括在扩增反应中扩增所述核酸的至少一部分。
14.权利要求13的方法，其中使用具有有机溶剂的提取缓冲液但不加热完成所述扩增。
15.权利要求13的方法，其中使用具有有机溶剂的提取缓冲液在加热的情况下完成所述扩增。
16.权利要求1的方法，其中所述提取缓冲液包含用于核酸扩增的缓冲液。
17.权利要求7的方法，其中将丁醇添加至所述核酸的至少一部分。
18.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品，所述生物样品包括粪样品；(b)在提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物，其中所述提取缓冲液包含：(i) 3 wt. %至10 wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丙酮或乙醇中的一种或多种；或(ii) 0.5 wt. %至10 wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丁醇；(c)在15℃至35℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步加工；(d) 通过在65°C加热3至5分钟从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；并且(e)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述核酸的至少一部分以形成扩增混合物。
19.用于处理生物样品以提取核酸的方法，所述方法包括：(a)获得生物样品，所述生物样品包括粪、血液、唾液或尿液中的一种或多种；(b)在提取缓冲液中稀释所述生物样品以形成混合物，其中所述提取缓冲液包含：(i) 3 wt. %至10 wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丙酮或乙醇中的一种或多种；或(ii) 0.5 wt. %至10 wt. %有机溶剂，其中所述有机溶剂是丁醇；(c)在15℃至35℃的温度温育所述混合物5秒至30分钟，以从所述生物样品的至少一部分中提取存在于所述生物样品中的核酸以用于进一步加工；(d) 通过在65°C加热3至5分钟从所述生物样品中分离所述核酸的至少一部分；(e) 将丙酮或乙醇中的一种或多种添加至所述核酸的至少一部分以达到3 wt. %至10 wt. %的浓度，或者将丁醇添加至所述核酸的至少一部分以达到0.5至10wt.%的浓度，从而形成经处理的核酸；(f)在一种或多种扩增反应缓冲液中稀释所述经处理的核酸的所述至少一部分以形成扩增混合物；并且(g)在扩增反应中扩增所述核酸的至少一部分。
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