JP2017525383A - 阻害剤を除去するために有機溶媒を用いる核酸抽出 - Google Patents
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Abstract
Description
側面1
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て;(b)0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を、15℃〜35℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し;(d)核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し;(e)1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し;そして(f)増幅混合物を25℃〜70℃で1〜10分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み;(b)0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を15℃〜70℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し:(d)核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し;そして(e)1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の1またはそれより多くを含み;(b)生物学的試料を、0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を、15℃〜70℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し;(d)生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し;(e)有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、0.5〜20重量%の濃度まで添加して、処理核酸を形成し;(f)処理核酸の少なくとも一部を、1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し;そして(g)増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。
前記生物学的試料が、1またはそれより多いヒト標本、細菌、ウイルス、寄生虫、糞便試料、体液、植物、または培養物を含む、側面1記載の方法。
前記有機溶媒が、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、またはジメチルスルホキシド(DMSO)の1またはそれより多くを含む、側面1、2、または3記載の方法。
抽出緩衝液が3重量%〜10重量%の有機溶媒を含み、有機溶媒がエタノール、アセトン、またはその組み合わせを含む、側面1、2、または3記載の方法。
生物学的試料から核酸の少なくとも一部を分離する工程が、混合物をフィルターで濾過する工程を含む、側面1、2、または3記載の方法。
フィルターが50μm〜250μmの孔サイズを有する、側面1、2、または3記載の方法。
フィルターが多孔性プラスチック、多孔性ポリマー繊維、または多孔性ガラス繊維の1またはそれより多くを含む、側面1、2、または3記載の方法。
フィルターが、活性炭に包埋されたガラス繊維フィルターを含む、側面1、2、または3記載の方法。
前記生物学的試料を25℃〜70℃で3〜5分間インキュベーションする、側面1、2、または3記載の方法。
増幅反応緩衝液中で核酸の少なくととも一部を希釈する前に、核酸の少なくとも一部に、有機溶媒を、0.5〜20重量%の濃度まで添加する工程をさらに含む、側面1または2記載の方法。
有機溶媒を核酸の少なくとも一部に添加する工程が、エタノールを核酸の少なくとも一部に添加する工程を含む、側面12記載の方法。
前記インキュベーション温度が50℃〜65℃の間である、側面1、2、または3記載の方法。
有機溶媒の添加が、加熱、酵素消化、インキュベーション、分離、核酸沈殿、または溶出の1またはそれより多くの必要性を排除しうる、側面1、2、または3記載の方法。
前記加熱が95℃またはそれより高い温度である、側面15記載の方法。
側面17
増幅反応緩衝液が、等温増幅、PCR、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションに適した緩衝液である、側面1、2、または3記載の方法。
等温が、ニック形成酵素関連反応(NEAR)、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ仲介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法を含む、側面17記載の方法。
増幅反応において核酸の少なくとも一部を増幅する工程をさらに含む、側面1または2記載の方法。
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いるが、加熱を行わずに、増幅を行う、側面3または19記載の方法。
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いて、加熱を行い、増幅を行う、側面3または19記載の方法。
抽出緩衝液が、核酸増幅に用いる抽出緩衝液を含む、側面1、2、または3記載の方法。
核酸等温増幅の阻害剤を減少させるかまたは除去するための、有機溶媒を含むより低温の加熱に対する煮沸の比較
商業的なC.ディフィシレ試験を用いて、核酸抽出の記載する方法を評価した。等温増幅用に糞便標本から核酸を調製するため、煮沸、加熱なし、あるいは3%の有機溶媒を含むまたは含まない65℃を含む、異なる抽出条件を試験した。この試験は、図3に例示するように、ターゲット(tcdB遺伝子)および内部対照(IC)の増幅を含有する。図3Aは、列挙する条件下でのC.ディフィシレ陽性糞便試料(試料10233)から抽出した未精製DNAを用いた等温増幅を例示する。加熱ブロック上で反応を行い、そして増幅産物を1%アガロースゲル上で分離した。結果を図3A(試料10233)および3B(試料16)に提供する。DNAを加熱せずに調製した場合(レーン3)、tcdB遺伝子のアンプリコンはまったく観察されなかった(図3Aに例示するとおり)。図3Aにおいて、煮沸を用いることによって(レーン2)、3%エタノールを添加する(レーン4)か、または有機溶媒を添加せずに(レーン5)65℃で3分間加熱することによって、DNAを調製した場合、増幅DNA断片の強度は、ゲル中で同様であった。図3Bは、示す条件下で、試料16から抽出した未精製DNAを用いた等温増幅を示す。tcdB遺伝子の増幅を図3BのレーンA〜Cで調べた。内部対照の増幅を図3BのレーンD〜Fで評価した。増幅産物を1%アガロースゲル上で分離した。図3Bに示すように、試料16を、抽出緩衝液中の3%エタノールで、65℃で3分間処理した際、tcdB遺伝子および内部対照は、強い増幅を示した(図3B、レーンAおよびD)。しかし、試料16を、3%エタノールで加熱を伴わずに、または65℃の加熱のみで処理した際、tcdB増幅はまったく起こらなかった(図3B、レーンBおよびC)。この結果は、3%エタノールを、65℃で3〜5分間のインキュベーションと組み合わせたものが、DNA増幅のために標本から阻害を減少させる際、最適であり、そして煮沸に匹敵することを示した。いくつかの試料において、加熱工程を伴わない抽出緩衝液中の有機溶媒の添加は、煮沸法に比較した際、同じ量のアンプリコンを示す。
ヒト糞便試料を用いた、エタノールを含みまたは含まずに抽出した核酸の等温増幅
レコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)およびニック形成酵素関連反応(NEAR)等温増幅を用いて、核酸増幅に対する阻害効果を減少させる際の有機溶媒を評価した。未精製糞便DNAを、図1に示す方法にしたがって、C.ディフィシレ感染(CDI)患者から調製した。試料6654にはRPA C.ディフィシレ試験を用い、そして試料9637、9638、9648、9665、および9669にはNEAR C.ディフィシレ試験を適用した。3%エタノールの添加を伴いまたは伴わずに、抽出緩衝液を用い、そして65℃で5分間インキュベーションした。RPAおよびNEAR等温増幅を用いることによって、C.ディフィシレ毒素B遺伝子(tcdB)を抽出DNA試料から増幅した。Axxin T16蛍光読み取り装置を用いることによって、増幅産物の相対量(RFU:相対蛍光単位(Relative Fluorescence Unit))を測定した。図4および図5に結果を提供する。図4は、C.ディフィシレRPA等温増幅アッセイにおける未精製DNAの分析を例示する。3%エタノールを補充した抽出緩衝液(実線)または抽出緩衝液のみ(破線)を用いて、試料6654からDNAを抽出し、一方、図5は、NEAR等温増幅を用いて、糞便試料から抽出したDNAの分析を示す。抽出緩衝液中にエタノールを含まず(図5A)または含み(図5B)、5つの糞便試料(試料9637、9638、9648、9665、および9669)から未精製DNAを抽出した。Axxin T16蛍光読み取り装置を用いることによって、tcdBの増幅を測定した。図5中のNTCは、テンプレート不含対照を意味し、したがって、この反応にはテンプレートはまったく添加されなかった。
細菌および寄生虫を含有するヒト糞便試料を用いた、有機溶媒を伴いまたは伴わずに抽出したDNAの増幅の比較
本実施例で用いるヒト糞便試料は、C.ディフィシレ、志賀様毒素産生大腸菌(E. coli)、カンピロバクター属(Campylobacter)、H.ピロリ(H.pylori)、赤痢菌属(Shigella)、サルモネラ属(Salmonella)、ジアルディア属(Giardia)、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium)、およびE.ヒストリティカ(E. histolytica)に感染した患者由来であった。図1に関連して記載する方法を用いて、これらの臨床試料からDNAを抽出した。Biomerieux NucliSENS easyMAG自動化装置を用いることによってもまた、これらの試料からDNAを精製し、そして比較のための対照として用いた。PCR、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、およびニック形成酵素関連反応(NEAR)等温増幅を利用して、抽出核酸の品質および量を評価した。
IQパワーミックス(Bio−Rad)またはSYBRグリーナーマスターミックス(Life Technologies)のいずれかを用いて、20μl体積で試験管または96ウェルプレート中で、PCR反応を行った。各病原体に対する特異的プライマーおよび/またはプローブを反応に使用した。SYBRマスターミックスに関しては、PCR増幅後、融解曲線分析を行った。
Nt.BstNBI(New England Biolabs)およびBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)またはManta DNAポリメラーゼ(Enzymatics)を用いて、50μl体積中でNEAR反応を行った。C.ディフィシレ毒素B遺伝子、志賀毒素stx1遺伝子および志賀毒素stx2遺伝子をターゲティングする特異的プライマーおよびプローブを反応中で用いた。増幅シグナルを検出するため、Axxin T16蛍光読み取り装置を用いた。NEAR試験を用いた、C.ディフィシレ陽性糞便試料に関する例を実施例2に示している。
[0085]TwistDxによって調製された凍結乾燥材料を用いて、50μl体積中、RPA反応を行った。C.ディフィシレ毒素B遺伝子、志賀毒素stx1遺伝子、志賀毒素stx2遺伝子、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子、およびサルモネラ属invA遺伝子をターゲティングする特異的プライマーおよびプローブを反応中で用いた。増幅シグナルを検出するため、Axxin T16蛍光読み取り装置を用いた。低い割合の有機溶媒を用いることによって精製したDNA由来の毒素B遺伝子、志賀毒素stx1遺伝子、志賀毒素stx2遺伝子、カンピロバクター属16S rRNA遺伝子、およびサルモネラ属invA遺伝子の増幅シグナルは、煮沸法を用いることによって、または商業的核酸精製系、Biomerieux NucliSENS easyMAG自動化装置を用いることによって精製したDNAテンプレートと同じ強度を示した。サルモネラ属invA遺伝子(試料3、4、6、7、および8)および志賀毒素stx2遺伝子(試料3および12)に関するRPA試験を、図6および7に示す。図6は、糞便試料から抽出したDNAを用いたサルモネラ属RPA試験を示す。煮沸法(図6Aに例示するとおり)または65℃で3分間のインキュベーションを伴う3%エタノールを含有する抽出緩衝液(図6Bに例示するとおり)を用いて、5つのサルモネラ属陽性試料(試料3、4、6、7、および8)から未精製DNAを抽出した。DNA試料からのサルモネラ属invAの増幅曲線を示す。NTC:テンプレート不含対照。
DNAおよびRNAウイルスを含有する培養物およびヒト糞便試料を用いた、エタノールを伴いまたは伴わずに抽出した核酸の増幅の比較
ウイルス核酸抽出のための緩衝液および方法の効率を評価するため、本実施例を提供する。アデノウイルスおよびノロウイルス陽性臨床糞便試料を本実施例で用いた。図1に関連して記載する方法を用いて、これらの試料から核酸を抽出した。抽出核酸、およびアデノウイルスのヘキソン(hexon)遺伝子(カプシドタンパク質II)をターゲティングする特異的プライマーを用いて、リアルタイムPCRを実行して、アデノウイルス陽性試料から抽出した核酸の品質および量を評価した。アデノウイルス陽性試料から抽出した未精製DNAは、アデノウイルスカプシドタンパク質II遺伝子の非常に強い増幅を示した。リアルタイムPCRで、同じ量のDNAを用いた際、図1に関連して記載する方法を用いることによって精製されたDNAに関する閾値サイクル(Ct)値は、BioMerieux NucliSENS easyMAG自動化装置で精製したDNAとほぼ同じであった。
本明細書に開示する核酸調製法を植物組織に適用することも可能である
植物組織を用いて、本発明で提示する抽出緩衝液の能力を試験するために、本実施例を提供する。図9は、ベンサミアナタバコの葉から抽出した未精製DNAを用いたPCR増幅を例示する。本発明で記載する方法を用いて、未精製植物DNAを抽出した。アクチン遺伝子の増幅を実線で示す。点線は、テンプレート不含対照(NTC)を示す。ベンサミアナタバコ植物の葉から生体材料を得た。乳鉢を用いることによって、葉をすりつぶし、そして3%エタノールを含有する抽出緩衝液を用いて、スクイーズイージーチューブに移した(100μg)。チューブをボルテックスし、そして活性炭フィルターチップを通じて、500μlのPBSを含有する1.5mlエッペンドルフチューブ内に、緩衝液1滴を絞り出した。エッペンドルフチューブを65℃で3〜5分間インキュベーションした。抽出したDNA、およびベンサミアナタバコのアクチン遺伝子を特異的にターゲティングするプライマーを用いて、SmartCycler上でリアルタイムPCR分析を行った。植物アクチン遺伝子のPCR増幅の成功は、本発明に記載する方法で植物組織から抽出したDNAテンプレートを、PCR反応に使用可能であることを立証した(図9に例示するとおり)。
本明細書に開示するDNA抽出法を用いて、血液試料中の増幅阻害剤を排除するかまたは減少させることも可能である
血液によるDNA増幅の阻害を試験するため、本実施例を提供する。ヒト血液を5%の濃度でスパイク処理したC.ディフィシレ陽性臨床糞便試料をこの方法で用いた。抽出緩衝液および図1に関連して記載する方法を用い、スパイクした試料から抽出したDNAを用いて、等温反応を実行した。3%エタノールを含む抽出緩衝液を含有するスクイーズチューブに、血液試料スワブを添加して、そして刻み目のマーカーで、スワブを折った。活性炭フィルターチップをスクイーズチューブの最上部に配置した後、1滴の抽出緩衝液を反応チューブ外に絞り出した。反応チューブを65℃で3分間インキュベーションした後、50μlの抽出DNAをC.ディフィシレRPA反応に用いた。抽出核酸は、等温増幅反応において、tcdB遺伝子および内部対照を増幅可能であった。しかし、5%ヒト血液でスパイク処理した試料に関して、エタノールを含まない抽出緩衝液を用いた場合、未精製DNAからのC.ディフィシレのtcdB遺伝子および内部対照の増幅は、RPA試験において完全に抑制された。結果は、本発明が、血液試料から阻害剤を有効に除去したことを示す。
低い割合の有機溶媒を、核酸抽出プロセス中の、溶解工程前、溶解工程中、および溶解工程後に添加することも可能である
この方法で用いるヒト糞便試料は、C.ディフィシレに感染した患者由来であった。有機溶媒を、核酸抽出中の異なる工程で添加した。最初の実験群において、有機溶媒を糞便試料に直接添加した。3%エタノールを含む250μlのPBSを含有するエッペンドルフチューブに、糞便試料(100μl)を添加し、そして10秒間ボルテックスした。次いで、これらを、エタノールを含まない抽出緩衝液を含有するスクイーズイージーチューブに移した。その後、図1に関連して記載する方法にしたがって、DNAを抽出した。第二の実験群において、糞便試料を溶解した後に、エタノールを添加した。エタノールを含まない抽出緩衝液を含有するスクイーズイージーチューブに糞便試料(100μl)を添加し、そしてフィルターチップをチューブの最上部で折った。スクイーズイージーチューブをボルテックスし、そして約100μlの溶解試料をチューブから絞り出した。3%エタノールを100μlの溶解試料に添加し、そしてボルテックスした。溶解試料1滴(約25〜30μL)を反応チューブ中で希釈し、そして65℃で3分間インキュベーションした。次いで、未精製DNAを直接PCR増幅に用いた。第三の実験群において、有機溶媒を抽出緩衝液に添加した。図1に関連して記載する方法にしたがって、3%エタノールを含有する抽出緩衝液を用いて、糞便試料から未精製DNAを抽出した。
核酸抽出緩衝液におけるエタノールに対する代替物
本発明で提示する核酸抽出緩衝液中のエタノールに対する代替物として、有機溶媒群を試験した;例には、アセトン、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、およびDMSOが含まれる。2つの陽性(試料6654および6799)および2つの陰性C.ディフィシレ試料(試料4268および6901)から、図1に関連して記載する方法を用いることによって、未精製DNAを抽出した。これらの4つの試料から、有機溶媒の添加を伴わずに調製した未精製DNAは、増幅の強い阻害効果を提示し、内部対照の増幅失敗を生じた(表1、カラム2)。各有機溶媒を用いて、抽出緩衝液中のエタノールを置換した。C.ディフィシレRPA試験を使用して、異なる有機溶媒で抽出したDNAの品質および量を評価した。C.ディフィシレRPA試験を(1)失敗−検出可能な増幅シグナルなし、(2)損なわれた(compromised)−対照に比較してより少ないアンプリコンシグナル、または(3)満足できる(nominal)−対照と同様のアンプリコンとスコア付けした。すべての有機溶媒は、既知の陽性試料で強いシグナルを生じた(表1)。これらの結果は、エタノール、アセトン、ブタノール、DMSOを含むがこれらの有機溶媒に限定されない有機溶媒が、本発明で使用可能であることを立証する。
多重PCRおよび多重等温増幅における、自動化系に対する、本発明にしたがって抽出した核酸の品質および量の比較
志賀毒素遺伝子stx1およびstx2に関して陽性である臨床糞便試料から、本発明に提示するDNA抽出緩衝液を用い、そして図1に関して記載する方法にしたがうことによって、DNAを抽出した。さらに、Biomerieux NucliSENS easyMAGから精製したDNAが対照として働いた。stx1およびstx2遺伝子をターゲティングする特異的プライマーを多重PCRおよび多重RPA反応において利用した。これらの試料から抽出したDNAを用いて、stx1およびstx2遺伝子両方の増幅シグナルを、PCR装置によって多重PCRにおいて、そしてAxxin T16蛍光読み取り装置によって多重RPA反応において、検出した。本発明に提示する3%のエタノールを用いて抽出したDNAは、Bionerieux NucliSENS easyMAGから精製したDNAと同じ、stx1およびstx2の増幅シグナルを生じた。これは、本発明の方法を用いることによって抽出した未精製核酸の品質および量が、Biomerieux NucliSENS easyMAG自動化装置から精製したDNAと同等であることを示した。
Claims (22)
- 核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て;(b)0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を、15℃〜35℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し;(d)核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し;(e)1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し;そして(f)増幅混合物を25℃〜70℃で1〜10分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
- 前記生物学的試料が、1またはそれより多いヒト標本、細菌、ウイルス、寄生虫、糞便試料、体液、植物、または培養物を含む、請求項1の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、またはジメチルスルホキシド(DMSO)の1またはそれより多くを含む、請求項1の方法。
- 抽出緩衝液が3重量%〜10重量%の有機溶媒を含み、有機溶媒がエタノール、アセトン、またはその組み合わせを含む、請求項1の方法。
- 生物学的試料から核酸の少なくとも一部を分離する工程が、混合物をフィルターで濾過する工程を含む、請求項1の方法。
- フィルターが50μm〜250μmの孔サイズを有する、請求項5の方法。
- フィルターが多孔性プラスチック、多孔性ポリマー繊維、または多孔性ガラス繊維の1またはそれより多くを含む、請求項5の方法。
- フィルターが、活性炭に包埋されたガラス繊維フィルターを含む、請求項7の方法。
- 前記生物学的試料を25℃〜70℃で3〜5分間インキュベーションする、請求項1の方法。
- 増幅反応緩衝液中で核酸の少なくととも一部を希釈する前に、核酸の少なくとも一部に、有機溶媒を、0.5〜20重量%の濃度まで添加する工程をさらに含む、請求項1の方法。
- 有機溶媒を核酸の少なくとも一部に添加する工程が、エタノールを核酸の少なくとも一部に添加する工程を含む、請求項10の方法。
- 前記インキュベーション温度が50℃〜65℃の間である、請求項1の方法。
- 有機溶媒の添加が、加熱、酵素消化、インキュベーション、分離、核酸沈殿、または溶出の1またはそれより多くの必要性を排除しうる、請求項1の方法。
- 前記加熱が95℃またはそれより高い温度である、請求項13の方法。
- 増幅反応緩衝液が、等温増幅、PCR、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションに適した緩衝液である、請求項1の方法。
- 等温が、ニック形成酵素関連反応(NEAR)、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ仲介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法を含む、請求項15の方法。
- 増幅反応において核酸の少なくとも一部を増幅する工程をさらに含む、請求項1の方法。
- 有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いるが、加熱を行わずに、増幅を行う、請求項17の方法。
- 有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いて、加熱を行い、増幅を行う、請求項17の方法。
- 抽出緩衝液が、核酸増幅に用いる抽出緩衝液を含む、請求項1の方法。
- 核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み;(b)0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を15℃〜70℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し:(d)核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し;そして(e)1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
- 核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって:(a)生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の1またはそれより多くを含み;(b)生物学的試料を、0.5〜20重量%の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し;(c)混合物を、15℃〜35℃の温度で、5秒間〜30分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し;(d)生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し;(e)有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、0.5〜20重量%の濃度まで添加して、処理核酸を形成し;(f)処理核酸の少なくとも一部を、1またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し;そして(g)増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。
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