JPH11113573A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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- JPH11113573A JPH11113573A JP9284889A JP28488997A JPH11113573A JP H11113573 A JPH11113573 A JP H11113573A JP 9284889 A JP9284889 A JP 9284889A JP 28488997 A JP28488997 A JP 28488997A JP H11113573 A JPH11113573 A JP H11113573A
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- acid synthesis
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中の
ＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】本発明では、試料中の目的とする遺伝子を
増幅する核酸合成法において、核酸合成を行う前に、試
料を添加した遺伝子増幅反応液を耐熱酵素の熱安定性が
保たれる温度、例えば７０℃〜９０℃で５〜２０分処理
を行うことにより、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する。
ＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】本発明では、試料中の目的とする遺伝子を
増幅する核酸合成法において、核酸合成を行う前に、試
料を添加した遺伝子増幅反応液を耐熱酵素の熱安定性が
保たれる温度、例えば７０℃〜９０℃で５〜２０分処理
を行うことにより、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解
離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの
結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り
返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増
幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明で
ある特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられてい
る。ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法とし
て使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析
法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病や
ガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や
親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法
である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場
合が多い。
離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの
結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り
返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増
幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明で
ある特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられてい
る。ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法とし
て使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析
法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病や
ガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や
親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法
である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場
合が多い。
【０００３】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが広く知られている。
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが広く知られている。
【０００４】そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立
って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝
子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体
から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法として
は、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝
子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体
から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法として
は、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
【０００５】最近では核酸抽出の過程において、イオン
交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタ
ンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタ
ンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定
しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とり
わけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、
うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作
が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーション
の機会が高い。
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定
しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とり
わけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、
うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作
が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーション
の機会が高い。
【０００７】従って、これらの問題点を解決するために
は、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれ
る。
は、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれ
る。
【０００８】我々は以前、ＰＣＲ反応液中のｐＨを上昇
させること（特願平8ー238112号）または、ＰＣＲ反応液
中にポリアミンを添加すること（特願平6ー146500号）に
より、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのものと遺
伝子増幅反応液を混合し、ＰＣＲを行うことが可能であ
ることを見いだした。しかし、この方法を用いた場合に
おいても、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのもの
の種類によっては、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制しきれ
ず、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させることができな
い場合があることが見いだされた。
させること（特願平8ー238112号）または、ＰＣＲ反応液
中にポリアミンを添加すること（特願平6ー146500号）に
より、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのものと遺
伝子増幅反応液を混合し、ＰＣＲを行うことが可能であ
ることを見いだした。しかし、この方法を用いた場合に
おいても、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのもの
の種類によっては、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制しきれ
ず、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させることができな
い場合があることが見いだされた。
【０００９】そこで、本発明は、更に改良を加え、試料
の種類に関係なく、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、
試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供
することを目的とする。
の種類に関係なく、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、
試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供
することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法において、核酸合成を行う前に、試料を添加した
遺伝子増幅反応液を耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度
で熱処理を行うことを特徴とする。
決するため、試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法において、核酸合成を行う前に、試料を添加した
遺伝子増幅反応液を耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度
で熱処理を行うことを特徴とする。
【００１１】本発明において、試料は生体由来試料中の
遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生
体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、
遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体
液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血
液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定され
るものではない。
遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生
体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、
遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体
液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血
液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定され
るものではない。
【００１２】遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメ
チルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加され
る場合がある。
びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメ
チルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加され
る場合がある。
【００１３】ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hy
droxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー
（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの
間の濃度で使用される。
ル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hy
droxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー
（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの
間の濃度で使用される。
【００１４】プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
【００１５】耐熱酵素は、プライマー付加による核酸を
合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味す
る。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして
逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるもの
ではない。
合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味す
る。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして
逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるもの
ではない。
【００１６】遺伝子増幅反応液のｐＨは、２５℃の温度
条件下で８．１以上、好ましくは８．１〜９．５であ
る。更に好ましくは、例えば血液から分離した白血球で
直接ＰＣＲを行う場合は、ｐＨ９．０付近、赤血球の溶
血等の前処理を施すことなく、血液試料でＰＣＲを行う
場合には、ｐＨ８．８付近、唾液試料より直接ＰＣＲを
行う場合には、ｐＨ９．４付近とすることがよい。
条件下で８．１以上、好ましくは８．１〜９．５であ
る。更に好ましくは、例えば血液から分離した白血球で
直接ＰＣＲを行う場合は、ｐＨ９．０付近、赤血球の溶
血等の前処理を施すことなく、血液試料でＰＣＲを行う
場合には、ｐＨ８．８付近、唾液試料より直接ＰＣＲを
行う場合には、ｐＨ９．４付近とすることがよい。
【００１７】また、本発明では、遺伝子増幅反応液にポ
リアミンを添加してもよい。ポリアミンとは、第１級も
しくは第２級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称
で、具体的には、例えばエチレンジアミン、トリメチレ
ンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレント
リアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペ
ンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、1、4ービス(3ー ア
ミノプロピル）ー ピぺラジン、1ー（2ーアミノエチル）ピ
ペラジン等が挙げられる。ポリアミンの添加量は、ポリ
アミンの種類や試料の種類、濃度等により異なるが、通
常遺伝子増幅反応液中１０〜０．０１ｍＭ程度、好まし
くは２〜０．５ｍＭ程度が良い。
リアミンを添加してもよい。ポリアミンとは、第１級も
しくは第２級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称
で、具体的には、例えばエチレンジアミン、トリメチレ
ンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレント
リアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペ
ンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、1、4ービス(3ー ア
ミノプロピル）ー ピぺラジン、1ー（2ーアミノエチル）ピ
ペラジン等が挙げられる。ポリアミンの添加量は、ポリ
アミンの種類や試料の種類、濃度等により異なるが、通
常遺伝子増幅反応液中１０〜０．０１ｍＭ程度、好まし
くは２〜０．５ｍＭ程度が良い。
【００１８】耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度とは、
前記耐熱酵素の活性が保持される温度で、好ましくは７
０〜９０℃、更に好ましくは７２〜９０℃である。加熱
時間は、熱処理温度にもよるが、５〜２０分、好ましく
は５〜１５分である。
前記耐熱酵素の活性が保持される温度で、好ましくは７
０〜９０℃、更に好ましくは７２〜９０℃である。加熱
時間は、熱処理温度にもよるが、５〜２０分、好ましく
は５〜１５分である。
【００１９】なお、本発明で“核酸合成を行う前”と
は、試料に遺伝子増幅反応液を添加する前、後のいずれ
も指すが、遺伝子増幅反応液の添加後の方が好ましい。
は、試料に遺伝子増幅反応液を添加する前、後のいずれ
も指すが、遺伝子増幅反応液の添加後の方が好ましい。
【００２０】また、本発明の核酸合成法（ＰＣＲ）の手
順は、核酸合成を行う前に熱処理を行う以外、通常の方
法と変わらない。
順は、核酸合成を行う前に熱処理を行う以外、通常の方
法と変わらない。
【００２１】
（実験例１）ＰＣＲ反応液（47.5μｌ）に抗凝固剤（ED
TA-2K またはHeparin-Na）で処理したヒト血液を2.5 μ
ｌ添加し、60℃、72℃または80℃で熱処理を行った後、
ＰＣＲを行った。ＰＣＲのプライマーはＨＬＡ−ＤＰ遺
伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌ
クレオチド（Ｐ１）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリ
ゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、配列は次の通りであ
る。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、28
0bp の増幅産物を得ることができる。
TA-2K またはHeparin-Na）で処理したヒト血液を2.5 μ
ｌ添加し、60℃、72℃または80℃で熱処理を行った後、
ＰＣＲを行った。ＰＣＲのプライマーはＨＬＡ−ＤＰ遺
伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌ
クレオチド（Ｐ１）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリ
ゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、配列は次の通りであ
る。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、28
0bp の増幅産物を得ることができる。
【００２２】 Ｐ１：５’ＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＣ３’ Ｐ２：５’ＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣ３’ ＰＣＲ反応液には、pH8.9 に調節した10mM Tris-HCl, 3
5mM KCl,1.5mM MgCl2, 200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びd
TTP, 1.0 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA
ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Jap
an）反応液を用いた。
5mM KCl,1.5mM MgCl2, 200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びd
TTP, 1.0 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA
ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Jap
an）反応液を用いた。
【００２３】ＰＣＲは、９４℃、４分３０秒のプレヒー
ティングの後、９４℃ ３０秒間、５８℃ １分間、７
２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃ ７
分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、
反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、
０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tri
s-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検
出した。
ティングの後、９４℃ ３０秒間、５８℃ １分間、７
２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃ ７
分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、
反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、
０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tri
s-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検
出した。
【００２４】抗凝固剤処理ヒト血液（2 サンプル）を直
接添加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分
間熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気
泳動図を図１に示す。図中Ａ１またはＡ２はHeparin-Na
処理血、Ｂ１またはＢ２はEDTA-2K 処理血（１、２はサ
ンプルナンバー）を示し、１は６０℃、２は７２℃、３
は８０℃の温度でＰＣＲ前に熱処理を行った時、４は熱
処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を
示している。また、Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断
した250ng のφ X174-RF DNA）を示している。
接添加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分
間熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気
泳動図を図１に示す。図中Ａ１またはＡ２はHeparin-Na
処理血、Ｂ１またはＢ２はEDTA-2K 処理血（１、２はサ
ンプルナンバー）を示し、１は６０℃、２は７２℃、３
は８０℃の温度でＰＣＲ前に熱処理を行った時、４は熱
処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を
示している。また、Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断
した250ng のφ X174-RF DNA）を示している。
【００２５】結果、６０℃の熱処理を行った場合では熱
処理を行わなかった場合に比べて、１例において、若干
のＰＣＲ増幅産物の増量が認められたにすぎなかった
（Ａ２−1 vs Ａ２−4 ）。一方、７２℃と８０℃の熱
処理では、熱処理を行わなかった時と比べて、多量の特
異的なＰＣＲ増幅産物が認められた。
処理を行わなかった場合に比べて、１例において、若干
のＰＣＲ増幅産物の増量が認められたにすぎなかった
（Ａ２−1 vs Ａ２−4 ）。一方、７２℃と８０℃の熱
処理では、熱処理を行わなかった時と比べて、多量の特
異的なＰＣＲ増幅産物が認められた。
【００２６】（実験例２）本例は、実験例１で最も増幅
効率の良かった熱処理温度８０℃とさらに高い９０℃
で、５分、１５分、３０分間熱処理を行った後、ＰＣＲ
を行った実験である。試料は実験例１で使用したＡ１お
よびＢ１血液を用いた。また用いたＰＣＲ反応液の組成
およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験
例１と同様である。
効率の良かった熱処理温度８０℃とさらに高い９０℃
で、５分、１５分、３０分間熱処理を行った後、ＰＣＲ
を行った実験である。試料は実験例１で使用したＡ１お
よびＢ１血液を用いた。また用いたＰＣＲ反応液の組成
およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験
例１と同様である。
【００２７】種々の温度、時間で熱処理を行い、ＰＣＲ
を行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図２に示し
た。図中Ｉは８０℃、IIは９０℃の熱処理温度を示し、
１は１５分、２は１０分、３は５分の熱処理を、４は熱
処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を
示している。
を行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図２に示し
た。図中Ｉは８０℃、IIは９０℃の熱処理温度を示し、
１は１５分、２は１０分、３は５分の熱処理を、４は熱
処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を
示している。
【００２８】結果、Heparin-Na 処理血（Ａ１）を用い
た場合には、熱処理を行わなかった場合において、ＰＣ
Ｒ増幅産物が検出出来なかった（Ａ１−4 ）が、熱処理
を行った場合、80℃、90℃いずれの温度で５〜15分いず
れの時間熱処理した場合においても、明瞭なＰＣＲ産物
が検出できた。一方、EDTA-2K 処理血（Ｂ１）を用いた
場合には、熱処理を行わなかった場合（Ｂ１−4 ）に比
べ、熱処理を行った場合、いずれの温度、いずれの時間
で熱処理した場合においてもＰＣＲ増幅産物の増量が認
められた。
た場合には、熱処理を行わなかった場合において、ＰＣ
Ｒ増幅産物が検出出来なかった（Ａ１−4 ）が、熱処理
を行った場合、80℃、90℃いずれの温度で５〜15分いず
れの時間熱処理した場合においても、明瞭なＰＣＲ産物
が検出できた。一方、EDTA-2K 処理血（Ｂ１）を用いた
場合には、熱処理を行わなかった場合（Ｂ１−4 ）に比
べ、熱処理を行った場合、いずれの温度、いずれの時間
で熱処理した場合においてもＰＣＲ増幅産物の増量が認
められた。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、核酸の分離・精製の過程
を経ずに、血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料か
ら、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能
となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成
の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会
の軽減が可能となった。
を経ずに、血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料か
ら、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能
となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成
の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会
の軽減が可能となった。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＣ
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣ
【図１】抗凝固剤処理ヒト血液（2 サンプル）を直接添
加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分間熱
処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動
図
加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分間熱
処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動
図
【図２】種々の温度、時間で熱処理を行い、ＰＣＲを行
ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図
ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図
Claims (5)
- 【請求項１】試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法において、核酸合成を行う前に、試料を添加した
遺伝子増幅反応液を耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度
で熱処理を行うことを特徴とする核酸合成法。 - 【請求項２】熱処理を７０℃〜９０℃で５〜２０分行う
ことを特徴とする請求項１記載の核酸合成法。 - 【請求項３】遺伝子増幅反応液がpH8.１以上に調節され
ている請求項１記載の核酸合成法。 - 【請求項４】遺伝子増幅反応液にポリアミンが添加され
ている請求項１記載の核酸合成法。 - 【請求項５】試料が生体由来試料中の遺伝子包含体もし
くは生体由来試料である請求項１〜４に記載の核酸合成
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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