JP4470275B2 - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4470275B2 JP4470275B2 JP2000127276A JP2000127276A JP4470275B2 JP 4470275 B2 JP4470275 B2 JP 4470275B2 JP 2000127276 A JP2000127276 A JP 2000127276A JP 2000127276 A JP2000127276 A JP 2000127276A JP 4470275 B2 JP4470275 B2 JP 4470275B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acid
- pcr
- acid synthesis
- blood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction :以下PCRと略す)法による核酸合成法に関する。
【0002】
【従来の技術】
PCR法は、DNA鎖の1本鎖への解離、DNA鎖の特定の領域をはさんでプライマーの結合、DNAポリメラーゼの作用によるDNA合成反応を繰り返すことによって、目的のDNA断片を数十万倍にも増幅できる方法である。PCR法は、マリス氏らの発明である特開昭61−274697号に述べられている。
【0003】
PCR法は、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、PCR法は、感染症や遺伝病やガンの診断・モニタリング等に利用される。さらに、PCR法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報に基づいた医療等でのDNAタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【0004】
PCR法の1つの欠点は色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されることである。すなわち、代表的な耐熱性DNAポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のTaqDNAポリメラーゼをはじめ、多くのDNAポリメラーゼは、微量の生体由来の夾雑物がPCR反応液中に混在しても、PCRが強く阻害されることが広く知られている。 そこで、PCR法によるDNA増幅に先立つて被験物から細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等(以下、遺伝子包含体と称する)を分離し、次に、その遺伝子包含体から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【0006】
血液等の体液・尿等の液性の排泄物試料は静置しておくとその細胞・菌体成分等の固形成分が沈降し、目的とする核酸を含有する細胞・菌体等の不均一化が起こる。そのためそれら試料を用いて直接核酸増幅する時には試料添加前にあらかじめ撹拌操作を行い試料中の固形成分を均質に分布させる必要があった。
【0007】
遺伝子検査のための検査材料としては、末梢血液が用いられる場合が多い。我々は血液中の目的とする核酸を直接増幅できる核酸合成法を提供する方法をこれまでに考案してきた。しかし、全血試料は放置しておくと血球・菌体成分等が沈降し、目的とする遺伝子を含有した血球・菌体等の不均一化が起こる。そのため血液試料を直接PCRするときには添加操作前にあらかじめ撹拌操作を行い均質に分布させる必要があった。 また、体液および液性の排泄物試料を直接PCRに用いる時も同様の操作が必要であった。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本件発明者は、界面活性剤で試料を処理しそのまま核酸合成の鋳型として保存・使用することを発明した。本発明は、特に血液等の体液および尿等の液性の排泄物そのものと核酸増幅反応液を混合し反応させる核酸合成法において、反応前に試料を界面活性剤で処理し、たとえば核酸を含む固形成分を破壊し、試料液中に均一に分散させる場合に有効である。また、これによって殺菌・殺ウイルス等の効果が期待され、生体試料を取り扱う時に懸念される作業者の生体試料からの感染の危険を低減することができる。
すなわち、本発明は、試料から目的の核酸を増幅する核酸合成法において、生体由来試料を均質化した後、直接反応液に添加して核酸を増幅することを特徴とする核酸合成法である。
ここで、「均質化」とは、核酸を試料液中に均一に分散させることをいう。また、「直接」とは、均質化以外の前処理が不要という意味である。
【0009】
均質化には、界面活性剤を用いるのが好ましい。界面活性剤には陰イオン性界面活性剤・陽イオン性界面活性剤・両性界面活性剤・非イオン性界面活性剤がある。短時間内で核酸増幅に供する場合はこれらのどれを用いてもよい。陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤の具体例は、後述するが、陽イオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド等、両性界面活性剤としては、例えば、CHAPS、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート等を用いることができる。
【0010】
しかし、時間経過とともに凝集物が出現し、核酸の試料液内での不均質化がおこる。それを解決するためさらに鋭意検討したところ陰イオン性界面活性剤を一定の濃度で使用することで凝集物が生じることを回避する事が出来た。 例えば、血液試料をドデシル硫酸塩(以下総称としてSDSという)やサルコシル、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤で処理することによって均質化をはかる。その際、試料を長期間安定的に均質状態で保存するためにはSDS・サルコシルの濃度は、試料液中に0.5%以上、好ましくは2%程度混入するのがよい。
【0011】
しかし、イオン性界面活性剤で処理した試料を通常使用されている標準的な反応液に直接添加してPCRを行っても、強い反応阻害が認められる。そこでさらに、この反応阻害を抑制する方法を鋭意検討したところ非イオン性の界面活性剤を反応に使用することによりこの反応阻害を抑制できることを見出した。非イオン性の界面活性剤としてはNonidet P40、Tween20、ジギトニン、n-ドデシルマルトシド、オクチルグリコシド、オクチルチオグリコシド、Triton X-100、ラウリル酸シュクロース、Tethit等が使用できるが、これに限定されるものではない。使用するNonidet P40、Tween20は増幅反応液中にそれぞれ0.5%以上、好ましくは1から5%存在するのがよい。
非イオン性界面活性剤はイオン性界面活性剤で均質化した試料液と混合してから反応液に添加してもあらかじめ反応液に添加しておいてもよく、特に添加の順序を規定しない。
【0012】
また、本発明による試料の均質化を行えば、試料の長期保存が可能となる。したがって、本発明は、生体由来試料を均質化して保存することを特徴とする試料の保存法をも提供する。保存期間は、試料の種類、均質化を行う界面活性剤の種類、濃度、保存条件などによっても変わるが、例えば、血液試料を陰イオン性界面活性剤で処理する場合は、室温においても数年間の保存が可能となる。
【0013】
本発明において、試料は生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等をいう。体液には血液、髄液、乳、唾液が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれ、細胞には血液中の白血球・血小板が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0014】
核酸増幅反応液は、通常、pH緩衝液並びにMgCl2、KCl等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加される場合がある。
pH緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、CAPSO(3ーNーCyclohexylamino −2 −hydroxypropanesulfonic acid )あるいはCHES(2ー(Cyclohexylamino )ethanesulfonic acid )と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合わせによるpH緩衝液等種々のpH緩衝液が使用され得る。pH調整された緩衝液は、核酸増幅反応液の中で10mMから100mMの間の濃度で使用される。
【0015】
プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
【0016】
核酸合成酵素は、デオキシリボヌクレオチド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、E.coliのDNAポリメラーゼI、E.coliのDNAポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4DNAポリメラーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、T.litoralisDNAポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
【0017】
また、本発明では核酸増幅反応液のpHを調節することにより、相乗効果が得られる。例えば、pHは、25℃の温度条件下で8.1以上、好ましくは8.5〜9.5である。
また、本発明では、核酸増幅反応液にポリアミンを添加してもよい。
【0018】
【実施例】
[実験例1]
本例は、血液試料を終濃度2%のサルコシルで処理したものを直接添加PCRを行った実験である。試料はクエン酸処理ヒト血液を用いた。種々の血液濃度の溶解処理液2μlを直接PCR反応液に添加し(全50μl)、PCRを行った。PCR反応液は、10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2 , 各200μM のdATP, dCTP, dGTP及びdTTP, 2.5% Nonidet P40, 各0.4μM のprimer, 1.25 units のTaq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用いた。 なお、PCRのプライマーはヒトbeta-globin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド(GH20:配列番号1)及び minus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド(GH21:配列番号2)であり、PCRにより 408bpの増幅産物を得ることができる(Saiki,R.K., Gelfand,D.H., Stoffel,S., Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 239,487-491.) 。
GH20:5′GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3′
GH21:5′GGAAAATAGACCAATAGGCAG3′
【0019】
PCRは、94℃、4.5分間のプレヒーティングの後、94℃ 1分間、55℃1分間、72℃ 1分間の条件で40サイクル、最後に72℃ 7分間のポリメライゼーションを行った。PCR終了後、反応液5μlを用いて、2.5%アガロースを含む、0.5μg/ml臭化エチジウム添加TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【0020】
溶解液で処理した試料を直接PCR反応液に添加し、PCRを行った時のPCR産物の電気泳動図を図1に示す。
図中Mは分子量マーカー、1は処理液中の血液含有量が1/2のもの、2は処理液中の血液含有量が1/4のもの、以下同様に3〜12は血液量が2倍づつ段階希釈された処理液を添加してPCRを行った結果を示す。なおNは血液不含の2%のサルコシル液を添加したものである。
図より、1〜12で安定的かつ高感度に検出できることがわかる。
【0021】
[実験例2]
本例は、血液試料を終濃度2%のサルコシルで処理したものを室温で10ヶ月間保存した後、直接添加PCRを行った実験である。試料はクエン酸処理ヒト血液を用いた。種々の血液濃度の溶解処理液2μlを直接PCR反応液に添加し(全50μl)、PCRを行った。 反応に用いたPCR反応液の組成、PCRの条件、PCR後の電気泳動の条件は実験例1と同様である。 電気泳動図を図2に示す。
【0022】
図中Mは分子量マーカー、1は処理液中の血液含有量が1/2のもの、2は処理液中の血液含有量が1/4のもの、以下同様に3〜12は血液量が2倍づつ段階希釈された処理液を添加してPCRを行った結果を示す。なおNは血液不含の2%のサルコシル液を添加したものである。
図より、溶解処理後、長期間保存した場合でも図1の場合と同様に安定的かつ高感度にPCR産物が検出できることがわかる。
【0023】
なお、本実施例では非イオン性界面活性剤を用いているが、血液溶解処理液のPCR反応液への添加量を減らすことで非イオン性界面活性剤非存在下でも安定的にPCRを行うことが可能であり必ずしも必須ではない。
【0024】
【発明の効果】
本発明によれば、反応前に試料を界面活性剤で処理し、核酸を含有する細胞・菌体等の固形成分を破壊し、試料液中に均一に分散させることができるので、試料をあらかじめ攪拌操作を行い試料中の固形成分を均質に分布させる必要がない。また、本発明によれば、試料の長期保存が可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】溶解液で処理した試料を直接PCR反応液に添加して、PCRを行ったときの増幅産物の電気泳動図
【図2】溶解液で処理した試料を長期保存した後、直接PCR反応液に添加して、PCRを行ったときの増幅産物の電気泳動図
Claims (5)
- 試料から目的の核酸を増幅する核酸合成法において、生体由来試料に陰イオン性界面活性剤を混入させることのみにより前記生体由来試料を均質化した後、直接反応液に添加して核酸を増幅することを特徴とする核酸合成法。
- 陰イオン性界面活性剤がサルコシル、ドデシル硫酸塩である請求項1記載の核酸合成法。
- 均質化した試料を非イオン性界面活性剤を含む反応液で核酸合成することを特徴とする請求項1記載の核酸合成法。
- 非イオン性界面活性剤としてTween20 及び/又は Nonidet P40を用いることを特徴とする請求項3記載の核酸合成法。
- 試料から目的の核酸を増幅する核酸合成用の試料の保存方法であって、保存した試料を直接反応液に添加して核酸を増幅する核酸合成法用の試料の保存方法であり、生体由来試料に陰イオン性界面活性剤を混入させることのみにより前記生体由来試料を均質化して保存することを特徴とする、試料の保存法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000127276A JP4470275B2 (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | 核酸合成法 |
US09/818,583 US6767723B2 (en) | 2000-04-27 | 2001-03-28 | Method for synthesis of nucleic acids |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000127276A JP4470275B2 (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | 核酸合成法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001299356A JP2001299356A (ja) | 2001-10-30 |
JP4470275B2 true JP4470275B2 (ja) | 2010-06-02 |
Family
ID=18636901
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000127276A Expired - Lifetime JP4470275B2 (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | 核酸合成法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6767723B2 (ja) |
JP (1) | JP4470275B2 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030134292A1 (en) * | 2001-10-30 | 2003-07-17 | Farchaus Joseph W. | Thermostable DNA polymerases and methods of making same |
JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | G&Gサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
WO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-02 | G & G Science Co., Ltd. | 緩衝剤組成物 |
CA2543033A1 (en) * | 2003-10-16 | 2005-04-28 | Third Wave Technologies, Inc. | Direct nucleic acid detection in bodily fluids |
WO2006050499A2 (en) * | 2004-11-03 | 2006-05-11 | Third Wave Technologies, Inc. | Single step detection assay |
JP5292722B2 (ja) * | 2007-05-09 | 2013-09-18 | 凸版印刷株式会社 | 未精製血液をサンプルとする核酸増幅法 |
KR101419980B1 (ko) | 2008-03-15 | 2014-07-15 | 홀로직, 인크. | 증폭 반응 도중에 핵산 분자를 분석하기 위한 조성물 및 방법 |
EP4249603A3 (en) | 2011-06-08 | 2024-01-03 | Life Technologies Corporation | Design and development of novel detergents for use in pcr systems |
WO2012170907A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
EP4083230A1 (en) | 2011-07-06 | 2022-11-02 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens |
US9593369B2 (en) | 2011-10-05 | 2017-03-14 | Spartan Bioscience Inc. | Direct nucleic acid analysis |
CN106458885B (zh) | 2013-10-25 | 2019-12-10 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用 |
EP3387107B1 (en) | 2015-12-11 | 2020-08-12 | Spartan Bioscience Inc. | Tube sealing system and methods for nucleic acid amplification |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2194843T3 (es) * | 1992-09-11 | 2003-12-01 | Hoffmann La Roche | Deteccion de acidos nucleicos en sangre. |
-
2000
- 2000-04-27 JP JP2000127276A patent/JP4470275B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-28 US US09/818,583 patent/US6767723B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2001299356A (ja) | 2001-10-30 |
US6767723B2 (en) | 2004-07-27 |
US20020142402A1 (en) | 2002-10-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6992182B1 (en) | Method for isolating DNA from biological materials | |
JP4470275B2 (ja) | 核酸合成法 | |
WO2004072230A2 (en) | Real-time polymerase chain reaction using large target amplicons | |
JP7067483B2 (ja) | 改変された耐熱性dnaポリメラーゼ | |
US20040126796A1 (en) | Extraction of DNA from biological samples | |
JP2001029078A (ja) | Rna増幅法 | |
US6962780B2 (en) | Method for synthesis of nucleic acids | |
CN100429307C (zh) | 核酸检测方法及其系统 | |
Tüzmen et al. | Techniques for nucleic acid engineering: The foundation of gene manipulation | |
Matheson et al. | Genetic sex identification of 9400-year-old human skull samples from Çayönü Tepesi, Turkey | |
JPH09238687A (ja) | 核酸合成法 | |
JPH1080280A (ja) | 核酸合成法 | |
JP4186269B2 (ja) | 核酸合成法 | |
EP0751226B1 (en) | Process for amplifying nucleic acid sequences | |
JP4186270B2 (ja) | 核酸合成法 | |
JP4503712B2 (ja) | 核酸合成法 | |
EP0989192A2 (en) | Method for synthesis of nucleic acids | |
JP7433217B2 (ja) | Rnaウイルスの処理方法 | |
JP3724321B2 (ja) | 核酸合成法 | |
JP4639629B2 (ja) | 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 | |
JP4629167B2 (ja) | 核酸合成法 | |
JP2001008685A (ja) | 核酸合成法 | |
JP2003310265A (ja) | 核酸抽出法 | |
JP4187057B2 (ja) | 核酸合成法 | |
Zaorska et al. | Multiplexed SNP Typing of DNA after Demineralization and Organic Extraction from a Bone |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091117 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100115 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100209 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100222 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4470275 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140312 Year of fee payment: 4 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |