CN104928402A - 荧光定量pcr检测核酸分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR检测核酸分子方法，包括如下步骤：针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本，混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。该检测方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。与传统的方法相比，该检测方法具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。

Description

荧光定量PCR检测核酸分子的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种荧光定量PCR检测核酸分子的方法。
背景技术
随着人类文明持续向前推进，各种病毒接踵而来，从乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV，到冠状SARS病毒，再到近年的甲型流感H1N1、H3N2，禽流感H5N1、H7N9、H9N2，手足口病毒EV71、CA16等，每一次病毒爆发和流行都严重威胁到人类的健康，生存及发展，造成重大财产损失。
病毒的检测是人们在与病毒的斗争中重要的技术，当前，病毒检测技术主要包括病原学、免疫学、分子生物学三个方面。其中，荧光定量PCR检测具有很高的特异性、灵敏性和重复性，已广泛用于甲型流感、禽流感等病毒的诊断。但是，传统的荧光定量PCR检测方法通常以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，而从样本中提取核酸分子步骤操作复杂。
发明内容
基于此，有必要提供一种无需从样本中提取核酸分子的荧光定量PCR检测核酸分子的方法。
一种荧光定量PCR检测核酸分子方法，包括如下步骤：
针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针；
将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本；
将所述混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，所述PCR反应预混液包括所述特异性扩增引物和所述探针；以及
将所述反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
在一个实施例中，所述探针为Taqman探针。
在一个实施例中，将所述混合样本预热的操作中，所述预热的温度为55℃～70℃，所述预热的时间为10min～15min。
在一个实施例中，所述蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。
在一个实施例中，所述蛋白质变性液中，异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
在一个实施例中，所述待检测样本与所述蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
在一个实施例中，所述PCR反应预混液还包括PCR反应缓冲溶液和反应酶系；
所述PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20和硫酸镁；
所述待检测样本中的病毒核酸分子为DNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和BSA；所述待检测样本中的病毒核酸分子为RNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
在一个实施例中，所述Tris-HCl在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～65mmol/L；
所述硫酸铵在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～20mmol/L；
所述氯化钾在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/L～80mmol/L；
所述Tween 20与所述PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
所述硫酸镁在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为2mmol/L～5mmol/L；
所述Taq DNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的Taq DNA聚合酶；
所述逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶。
在一个实施例中，所述待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种；
所述待检测样本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠状SARS病毒、甲型流感H1N1病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
在一个实施例中，所述禽流感病毒为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；所述手足口病毒为EV71和CA16中的至少一种。
上述荧光定量PCR检测核酸分子方法，针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，并将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放；混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。该检测方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。同时，PCR反应预混液中含有特异性扩增引物和探针，探针随病毒核酸分子扩增产生荧光信号，根据荧光信号可实时检测PCR过程。与传统的方法相比，该检测方法无需从样本中提取核酸分子，直接进行荧光定量PCR检测，具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。特别是，当检测样本较少时，由于不需要从样本中提取和纯化DNA，该方法也可实现核酸分子的检测。
附图说明
图1为一实施方式的荧光定量PCR检测核酸分子方法的流程图；
图2a为实施例1中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图；
图2b为实施例1中内标的荧光定量PCR检测图；
图3a为实施例1中平行检测10管含相同浓度HBV病毒核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图；
图3b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测10管含HBV的样本的荧光定量PCR检测图；
图4a为实施例1中平行检测8管含相同浓度HBV核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图；
图4b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测8管含HBV的样本的荧光定量PCR检测图；
图5a为实施例2中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图；
图5b为实施例2中内标的荧光定量PCR检测图；
图6a为实施例2中平行检测10管含相同浓度EV71核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图；
图6b为实施例2中采用本发明提供的方法平行检测10管含EV71的样本的荧光定量PCR检测图；
图7a为实施例2中平行检测8管含相同浓度EV71核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图；
图7b为实施例2中采用本发明提供的方法平行检测8管含EV71的样本的荧光定量PCR检测图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对荧光定量PCR检测核酸分子方法作进一步详细的说明。
如图1所示的一实施方式的荧光定量PCR检测核酸分子方法，包括如下步骤：
S110、针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针。
引物的设计可遵循以下原则：引物序列可选取待检测的病毒核酸分子的序列保守区，不能有碱基变异；检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；引物的TM值(解链温度)为60℃左右，上游引物和下游引物之间的TM值相差一般不超过2℃；引物长度一般为18～25bp。
探针的设计可遵循以下原则：探针位置尽可能地靠近上游引物；探针的TM值为70℃左右，通常比引物的TM值高5～10℃；探针长度一般为15～45bp；探针的5’端应避免使用G(鸟嘌呤)，因为5'的G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用，影响定量；整条探针中，C(胞嘧啶)的含量要明显高于G(鸟嘌呤)的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
一般的，为确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在序列分析软件中分析二级结构，并用Blast分析特异性，如果发现有非特异性互补区，需要重新设计引物和探针。
待检测样本中的病毒可以为乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠状SARS病毒、甲型流感H1N1病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
具体的，禽流感病毒可以为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；手足口病毒可以为EV71和CA16中的至少一种。
具体的，探针可以为带有荧光基团的物质，如Taqman探针。TaqMan探针是一种寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
在一个实施方式中，针对HBV病毒S基因序列(Sequence ID:gb|JQ707731)保守区设计特异性引物和探针，上游引物HBV-F的序列为SEQ ID No.1所示的序列，下游引物HBV-R的序列为SEQ ID No.2所示的序列，探针HBV-P的序列为SEQ ID No.3所示的序列。其中，探针HBV-P的5'端标记FAM荧光发生基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。用于内标检测的探针HBV-IC的序列为SEQ IDNo.4所示的序列。其中，探针HBV-IC的5'端标记HEX荧光发生基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。
HBV的内标的序列为SEQ ID No.5所示的序列，将HBV的内标序列插入到pUC18T载体从而构成重组体。
在一个实施方式中，针对EV71病毒序列保守区5’UTR(Sequence ID:gb|KP266572.1|)设计特异性引物和探针，上游引物EV71-F的序列为SEQ ID No.6所示的序列；下游引物EV71-R的序列为SEQ ID No.7所示的序列；探针EV71-P的序列为SEQ ID No.8所示的序列。其中，探针EV71-P的5'端标记FAM荧光发生基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。用于内标检测的探针EV71-IC序列为SEQ ID No.9所示的序列。其中，探针EV71-IC的5'端标记HEX荧光发生基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。EV71的内标的序列为SEQ ID No.10所示的序列，将EV71的内标插入到pUC18T载体从而构成重组体。
S120、将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本。
待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种，可以从血样、口腔或鼻腔拭子、咽拭子、尿液、疱疹内渗出物和粪便拭子中采集得到。
在一个实施方式中，待检测样本中的病毒核酸分子为DNA，如含乙肝病毒HBV核酸分子的血清样本。
在另一个实施方式中，待检测样本中的病毒核酸分子为RNA，如含手足口病毒EV71核酸分子的咽拭子样本。
一般的，如需要提高检测的灵敏度，可以通过离心等操作对将待检测样本进行浓缩。
蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
蛋白质变性液中，异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。其中，柠檬酸钠的pH为7.0，β-巯基乙醇和异硫氰酸胍协同抑制RNase活性，异硫氰酸胍将RNase变性，暴露出RNase活性中心的二硫键，β-巯基乙醇打开二硫键，从而抑制其活性。
优选的，蛋白酶K为现配现用，蛋白酶K在蛋白质变性液中的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
一般的，如果待检测样本中的病毒核酸分子为RNA，蛋白质变性液中还可以加入RNase抑制剂以保护核酸避免RNA降解。
具体的，待检测样本与蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
在一个实施方式中，待检测样本与蛋白质变性液的体积比为1：2。
待检测样本与蛋白质变性液混合后，蛋白质变性液中的异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，在蛋白质变性液的作用下，待检测样本中的蛋白发生裂解，使样本中的核酸分子释放出来，省去了从样本中提取核酸分子步骤。由于不需要从样本中提取和纯化DNA，当检测样本较少时，本方法也可实现核酸分子的检测。
S130、将S120中得到的混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，PCR反应预混液包括S110中的特异性扩增引物和探针。
优选的，预热的操作中，预热的温度为55℃～70℃，预热的时间为10min～15min。预热有助于待检测样本与蛋白质变性液反应充分，提高检测的效率。
PCR反应预混液包括针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，以及PCR反应缓冲溶液和反应酶系。
具体的，PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20和硫酸镁，其中各组分的浓度如下：
Tris-HCl在PCR反应缓冲溶液中的浓度为10mmol/L～65mmol/L；
硫酸铵在PCR反应缓冲溶液中的浓度为10mmol/L～20mmol/L；
氯化钾在PCR反应缓冲溶液中的浓度为40mmol/L～80mmol/L；
Tween 20与PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
硫酸镁在PCR反应缓冲溶液中的为2mmol/L～5mmol/L。
优选的，Tris-HCl在25℃条件下，pH为8.2～8.4。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，40mmol/L～80mmol/L的氯化钾能促进引物退火，Tween 20属于非离子表面活性剂，可以中和样本中抑制PCR反应的干扰物质，提高检测的灵敏度和精密度。
具体的，待检测样本中的病毒核酸分子为DNA时，反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和BSA；待检测样本中的病毒核酸分子为RNA时，反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
优选的，BSA在PCR反应体系中的终浓度为0.3mg/mL～0.5mg/mL。
优选的，Taq DNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的Taq DNA聚合酶(例如，GoTaq FlexiDNA聚合酶TM；Promaga目录号M8295)，该Taq DNA聚合酶可以耐受样本中PCR抑制剂的干扰，提高检测的灵敏度和精密度。
优选的，逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶(例如，Super M-MuLV Reverse Transcriptase；FAPON，目录号MD028)。
在一个实施方式中，待检测样本中的病毒核酸分子为DNA，加入的反应酶系为1μL的5U/μL Taq DNA聚合酶、0.4μL的25mM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各25mM)和0.2μL的100mg/mL BSA。
在另一个实施方式中，待检测样本中的病毒核酸分子为RNA，加入的反应酶系为1μL的5U/μL Taq DNA聚合酶、0.4μL的25mM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各25mM)、0.2μL的100mg/mL BSA、0.4μL的200U/μL逆转录酶和RNasin。
一般的，混合样本与PCR反应预混液混合，一般会在得到的反应液中加入一定量的超纯水，得到PCR反应体系。
优选的，待检测样本的体积占PCR反应体系的5～40％，其中，待检测样本的体积占PCR反应体系的5～10％时效果最佳。
在一个实施例中，PCR反应体系为50μL，待检测样本的体积为5μL，蛋白质变性液的体积为10μL。
S140、将S130中得到的反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
采用荧光定量PCR仪，可实时检查PCR扩增过程，具有敏感性高，需要量品少、特异性高，精确性好的特点。
在一个实施例中，荧光定量PCR仪为Lightcycler 480II荧光PCR仪，待检测样本中的病毒核酸分子为DNA，如含乙肝病毒HBV病毒核酸分子的血清样本，将样本与蛋白质变性液混合预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，置于PCR仪中，进行PCR反应，反应条件为：
a.95℃，5min；
b.95℃，10s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤进行45个循环。
在另一个实施例中，荧光定量PCR仪为Lightcycler 480II荧光PCR仪，待检测样本中的病毒核酸分子为RNA，如含手足口病毒EV71病毒核酸分子的咽拭子样本，将样本与蛋白质变性液混合预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，置于PCR仪中，进行PCR反应，反应条件为：
a.50℃，15min；
b.95℃，5min；
c.95℃，15s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤进行50个循环。
本发明提供的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其中步骤S110和步骤S120可以调换顺序，即设计特异性扩增引物和探针的步骤与将待检测样本与蛋白质变性液混合的步骤先后顺序调换不影响本发明的实质内容。
上述荧光定量PCR检测核酸分子方法，针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，并将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放；混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。该检测方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。同时，PCR反应预混液中含有特异性扩增引物和探针，探针随病毒核酸分子扩增产生荧光信号，根据荧光信号可实时检测PCR过程。与传统的方法相比，该检测方法无需从样本中提取核酸分子，直接进行荧光定量PCR检测，具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。特别是，当检测样本较少时，由于不需要从样本中提取和纯化DNA，该方法也可实现核酸分子的检测。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，均为按照本领域内常规技术条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为普通市售产品。
以下实施例中，以不含病毒核酸分子的样本为阴性对照(Negative control，NTC)、以提取后含相同浓度病毒核酸分子的纯核酸为阳性对照(Positive control，PC)、同时在体系中加入内标(Internal control,IC)。通过比较阴性对照、阳性对照以及内标的Ct值(Ct value，即荧光值达到阈值时的PCR循环次数)、检出率和变异系数(Coefficient of variation，CV)进行方法评估。具体如下面所述：
如果阴性对照(NTC)的Ct值是0，且内标(IC)的Ct值≤38，那么对照有效；
如果阳性对照(PC)的Ct值是0，那么该检测方法被视为无效；
如果阴性对照(NTC)的Ct值是0，阳性对照的Ct值≤40但≠0，且用本发明的方法检测的Ct值≤40但≠0，那么检测视为有效；
在检测结果有效的前提下，比较阳性对照和用本发明提供的方法检测的灵敏度检出率和精密度，具体情况如下：
a.如果本发明提供的检测方法和阳性对照的灵敏度检出率一致，或本发明提供的检测方法检出率更高，同时精密度检测CV≤3％，或与阳性对照检测结果无明显差异，说明本发明提供的检测方法有效；
b.如果本发明提供的检测方法灵敏度检出率明显低于阳性对照，或精密度检测CV≥3％，或精明度检测与阳性对照检测结果差异较明显，说明本发明提供的检测方法无效或仍须进一步优化。
以下为具体实施例。
实施例1 含DNA病毒核酸分子的样本检测
采集含乙肝病毒HBV病毒核酸分子的血清样本，以不含HBV病毒核酸分子的阴性血清为阴性对照(NTC)、以提取后含相同浓度HBV病毒核酸分子的纯核酸为阳性对照(PC)，同时在体系中加入HBV的内标。预设PCR反应体系为50μL，反应液包括试剂(1)和试剂(2)两部分。
试剂(1)：待检测样本与蛋白质变性液，将待检测样本(含HBV核酸分子的血清)与蛋白质变性液以体积比为1：2混合均匀，预设PCR反应体系50μL，待检测样本占PCR反应体系的10％，即待检测样本体积为5μL，蛋白质变性液为10μL，混合后65℃预热10min～15min。蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。蛋白酶K为现配现用，蛋白酶K在蛋白质变性液中的的浓度为3mg/mL。
试剂(2)：PCR反应预混液，将5×PCR反应缓冲液、HBV和内标(IC)的特异性引物和Taqman探针、dNTPS、Taq DNA聚合酶(GoTaq FlexiDNA聚合酶TM；Promaga目录号M8295)、BSA按表1中的体积比混合均匀。
PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20和硫酸镁，其中各组分的浓度如下：
Tris-HCl在PCR反应缓冲溶液中的浓度为60mmol/L，在25℃条件下，pH为8.2～8.4；
硫酸铵在PCR反应缓冲溶液中的浓度为12.5mmol/L；
氯化钾在PCR反应缓冲溶液中的浓度为60mmol/L；
Tween 20与PCR反应缓冲溶液的体积比为0.5：100；
硫酸镁在PCR反应缓冲溶液中的浓度为3.5mmol/L。
将试剂(1)和试剂(2)混合，补水至总反应体积为50μL，具体见表1所示。
将预热后的试剂(1)加入试剂(2)中混合均匀，补水至总反应体积为50μL，在Lightcycler 480II荧光PCR仪上进行热循环反应，反应条件为：
a.95℃，5min；
b.95℃，10s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤须进行50个循环。
荧光PCR检测结果如图2a、图2b、图3a、图3b、图4a和图4b所示。图2a为实施例1中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图，由图2a可以看出，阴性对照(不含HBV病毒核酸分子的阴性血清，NTC)的Ct值是0，阳性对照(提取后含相同浓度HBV病毒核酸分子的纯核酸，PC)的Ct值≤40但≠0。图2b为实施例1中内标的荧光定量PCR检测图，由图2b可以看出，内标IC的Ct值≤38。由图2a、图2b可看出，阴性对照(NTC)的Ct值是0，阳性对照(PC)的Ct值≤40但≠0，且内标(IC)的Ct值≤38，说明检测方法有效。
图3a为实施例1中平行检测10管含相同浓度HBV核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图，核酸浓度为50IU/mL，由图3a可以看出10管样品全部检出，Ct值分别为38.19、39.05、38.90、39.43、39.44、38.32、37.91、39.27、38.73、38.26，检出率为10/10。图3b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测10管含HBV的样本的荧光定量PCR检测图，由图3b可以看出10管样品全部检出，Ct值分别为38.52、38.19、39.05、37.53、37.60、38.90、37.39、39.27、38.73、37.91，检出率为10/10。由图3a和图3b可以看出，两者的灵敏度检出率无明显差异。
图4a为实施例1中平行检测8管含相同浓度HBV病毒核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图，Ct值分别为28.40、28.43、28.40、28.28、28.34、28.36、28.31、28.59，8个平行管间变异系数CV为0.45％。图4b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测8管含HBV的样本的荧光定量PCR检测图，Ct值分别为28.53、28.66、28.58、28.49、28.55、28.47、28.22、28.51，8个平行管间变异系数CV为0.34％。由图4a和图4b可以看出，两者的精密度检测无明显差异，且采用本发明提供的方法检测的8个平行管间变异系数CV为0.34％，小于3％，说明本发明提供的检测方法具有较好的精密度。
由图2a、图2b、图3a、图3b、图4a和图4b可以看出，本发明提供的检测方法能够有效的检测含DNA病毒核酸分子的样本，且检测的灵敏度高，精密度好。
实施例2 含RNA病毒核酸分子的样本检测
采集含手足口病毒EV71病毒核酸分子的咽拭子样本，以不含EV71病毒核酸分子的生理盐水为阴性对照(NTC)、以提取后含相同浓度EV71病毒核酸分子的纯核酸为阳性对照(PC)，同时在体系中加入EV71的内标。为了提高该检测样本的灵敏度，预先将咽拭子溶于生理盐水，离心后取样。预设PCR反应体系为50μL，反应液包括试剂(1)和试剂(2)两部分：
试剂(1)：待检测样本与蛋白质变性液，将待检测样本(含EV71核酸分子的咽拭子样本)与蛋白变性液以1:2混合均匀，预设PCR反应体系50μL，待检测样本占PCR反应体系的10％，即待检测样本体积为5μL，蛋白质变性液为10μL，混合后65℃预热10min～15min。蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。蛋白酶K为现配现用，蛋白酶K在蛋白质变性液中的的浓度为3mg/mL。
试剂(2)：PCR反应预混液，将5×PCR反应缓冲液、EV71和内标(IC)的特异性引物和Taqman探针、dNTPS、Taq DNA聚合酶(GoTaq FlexiDNA聚合酶TM；Promaga目录号M8295)、BSA、逆转录酶(Super M-MuLV ReverseTranscriptase；FAPON，目录号MD028)按一定比例混合均匀。
将试剂(1)和试剂(2)混合，补水至总反应体积为50μL具体见表2所示。
将预热后的试剂(1)加入试剂(2)中混合均匀，补水至总反应体积为50μL，在Lightcycler 480II荧光PCR仪上进行热循环反应，反应条件为：
a.50℃，15min；
b.95℃，5min；
c.95℃，15s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤须进行50个循环。
荧光PCR检测结果如图5a、图5b、图6a、图6b、图7a和图7b所示。图5a为实施例2中阴性对照和阳性对照的荧光定量PCR检测图，由图2a可以看出，阴性对照(不含EV71病毒核酸分子的生理盐水，NTC)的Ct值是0，阳性对照(提取后含相同浓度EV71病毒核酸分子的纯核酸，PC)的Ct值≤40但≠0。图5b为实施例2中内标的荧光定量PCR检测图，由图5b可以看出，内标IC的Ct值≤38。由图5a、图5b可看出，阴性对照(NTC)的Ct值是0，阳性对照(PC)的Ct值≤40但≠0，且内标IC的Ct值≤38，说明检测方法有效。
图6a为实施例2中平行检测10管含相同浓度EV71病毒核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图，由图6a可以看出10管样品全部检出，Ct值分别为39.00、39.02、37.62、38.60、37.48、37.61、38.62、38.44、38.49、38.64，检出率为10/10。图6b为实施例1中采用本发明提供的方法平行检测10管含EV71的样本的荧光定量PCR检测图，由图6b可以看出10管样品全部检出，Ct值分别为38.60、37.60、38.71、38.56、37.42、39.33、38.51、37.67、38.66、39.14，检出率为10/10。由图6a和图6b可以看出，两者的灵敏度检出率无明显差异。
图7a为实施例2中平行检测8管含相同浓度EV71病毒核酸分子的纯核酸的荧光定量PCR检测图，Ct值分别为30.28、30.28、30.24、30.20、30.27、30.31、30.35、30.21，8个平行管间变异系数CV为0.17％。图7b为实施例2中采用本发明提供的方法平行检测8管含EV71的样本的荧光定量PCR检测图，Ct值分别为30.21、29.93、29.94、29.85、30.24、30.31、30.36、30.40，8个平行管间变异系数CV为0.72％。由图7a和图7b可以看出，两者的精密度检测无明显差异，且采用本发明提供的方法检测的8个平行管间变异系数CV为0.72％，小于3％，说明本发明提供的检测方法具有较好的精密度。
由图5a、图5b、图6a、图6b、图7a和图7b可以看出，本发明提供的检测方法能够有效的检测含RNA病毒核酸分子的样本，且检测的灵敏度高，精密度好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，包括如下步骤：
针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针；
将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本；
将所述混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，所述PCR反应预混液包括所述特异性扩增引物和所述探针；以及
将所述反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述探针为Taqman探针。
3.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，将所述混合样本预热的操作中，所述预热的温度为55℃～70℃，所述预热的时间为10min～15min。
4.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述蛋白质变性液中，异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述待检测样本与所述蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
7.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述PCR反应预混液还包括PCR反应缓冲溶液和反应酶系；
所述PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20和硫酸镁；
所述待检测样本中的病毒核酸分子为DNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和BSA；所述待检测样本中的病毒核酸分子为RNA时，所述反应酶系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
8.根据权利要求7所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述Tris-HCl在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～65mmol/L；
所述硫酸铵在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～20mmol/L；
所述氯化钾在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/L～80mmol/L；
所述Tween 20与所述PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
所述硫酸镁在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为2mmol/L～5mmol/L；
所述Taq DNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的Taq DNA聚合酶；
所述逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶。
9.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种；
所述待检测样本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠状SARS病毒、甲型流感H1N1病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的荧光定量PCR检测核酸分子方法，其特征在于，所述禽流感病毒为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；所述手足口病毒为EV71和CA16中的至少一种。
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