CN105463130A - 荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法 - Google Patents

荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，包括如下步骤：针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本，混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。该检测方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。与传统的方法相比，该检测方法具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。

Description

荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法。
背景技术
随着人类文明持续向前推进，各种病毒接踵而来，同一疾病可以是不同的病毒感染，同一病毒的不用亚型可能出现不同的临床表征。从乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV，再到近年的甲型流感H1N1、H3N2，禽流感H5N1、H7N9、H9N2，手足口病毒EV71、CA16等，每一次病毒爆发和流行都严重威胁到人类的健康，给病毒的检测带来极大的困扰。
病毒的检测是人们在与病毒的斗争中重要的技术，荧光定量PCR检测由于其很高的特异性、灵敏性和重复性，目前已广泛用于甲型流感、禽流感等病毒的诊断。但是，传统的荧光定量PCR检测方法通常以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，单通道检测的制约无法区分病毒种类及亚型，导致检测周期长且感染的多病毒或针对同一病毒的不同亚型区分结果不明确。
发明内容
基于此，有必要提供一种无需从样本中提取核酸分子并且可以同时检测多重病毒或同一病毒的不同亚型的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法。
一种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，包括如下步骤：
提供特异性扩增引物和探针，所述异性扩增引物选自第一组引物、第二组引物和第三组引物中的两种或三种，所述第一组引物、所述第二组引物和所述第三组引物分别针对不同种类的病毒或同种病毒的不同亚型的序列保守区设计，所述探针选自第一探针、第二探针和第三探针中的两种或三种，所述第一探针对应于所述第一组引物，所述第二探针对应于所述第二组引物，所述第三探针对应于所述第三组引物；
将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本；
将所述混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，所述PCR反应预混液包括所述特异性扩增引物和所述探针；以及
将所述反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
在一个实施例中，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针均为Taqman探针，并且所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的5’端分别标记了不同种类的荧光基团。
在一个实施例中，将所述混合样本预热的操作中，所述预热的温度为55℃～70℃，所述预热的时间为10min～15min。
在一个实施例中，所述蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。
在一个实施例中，所述蛋白质变性液中，所述异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，所述柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，所述十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，所述蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
在一个实施例中，所述待检测样本与所述蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
在一个实施例中，所述PCR反应预混液还包括PCR反应缓冲溶液和反应酶系；
所述PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween20和硫酸镁；
所述反应酶系包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
在一个实施例中，所述Tris-HCl在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～65mmol/L；
所述硫酸铵在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～20mmol/L；
所述氯化钾在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/L～80mmol/L；
所述Tween20与所述PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
所述硫酸镁在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为2mmol/L～5mmol/L；
所述TaqDNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的TaqDNA聚合酶；
所述逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶。
在一个实施例中，所述待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种；
所述待检测样本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、甲型流感H1N1病毒、甲型流感H3N2病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
在一个实施例中，所述禽流感病毒为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；所述手足口病毒为EV71和CA16中的至少一种。
上述荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，针对检测两种或三种不同病毒或同一病毒不同亚型的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，不同的探针序列采用不同的荧光基团标记，并将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放；混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。同时，PCR反应预混液中含有多组特异性扩增引物和探针，不同荧光基团标记的探针随病毒核酸分子扩增产生荧光信号不同。与传统的方法相比，这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法无需从样本中提取核酸分子，直接进行荧光定量PCR检测，且在同一反应体系中可以区分不同的病毒或同一病毒的不同亚型，具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。特别是，当检测样本较少时，由于不需要从样本中提取和纯化DNA，这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法也可实现核酸分子的检测。
附图说明
图1为一实施方式的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法的流程图；
图2为实施例1中优化前的荧光定量PCR检测图；
图3为实施例1中优化后的荧光定量PCR检测图；
图4为实施例2中采用优化好的反应液和反应条件含有EV71病毒的阳性咽拭子样本的荧光定量PCR检测图；
图5为实施例2中采用优化好的反应液和反应条件含有CoxA16病毒的阳性咽拭子样本的荧光定量PCR检测图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法作进一步详细的说明。
如图1所示的一实施方式的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，包括如下步骤：
S110、提供特异性扩增引物和探针。
异性扩增引物选自第一组引物、第二组引物和第三组引物中的两种或三种，第一组引物、第二组引物和第三组引物分别针对不同种类的病毒或同种病毒的不同亚型的序列保守区设计。
探针选自第一探针、第二探针和第三探针中的两种或三种，第一探针对应于第一组引物，第二探针对应于第二组引物，第三探针对应于第三组引物。
引物的设计可遵循以下原则：引物序列可选取待检测的病毒核酸分子的序列保守区，不能有碱基变异；检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；引物的TM值(解链温度)为60℃左右，上游引物和下游引物之间的TM值相差一般不超过2℃；引物长度一般为18～25bp。
探针的设计可遵循以下原则：探针位置尽可能地靠近上游引物；探针的TM值为70℃左右，通常比引物的TM值高5～10℃；探针长度一般为15～45bp；探针的5’端应避免使用G(鸟嘌呤)，因为5'的G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用，影响定量；整条探针中，C(胞嘧啶)的含量要明显高于G(鸟嘌呤)的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
一般的，为确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在序列分析软件中分析二级结构，并用Blast分析特异性，如果发现有非特异性互补区，需要重新设计引物和探针。
待检测样本中的病毒可以为乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、甲型流感H1N1病毒、甲型流感H3N2病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
禽流感病毒可以为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；手足口病毒可以为EV71和CA16中的至少一种。
具体的，探针可以为带有荧光基团的物质，如Taqman探针。TaqMan探针是一种寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
引发手足口病的肠道病毒有20多种，但其中主要的致病病毒是柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)，针对手足口病的主要致病病毒，采用免核酸提取的多重直扩q(RT)-PCR技术进行检测。
具体的，在检测手足口病毒的多重检测体系中，针对EV71和CoxA16以及内标，共设计了三组引物探针，且针对不同的探针序列标记不同的荧光基团。针对CoxA16病序列保守区设计特异性引物探针。
第一组引物和第一探针针对EV71病毒设计。第一组引物包括上游引物CA16-F(序列如SEQIDNo.1所示)和下游引物CA16-R(序列如SEQIDNo.2所示)。第一探针为探针CA16-P，序列如SEQIDNo.3所示，并且探针CA16-P的5'端标记JOE荧光发生基团，探针CA16-P的3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。
第二组引物和第二探针针对EV71病毒序列保守区5’UTR(SequenceID:gb|KP266572.1|)设计。第二组引物包括上游引物EV71-F(序列如SEQIDNo.4所示)和下游引物EV71-R(序列如SEQIDNo.5所示)。第二探针为探针EV71-P，序列如SEQIDNo.6所示，并且探针EV71-P的5'端标记FAM荧光基团，探针EV71-P的3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。
内标用于体系监测，内标选择EV71竞争性内标，内标的扩增引物与第一组引物的序列相同，用于内标检测的探针IC-P的序列如SEQIDNo.7所示，探针IC-P的5'端标记HEX荧光发生基团，探针IC-P的3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。
具体的，EV71竞争性内标为将如SEQIDNo.8所示的序列插入到pUC18T载体而构成的重组体。
S120、将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本。
待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种，可以从血样、口腔或鼻腔拭子、咽拭子、尿液、疱疹内渗出物和粪便拭子中采集得到。
一般的，如需要提高检测的灵敏度，可以通过离心等操作对将待检测样本进行浓缩。
蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
蛋白质变性液中，异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。其中，柠檬酸钠的pH为7.0，β-巯基乙醇和异硫氰酸胍协同抑制RNase活性，异硫氰酸胍将RNase变性，暴露出RNase活性中心的二硫键，β-巯基乙醇打开二硫键，从而抑制其活性。
优选的，蛋白酶K为现配现用，蛋白酶K在蛋白质变性液中的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
一般的，如果待检测样本中的病毒核酸分子为RNA，蛋白质变性液中还可以加入RNase抑制剂以保护核酸避免RNA降解。
具体的，待检测样本与蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
在一个实施方式中，待检测样本与蛋白质变性液的体积比为1：2。
待检测样本与蛋白质变性液混合后，蛋白质变性液中的异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，在蛋白质变性液的作用下，待检测样本中的蛋白发生裂解，使样本中的核酸分子释放出来，省去了从样本中提取核酸分子步骤。由于不需要从样本中提取和纯化DNA，当检测样本较少时，本方法也可实现核酸分子的检测。
S130、将S120中得到的混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，PCR反应预混液包括S110中的特异性扩增引物和探针。
优选的，预热的操作中，预热的温度为55℃～70℃，预热的时间为10min～15min。预热有助于待检测样本与蛋白质变性液反应充分，提高检测的效率。
PCR反应预混液包括针对待检测样本中的病毒核酸分子的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，以及PCR反应缓冲溶液和反应酶系。
本实施方式中，PCR反应预混液还包括内标的扩增引物和探针IC-P。
具体的，PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween20和硫酸镁，其中各组分的浓度如下：
Tris-HCl在PCR反应缓冲溶液中的浓度为10mmol/L～65mmol/L；
硫酸铵在PCR反应缓冲溶液中的浓度为10mmol/L～20mmol/L；
氯化钾在PCR反应缓冲溶液中的浓度为40mmol/L～80mmol/L；
Tween20与PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
硫酸镁在PCR反应缓冲溶液中的为2mmol/L～5mmol/L。
优选的，Tris-HCl在25℃条件下，pH为8.2～8.4。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，40mmol/L～80mmol/L的氯化钾能促进引物退火，Tween20属于非离子表面活性剂，可以中和样本中抑制PCR反应的干扰物质，提高检测的灵敏度和精密度。
具体的，反应酶系包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
优选的，BSA在PCR反应体系中的终浓度为0.3mg/mL～0.5mg/mL。
优选的，TaqDNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的TaqDNA聚合酶(例如，GoTaqFlexiDNA聚合酶TM；Promaga目录号M8295)，该TaqDNA聚合酶可以耐受样本中PCR抑制剂的干扰，提高检测的灵敏度和精密度。
优选的，逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶(例如，SuperM-MμLVReverseTranscriptase；FAPON，目录号MD028)。
在一个实施方式中，加入的反应酶系为1μL的5U/μLTaqDNA聚合酶、0.4μL的25mMdNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各25mM)、0.2μL的100mg/mLBSA、0.4μL的200U/μL的逆转录酶和0.5μL的40U/μLRNasin。
一般的，混合样本与PCR反应预混液混合，一般会在得到的反应液中加入一定量的超纯水，得到PCR反应体系。
优选的，待检测样本的体积占PCR反应体系的5～40％，其中，待检测样本的体积占PCR反应体系的5～10％时效果最佳。
在一个实施例中，PCR反应体系为50μL，待检测样本的体积为5μL，蛋白质变性液的体积为10μL。
S140、将S130中得到的反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
采用荧光定量PCR仪，可实时检查PCR扩增过程，具有敏感性高，需要量品少、特异性高，精确性好的特点。
在一个实施例中，荧光定量PCR仪为ABI7500荧光PCR仪，待检测样本为咽拭子，将样本与蛋白质变性液混合预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，置于PCR仪中，进行PCR反应，反应条件为：
a.50℃，15min；
b.95℃，5min；
c.95℃，15s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤进行50个循环。
本发明提供的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其中步骤S110和步骤S120可以调换顺序，即设计特异性扩增引物和探针的步骤与将待检测样本与蛋白质变性液混合的步骤先后顺序调换不影响本发明的实质内容。
上述荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，针对检测两种或三种不同病毒或同一病毒不同亚型的序列保守区设计特异性扩增引物和探针，不同的探针序列采用不同的荧光基团标记，并将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得待检测样本中的病毒核酸分子释放；混合样本预热后与PCR反应预混液混合并置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法不需要以纯化的核酸分子(DNA或RNA)为模板，待检测样本在蛋白质变性液的作用下，样本中的病毒核酸分子释放，省去了从样本中提取核酸分子步骤。同时，PCR反应预混液中含有多组特异性扩增引物和探针，不同荧光基团标记的探针随病毒核酸分子扩增产生荧光信号不同。与传统的方法相比，这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法无需从样本中提取核酸分子，直接进行荧光定量PCR检测，且在同一反应体系中可以区分不同的病毒或同一病毒的不同亚型，具有实验操作简单，可缩短检测周期，节约检测成本，易于进行高通量检测的优点。特别是，当检测样本较少时，由于不需要从样本中提取和纯化DNA，这种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法也可实现核酸分子的检测。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，均为按照本领域内常规技术条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为普通市售产品。
实施例1
优化反应体系。
分别采集含有EV71病毒的阳性咽拭子样本、含有CoxA16病毒的阳性咽拭子样本以及含有EV71病毒和CoxA16病毒的阳性咽拭子样本，以不含手足口病毒核酸分子的生理盐水为阴性样本，用于该技术的调试采用含有EV71病毒和CoxA16病毒的阳性咽拭子样本对反应液进行优化，采用含有EV71病毒的阳性咽拭子样本和含有CoxA16病毒的阳性咽拭子样本进行验证，预设PCR反应体系为50μL，优化后的反应液包括试剂(1)和试剂(2)两部分：
试剂(1)：待检测样本与蛋白质变性液，将待检测样本与蛋白变性液以体积比为1：2混合均匀，预设PCR反应体系50μL，待检测样本占PCR反应体系的10％，即待检测样本体积为5μL，蛋白质变性液为10μL(含1×104copies/ml内标物质)，混合后65℃预热15min。蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。蛋白酶K为现配现用，蛋白酶K在蛋白质变性液中的的浓度为3mg/mL。
试剂(2)：PCR反应预混液，将5×PCR反应缓冲液、三组特异性引物和Taqman探针、dNTPS、TaqDNA聚合酶(GoTaqFlexiDNA聚合酶TM；Promaga目录号M8295)、BSA、逆转录酶(SuperM-MμLVReverseTranscriptase；FAPON，目录号MD028)按一定比例混合均匀。
其中，PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween20和硫酸镁，各组分经优化后的反应终浓度如下：
Tris-HCl在PCR反应缓冲溶液中的终浓度为60mmol/L。
硫酸铵在PCR反应缓冲溶液中的终浓度为17.5mmol/L。
氯化钾在PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/Lmmol/L。
Tween20与PCR反应缓冲溶液的体积比为0.25：100；
硫酸镁在PCR反应缓冲溶液中的终浓度为3.5mmol/L。
将试剂(1)和试剂(2)混合，补水至总反应体积为50μL具体见表1所示。
将预热后的试剂(1)加入试剂(2)中混合均匀，补水至总反应体积为50μL，在ABI7500荧光PCR仪上进行热循环反应，反应条件为：
a.50℃，15min；
b.95℃，5min；
c.95℃，15s；
55℃，20s；(本阶段收集荧光)
该步骤须进行50个循环。
检测结果如图2和图3所示，图2为优化前检测结果，图3为优化后检测结果。
由图2和图3可以看出，经过优化反应液CoxA16和IC的扩增效率和荧光值明显改善，说明体系优化有效，该技术可用于后续的试剂盒开发。
实施例2
用上述优化好的反应液和反应条件分别测试含有EV71病毒的阳性咽拭子样本和含有CoxA16病毒的阳性咽拭子样本，验证该体系优化后单独检测其中一种病毒和内标没有相互干扰。
检测结果如图4和图5所示，图4为检测含有EV71病毒的阳性咽拭子样本，结果显示只有EV71和IC检出，没有CoxA16检出；图5为检测含有CoxA16病毒的阳性咽拭子样本，结果显示只有CoxA16和IC检出，没有EV71检出。
由图4和图5可以看出，经过系统优化，检测EV71和CoxA16不存在相互干扰现象，保证了检出结果的可靠性，该技术可用于后续试剂盒的开发。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供特异性扩增引物和探针，所述异性扩增引物选自第一组引物、第二组引物和第三组引物中的两种或三种，所述第一组引物、所述第二组引物和所述第三组引物分别针对不同种类的病毒或同种病毒的不同亚型的序列保守区设计，所述探针选自第一探针、第二探针和第三探针中的两种或三种，所述第一探针对应于所述第一组引物，所述第二探针对应于所述第二组引物，所述第三探针对应于所述第三组引物；
将待检测样本与蛋白质变性液混合，使得所述待检测样本中的病毒核酸分子释放，得到混合样本；
将所述混合样本预热后与PCR反应预混液混合，得到反应液，所述PCR反应预混液包括所述特异性扩增引物和所述探针；以及
将所述反应液置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应。
2.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针均为Taqman探针，并且所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的5’端分别标记了不同种类的荧光基团。
3.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，将所述混合样本预热的操作中，所述预热的温度为55℃～70℃，所述预热的时间为10min～15min。
4.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述蛋白质变性液包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K。
5.根据权利要求4所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述蛋白质变性液中，所述异硫氰酸胍的浓度为0.2mol/L～2mol/L，所述柠檬酸钠的浓度为10mmol/L～30mmol/L，所述十二烷基肌酸钠的质量浓度为0.2％～1％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L，所述蛋白酶K的浓度为1mg/mL～5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述待检测样本与所述蛋白质变性液的体积比为1：1～2。
7.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述PCR反应预混液还包括PCR反应缓冲溶液和反应酶系；
所述PCR反应缓冲溶液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween20和硫酸镁；
所述反应酶系包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
8.根据权利要求7所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述Tris-HCl在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～65mmol/L；
所述硫酸铵在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为10mmol/L～20mmol/L；
所述氯化钾在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为40mmol/L～80mmol/L；
所述Tween20与所述PCR反应缓冲溶液的体积比为0.01～2：100；
所述硫酸镁在所述PCR反应缓冲溶液中的终浓度为2mmol/L～5mmol/L；
所述TaqDNA聚合酶为改良的可抗抑制剂的TaqDNA聚合酶；
所述逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特异性的逆转录酶。
9.根据权利要求1所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述待检测样本包括血清、血浆、口鼻腔粘液、尿液和粪便中的至少一种；
所述待检测样本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、甲型流感H1N1病毒、甲型流感H3N2病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的荧光定量多重直扩q(RT)-PCR方法，其特征在于，所述禽流感病毒为H5N1、H7N9和H9N2中的至少一种；所述手足口病毒为EV71和CA16中的至少一种。
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