CN102994648A - 一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法，包括如下步骤：(1)生产“呼吸道病毒多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者样品，并提取核酸；(3)以患者核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。本发明具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。

Description

一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法。
背景技术
目前，呼吸道病毒感染每年造成大量人群死亡，尤其甲型流感时有局部暴发或爆发性流行如2009年的猪流感流行，对人民的健康及社会造成巨大威胁。目前对呼吸道感染的最终检测方法仍以病原体检查为主，往往在确诊上报之时，疫情已经有一定程度的传播。本发明可同步检测19种呼吸道病毒(包括季节性甲型流感、猪流感、禽流感、非典病毒等)及达菲敏感或抗性，一天之内可完成192个患者样品的检测。利用美国贝克曼库尔特有限公司的GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，将为疾控中心、医院及其它医疗机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法。
本发明采用如下技术方案：
一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法，包括如下步骤：(1)生产“呼吸道病毒多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者样品，并提取核酸；(3)以患者核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。
优选地，所述步骤(2)中的患者样品包括鼻咽拭子、痰液等等。
优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。
优选地，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48℃、42℃、95℃、4℃。
优选地，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
优选地，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为95℃、94℃、55℃、70℃、4℃。
本发明的有益效果为：
1.灵敏度高、重复性好：采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。
2.准确性强：采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。
3.高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测15-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测19种呼吸道病毒，22个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。
4.精确定量：可精确定量病原体基因拷贝数。
5.灵活性强：可随时根据需求调整检测的靶基因，例如甲型流感发生新变异，可立即设计特异性引物，将其放入“呼吸道感染病原体多重基因检测方案”中去。
6.成本低：每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明创立了一种同步检测十九种常见呼吸道病毒、二十二个靶位的多重基因检测方案。
1.检测的病毒包括甲型流感病毒及其亚型(禽流感、猪流感、季节性流感)、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、博卡病毒、合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒等(表1)。
2.在检测上述呼吸道病毒的同时，检测猪流感病毒对达菲抗药性，明确地鉴别患者是否适宜服用达菲(表1)。
3.建立了可靠地样品质量及反应过程的对照(表1)
a)人DNA和人RNA完整性的对照内参：确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。
b)正常反应对照内参：监控PCR反应效率，避免假阴性。
表1.检测的靶位点
靶点名称                 检测内容/内参
  InfluenzaA   所有甲型流感病毒
  InfluenzaB   所有乙型流感病毒
  GeH1N1   所有甲型流感H1N1亚型
  SeH1N1   季节性甲型流感H1N1病毒
  SWH1N1   猪流感H1N1病毒
  InfAN1_TS   猪流感病毒达菲敏感
  InfAN1_TR   猪流感病毒达菲抗性
  InfAH3   季节性甲型流感病毒H3
  H5N1   禽流感病毒H5N1
  InfAN1   甲型流病毒N1
  InfAN2   甲型流感病毒N2
  HRV   人类鼻病毒
  HCoV-NL63/229E   人类冠状病毒-NL63/229E
  HCoV-HKU1/OC43   人类冠状病毒-HKU1/OC43
  SARS-CoV   非典冠状病毒
  HPIV-1   人类副流感病毒1型
  HPIV-2   人类副流感病毒2型
  HPIV-3   人类副流感病毒3型
  HMPV   人类偏肺病毒
  HRSV   人呼吸道合胞病毒
  HAdV   人类腺病毒
  BocaV   博卡病毒
  RNaseP_DNA   人DNA内参
  B2M_RNA   人RNA内参
  pcDNA3.1   反应内参
4.呼吸道病毒多重基因检测的引物设计(见表2核苷酸序列)
表2.呼吸道病毒GeXP多重基因检测引物序列
  检测内容/内参   反转录引物   PCR引物
  所有甲型流感病毒   GGTATGCTTTTGCAMTGARTAGAGG   GCTGCAGTCCTCGCTCACT
  所有乙型流感病毒   CACACAGGGCTCATAGCAGA   TCTCAGCACTCCAATGTTGC
  所有甲型流感H1N1亚型   GCMGAYCWRVGAGCACAVARAAT   CCAAAGTTCTTTCATTTTCCART
  季节性甲型流感H1N1病毒   GGTATGCTTTTGCAMTGARTAGAGG   AAGGGATATTCCTTARTCCTGTAACCAT
  猪流感H1N1病毒   GCATTCGCAATGGAAAGAAA   TCCTCAATCCTGTGGCCAG
  猪流感病毒达菲敏感   CGAAATGAATGCCGCTAATCATC   CAGATTCTGGTTGAAAGACACC
  猪流感病毒达菲抗性   AGTCGAAATGAATGGCCACTAATAATT   CAGATTCTGGTTGAAAGACACC
  季节性甲型流感病毒H3   CCAAATTGAAGTGACTAATGCTACTGA   TAGTGACCTAAGGGAGGGATAATC
  禽流感病毒H5N1   CATCAACACTAAACCAGAGATTGG   TCCCCTTTCTTGACAATTTTGTAT
  甲型流感病毒N1   GGRGCCTTGYTRAATGAACA   ACACATGCACATTCAGAYTCTTG
  甲型流感病毒N2   CATTGWTTCCAGTTATGTRTGYTC   GTTCTTCCCATCCAYAGRTCA
  人类鼻病毒   GAAACACGGACACCCAAAGT   GAGTCCTCCGGCCCC
  人类冠状病毒-NL63/229E   CATCATRGTRTATTTAGTAAGATYMTG   CRGTTATGGAMCACGAGCA
  人类冠状病毒-HKU1/OC43   ATCCCAWTGACAATCCAAAKGG   GAATGTTGCTAAGTAYACTCARTTATG
  非典冠状病毒   GCAAAACCTGAATCAGTGCC   GTGCTGTGATCATTCGTGGT
  人类副流感病毒1型   CAATCACAGAATTAATCAGACAAGAA   TGTGTGAGATCTCTGCTTTGC
  人类副流感病毒2型   AACCATTTACCTAAGTGATGG   GATTGAATCTTTCAATAAAGG
  人类副流感病毒3型   CTGTGTTCAACTCCMAAAGTTGA   CCTGGTCCAACAGATGGGTA
  人类偏肺病毒   TGCAGGRRTCMACTGTTTACTAC   AGAGGDGAYAGTGCAACCAT
  人呼吸道合胞病毒   GGAGCYATWGTGTCATGCTA   TCATAGWAATTTATTATWGGTTC
  人类腺病毒   CCCAGHGCRTTGTRVACGTA
  人类腺病毒   CACTTACCGTCAGTTGAAAACGT
  博卡病毒   TCCTGTTGAATGWGTAGGACAAA
  博卡病毒   TRCARTGGTTGYTTYAATGAGTAC
  人DNA内参   CGCTAGGAATCAGACCAACAC
  人DNA内参   ATGGCGGTGTTTGCAGAT
  人RNA内参   ATTCATCCAATCCAAATGCG   CCGTGTGAACCATGTGACTT
  反应内参   CCGAGATAGGGTTGAGTGTTGT
  反应内参   AGGGTGATGGTTCACGTAGTG
具体实施步骤：
1.生产“呼吸道病毒多重基因检测试剂盒”，试剂盒中包括：反转录引物管、PCR引物管、反转录缓冲液、PCR缓冲液、25mM氯化镁、反转录酶、DNA聚合酶、荧光标记物、阳性对照。
2.采集患者样品(鼻咽拭子、痰液等)，并提取核酸
3.以患者核酸为模板进行反转录(RT)：
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板)：
Figure BSA00000738172900041
注：阳性对照：1μL/反应
2)混匀后按以下温度孵育：
  步骤   温度   时间
  1   48℃   1分钟
  2   42℃   60分钟
  3   95℃   5分钟
  4   4℃   持续：直至收取RT产物
4.以反转录产物为模板进行PCR反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板)：
  PCR反应试剂   量/孔
  PCR缓冲液，5X   4μL
  25mM MgCl2   4μL
  PCR引物   2μL
  DNA聚合酶   1.4μL
  RT产物   8.6μL
  Total   20μL
2)混匀后按以下温度进行热循环反应：
  步骤   温度   时间
  1   95℃   10分钟
  2   94℃   30秒钟
  3   60℃   30秒钟
  4   70℃   1分钟
  5   N/A   重复2-4步骤34次(共35次)
  6   70℃   1分钟
  7   4℃   持续：直至收取PCR产物
5.毛细电泳分离样品
1)制备GeXP样品：
  GeXP样品   量/孔
  SLS上样液   38.75μL
  DNA大小标准400   0.5μL
  PCR产物   1μL
  Total   40μL
  矿物油   1滴
注：PCR产物量可为0.1-1μL，或用水按需要预稀释后上样
2)准备分离液：将约220μL分离液加入96孔分离液板上适当数目的孔中
3)毛细电泳分离样品。
6.结果分析。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法，包括如下步骤：
(1)生产“呼吸道病毒多重基因检测试剂盒”；
(2)采集患者样品，并提取核酸；
(3)以患者核酸为模板进行反转录；
(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；
(5)以毛细电泳的方法分离样品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(1)中的试剂盒包括：反转录引物管、PCR引物管、反转录缓冲液、PCR缓冲液、25mM氯化镁、反转录酶、DNA聚合酶、荧光标记物、阳性对照。
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(2)中的患者样品包括鼻咽拭子、痰液等等。
4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48℃、42℃、95℃、4℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为95℃、94℃、55℃、70℃、4℃。
8.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(5)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
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