CN106048096A - 一种同时检测四种呼吸道病毒的rt‑pcr方法所用的四对上下游引物 - Google Patents

一种同时检测四种呼吸道病毒的rt‑pcr方法所用的四对上下游引物 Download PDF

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Abstract

一种同时检测四种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的四对上下游引物，属于生物工程技术领域。本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，为建立一种能同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）四种呼吸道病毒的多重PCR方法，提供四对上下游引物。该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。

Description

一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下 游引物
技术领域
一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下游引物，属于生物工程技术领域。
背景技术
呼吸道疾病包括上、下呼吸道急、慢性感染，呼吸道变态反应性疾病等。其中急性呼吸道感染最为常见，由急性呼吸道感染所引起的患者常表现为咳嗽、发热、四肢酸痛、流涕、鼻塞、呼吸困难等症状。能够引起急性呼吸道感染的病原体种类繁多，包括细菌、病毒、支原体、衣原体和真菌等，据统计，引起急性呼吸道感染80%以上是病毒性感染。
目前，呼吸道病毒的实验室诊断主要包括病毒分离，血清学诊断，直接荧光抗体检测以及核酸检测等方法。虽然病毒分离培养是呼吸道病毒感染诊断的“金标准”，但该方法对设备技术的要求较高，耗时耗力，不能应用于临床早期诊断和疫情的快速处置。血清学诊断则需采集急性期、恢复期的患者血液标本，只能起到回顾性诊断的作用，也不能应用于临床早期诊断以及疫情的快速处置。直接荧光抗体检测虽然能在较短的时间内获得结果，但特异性和灵敏度较低，判断具有一定的主观性，人力成本高。近年来，随着分子生物学技术的不断发展核酸检测已广泛应用于临床病原学诊断，在普通PCR的基础上建立起来了多重PCR核酸检测方法，该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
对于RT-PCR产物的检测方法主要有传统的琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳。琼脂糖凝胶电泳是以琼脂或者琼脂糖为支持介质的一种电泳方法，需要人工配制凝胶，重复性差，且对操作人员要求较高且耗时较长。而毛细管电泳分析，具有分辨率高、快速、需样量少、自动等优点。
基于此，本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，建立一种能同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）四种呼吸道病毒的多重PCR方法。
发明内容
本发明目的是提供一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法，及其所用的四对上下游引物。建立起来了多重PCR核酸检测方法，该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
本发明的技术方案：一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下游引物；
引物设计：分别设计针对FluA、FluB、PIVⅠ和PIVⅢ 基因组保守区的4 对引物如下：
设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来的前提下，分别将四种引物的各对上下游引物（40µM）按体积比1︰1 混合，再将引物FluA︰FluB︰PIVⅠ︰PIVⅢ按体积比1︰3︰2︰2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物；所述引物由上海生工生物工程股份有限公司制备；
提取呼吸道标本的总核酸（DNA&RNA）；
PCR检测的反应体系为25µL，包括Enzyme Mix 1µL，5 X buffer 6µL，dNTP 1µL，混合后的引物4µL，待检模版5µL，水补充至25µL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸，Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供；
PCR检测的反应程序为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 变性30sec，50℃ 退火30sec，72℃ 延伸1min，35个循环；72℃ 10min。
本发明的有益效果：本发明建立了一种能同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）的RT-PCR方法所用的四对上下游引物。该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
附图说明
图1所得PCR产物用QIAxcel全自动毛细管电泳系统分析所得电泳图谱。M：Marker；1：FluA+FluB+PIVⅠ；2：FluA+FluB+PIVⅢ；3：FluA+PIVⅠ+PIVⅢ；4： FluB+PIVⅠ+PIVⅢ；5：FluA+FluB+PIVⅠ+PIVⅢ； N：阴性对照。
具体实施方式
实施例1
1、引物设计：分别设计针对FluA、FluB、PIVⅠ和PIVⅢ 基因组保守区的四对引物如下：
在设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来的前提下，分别将四种引物的各对上下游引物（40µM）按体积比1︰1 混合，再将引物FluA︰FluB︰PIVⅠ︰PIVⅢ按体积比1︰3︰2︰2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物；
2、提取呼吸道标本的总核酸（DNA&RNA）；
3、PCR检测的反应体系为25µL，包括Enzyme Mix 1µL，5 X buffer 6µL，dNTP 1µL，混合后的引物4µL，待检模版5µL，水补充至25µL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸；Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供；
4、PCR检测的反应程序为50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 变性30sec，50℃ 退火30sec，72℃ 延伸1min，35个循环；72℃ 10min；
5、所得PCR产物用QIAxcel全自动毛细管电泳系统分析，所得电泳图谱如图1所示。
PIVⅠ上游引物：5’-CCGGTAATTT CTCATACCTA TG-3’；
PIVⅠ下游引物：5’-CCTTGGAGCG GAGTTGTTAA G-3’；
PIVⅢ上游引物：5’-CTCGAGGTTG TCAGGATATA G-3’；
PIVⅢ下游引物：5’-CTTTGGGAGT TGAACACAGT T-3’；
FluA上游引物：5’-TTCTAACCGA GGTCGAAACG-3’；
FluA下游引物：5’-ACAAAGCGTC TACGCTGCAG-3’；
FluB上游引物：5’-GGGACATGAA CAACAAAGAT GC-3’；
FluB下游引物：5’-TGTCAGCTAT TATGGAGCTG-3’。

Claims (1)

1.一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下游引物，其特征在于：
引物设计：分别设计针对FluA、FluB、PIVⅠ和PIVⅢ 基因组保守区的四对引物如下：
PIVⅠ上游引物：5’-CCGGTAATTT CTCATACCTA TG-3’，
PIVⅠ下游引物：5’-CCTTGGAGCG GAGTTGTTAA G-3’ ，产物大小：317bp；
PIVⅢ上游引物：5’-CTCGAGGTTG TCAGGATATA G-3’，
PIVⅢ下游引物：5’-CTTTGGGAGT TGAACACAGT T-3’ ，产物大小：189bp；
FluA上游引物：5’-TTCTAACCGA GGTCGAAACG-3’，
FluA下游引物：5’-ACAAAGCGTC TACGCTGCAG-3’ ，产物大小：230bp；
FluB上游引物：5’-GGGACATGAA CAACAAAGAT GC-3’，
FluB下游引物：5’-TGTCAGCTAT TATGGAGCTG-3’ ，产物大小：425bp；
在设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来，分别将四种引物的各对40µM的上下游引物按体积比1︰1 混合，再将引物FluA︰FluB︰PIVⅠ︰PIVⅢ按体积比1︰3︰2︰2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物；
提取呼吸道标本的总核酸DNA&RNA；
PCR检测的反应体系为25µL，包括Enzyme Mix 1µL，5 X buffer 6µL，dNTP 1µL，混合后的引物4µL，待检模版5µL，水补充至25µL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸，Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供；
PCR检测的反应程序为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 变性30sec，50℃ 退火30sec，72℃ 延伸1min，35个循环；72℃ 10min。
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