CN107475252A - 一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用。本发明的核酸释放剂由5～500mM Tris‑HCl、50～1000mM NaCl、0.1～10mM EDTA、质量/体积比为0.01％～2％的SDS、质量/体积比为0.04％～3％的LLS和质量/体积比0.01％～2％的甜菜碱组成。本发明的核酸释放方法能够快速释放血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、干血斑斑、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸可用于检测、克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用。
背景技术
目前，不同类型基因检测均会涉及到核酸的提取和纯化步骤。核酸提取纯化一般经历过液体法-离心柱法-磁珠法，液体法和离心柱法均会涉及到有毒有机物的使用，对环境和实验操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相应特殊配制的磁珠缓冲液和特异修饰后的磁珠，从成本和操作方面来分析，均存在成本高且操作步骤繁琐，同时，也限制了自动化的进程和应用的推广。因此，开发一种能快速释放核酸并且对后续基因检测实验无影响核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用，目的是大大缩短核酸提取纯时间化、降低制造成本，同时具有操作简单的优势。
本发明的核酸释放剂由5～500mM Tris-HCl,、50～1000mM NaCl，0.1～10mMEDTA、质量/体积比为0.01％～2％的十二烷基磺酸钠(SDS)、质量/体积比为0.04％～3％的十二烷基硫酸锂(LLS)和质量/体积比0.01％～2％的甜菜碱组成，所述的体积百分比是以无菌水为基准。
其中，所述的Tris-HCl的pH7.0～9.0。
本发明的快速释放核酸的方法按照以下步骤进行：
(1)根据需要释放核酸的样本类型的不同，用超纯水对样本进行5～100倍稀释，再加入核酸释放剂，样本与核酸释放剂的比例任意，较优选的体积比为：核酸释放剂/待处理样本＝1/10～1/100；
(2)加入核酸释放剂后涡旋震荡混匀，加热孵育，优选的加热温度为80～100℃，孵育时间优选5～30min，核酸即得到有效释放。
本发明的快速释放核酸的方法用于快速释放血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、干血斑斑、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸用于检测、克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明的核酸释放剂同时能抑制DNase和RNase活性，并且对后续实验无影响；
本发明的核酸释放剂采用强烈的蛋白变性剂，能够快速破解细胞、病毒的等蛋白结构，释放出核酸；同时加热处理，可以完全抑制Dnase和Rnase活性；
本发明的核酸释放剂中有强烈核酸保护剂，能够避免核酸在高温下降解；
本发明的核酸释放方法，能够快速释放血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、干血斑斑、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸可用于检测、克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。
本发明之核酸释放方法，无需特殊的试剂，试剂成本低下，操作流程简单，可推广性强。
附图说明
图1为本发明实施例快速释放核酸的方法检测EXOC1基因单核苷酸多态性；
图2为本发明实施例快速释放核酸的方法检测CNTN4基因单核苷酸多态性；
图3为本发明实施例快速释放核酸的方法检测RNF146基因单核苷酸多态性；
图4为对比例的对照方法提取EXOC1并进行荧光定量PCR检测扩增曲线；
图5为本发明方法提取EXOC1并进行荧光定量PCR检测扩增曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明
实施例1：
本实施例中核酸释放剂由100mM Tris-HCl,、50mM NaCl，0.1mM EDTA、0.01％SDS、0.04％LLS和2％甜菜碱组成。
将本发明的快速释放核酸方法用于口腔、全血和干血斑类型样本的TaqMan SNP检测，其中涉及EXOC1、CNTN4、RNF146三个基因单核苷酸多态性TaqMan探针检测，具体按照以下步骤进行：
a)口腔刮棒直接用所述核酸释放剂进行洗脱，震荡混匀，获得了口腔混合液；
b)取50μL全血样本加入于含150μL ddH2O的1.5mL离心管中，离心弃上清，再加入100μL所述核酸释放剂震荡重悬；
c)干血斑样本用3mm打孔器打取1片于1.5mL的离心管中，向离心管中加入500μLddH2O，震荡混匀，室温静置5min，离心，去除上清，再向离心管中加入200μL所述核酸释放剂；
将上述加有核酸释放剂的样本管置于金属浴中进行孵育；离心，取占PCR反应体系的5％～50％的样本处理液进行PCR反应体系的配制，涡旋混匀，于罗氏LightCycler480PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增并进行SNP分析。
PCR反应体系各成分浓度及比例如下：
其中：
EXOC1基因的引物探针：
上游引物：5'-GGTAGTTTTGTAGTTTTATAAGTGTTA-3'
下游引物：5'-ATGAACCAATTTTTATTCTCCAA-3'
探针：
5'-FAM-GGAATAGGAGAGTTATTTGTGACAATTGAGTGC-Q-3'
5'-VIC-AAAGTGAGCACAATTTTCTATGCACTCAATTTTCA-Q-3'
CNTN4基因引物探针：
上游引物：5'-GAGTAACAAATACATCCTTAAAAGCC-3'
下游引物：5'-GTGAGGTATCCCAATGCTCC-3'
探针：
5'-FAM-CCAAAATAGTTTATCTGGTTCAGTTACTGTTGATAAATA-Q-3'
5'-VIC-GAATAATATGCAATTGCAATGTCGTTAAATATATTGATCAAC-Q-3'
RNF146基因引物探针：
上游引物：
5'-ATTGAGTAGACTTGACACCCT-3'
下游引物：
5'-GCAGAAATGGAAAAGCAATC-3'
探针：
5'-FAM-CTCTCAATTCTATATCATTGGTGTATTTATCTATCCTATGC-Q-3'
5'-VIC-GTTTGGTGCTGGCATAGGAGAGATA-Q-3'
PCR反应条件为：
结果分析：如附图1～3所示，应用本发明的方法对三种不同类型的样本进行三种基因的单核苷酸多态性检测，同一样本进行三种位点基因的单核苷酸多态性分析，从如附图1～3中扩增曲线上看，基线平稳，指数区域明显，位点扩增特异性强，从单核苷酸多态性位点上看，位点分布合理，仪器分型判读准确。
实施例2：
本实施例将核酸快速释放方法与传统离心柱方法对比，具体步骤如下：
本实施例检测同一片干血斑样本；并用3mm打孔器打取6片，分别置于1.5mL的离心管中，并命名为干血斑1、干血斑2、干血斑3、干血斑4、干血斑5、干血斑6。
(1)核酸快速释放方法
取编号1～3干血斑样品，向离心管中加入500μL超纯水，涡旋震荡混匀，室温静置5min，12000rpm离心3min，去除上清，再向离心管中加入所述200μL核酸释放剂；将上述加有核酸释放剂的样本管置于80℃金属浴中进行孵育5min；12000rpm离心3min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中保存，即获得样本处理液。
(2)传统离心柱方法
取编号4～6干血斑样品，采用离心柱方法进行核酸提取，具体操作参照干血斑基因组DNA提取试剂盒(天根(北京)生物科技有限公司货号：DP334)的说明书进行核酸提取纯化，包括以下步骤：
1、溶解；
2、核酸释放；
3、离心柱吸附；
4、洗涤纯化；
5、洗脱；
6、保存。
分别取10μL核酸快速释放方法获得样本处理液和传统离心柱方法获得核酸进行PCR反应体系的配制，涡旋震荡混匀，于罗氏LightCycler480PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增分析
PCR反应各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 体积 |
| 上游引物 | 1μL |
| 下游引物 | 1μL |
| EXOC1探针(FAM/C、VIC/G,) | 0.2μL |
| dNTPs(2.5mM each) | 0.3μL |
| 5xPCR buffer | 3.5μL |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 1μL |
其中：
EXOC1基因引物探针同实施例1
PCR反应条件为：
结果分析：如附图4，应用传统离心柱法提取干血斑样本，并进行进行荧光定量PCR检测，从扩增曲线上看，离心柱法提取检测的扩增曲线指数区域较不明显，没有明显的平台期。
如附图5，应用本发明核酸快速释放方法进行样本处理，并进行进行荧光定量PCR检测采，从扩增曲线上看，基线平整，一直是水平线；指数区域较明显，平台区汇于一起，同一样本6次检测Ct值的变异系数<2％。
表1两种提取方法qPCR检测Ct值比较结果
| 本发明一步法 | 离心柱法 | |
| Ct值 | 35.47±0.15 | 35.83±0.75 |
| CV％ | 0.45％ | 2.1％ |
Claims (4)
1.一种核酸释放剂，由其特征在于由5～500mM Tris-HCl,、50～1000mM NaCl，0.1～10mM EDTA、质量/体积比为0.01％～2％的SDS、质量/体积比为0.04％～3％的LLS和质量/体积比0.01％～2％的甜菜碱组成，所述的体积百分比是以无菌水为基准。
2.根据权利要求1所述的一种核酸释放剂，由其特征在于所述的Tris-HCl的pH7.0～9.0。
3.一种如权利要求1所述的快速释放核酸的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)根据需要释放核酸的样本类型的不同，用超纯水对样本进行5～100倍稀释，再加入核酸释放剂，样本与核酸释放剂的比例任意，优选的体积比为：核酸释放剂/待处理样本＝1/10～1/100；
(2)加入核酸释放剂后涡旋震荡混匀，加热孵育，优选的加热温度为80～100℃，孵育时间优选5～30min，核酸即得到有效释放。
4.一种核酸释放剂的应用，其特征在于用于快速释放血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、干血斑斑、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸用于检测、克隆、序列分析、分子杂交实验。
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