CN111910021A - 一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，提供一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及其检测方法。所述微流控芯片包含进样孔、多个反应池和连接进样孔和反应池的微流路，反应池内包被固定有能扩增特异靶基因序列的引物和探针组。采用本发明的技术方案，一次检测可分析多种病原体，涵盖的病原体种类多，且具有灵敏度高、特异性强等优点；同时，本发明提供的微流控芯片可通过荧光扩增曲线实时监测扩增情况，避免了传统基因芯片扩增后再杂交的过程，操作简便，检测快速；此外，该实验全程为封闭式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。

Description

一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及其检测方法。
背景技术
急性呼吸道感染(acute respiratory tractinfection，ARTI)是临床最常见的疾病之一，发病率居急性传染病的首位，平均每年下呼吸道感染导致大约4000000患者死亡。在全球范围内，呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的主要原因。ARTI—般由细菌和病毒引起，其中大约90％为呼吸道病毒所导致，这些病原体感染都会导致发热、咳嗽、肺炎或白细胞不明显升高等类似临床症状。在人群中，尤其是儿童中，急性呼吸道感染往往是病毒和细菌混合感染或者继发感染，或单一及多种病毒感染，随着病情的持续发展，混合感染现象较为普遍。这给患者病情的控制和病原体的确定增加了难度。而明确鉴别引起呼吸道感染的病原体，可以进行针对性的治疗，提高疗效、降低患者负担，并有效减少抗生物的滥用。
目前常用的检测呼吸道病原体的检测方法：培养法、血清学检测、分子生物学检测方法等。培养法是诊断细菌性感染和病毒感染最可靠的方法，也是诊断的金标准，但这种方法复杂，操作繁琐，周期长，灵敏度低，对样本的要求比较高，而且易出现假阴性的结果。血清学检测是基于抗原抗体反应原理进行检测，检测周期短，但特异性和灵敏度低，易出现假阴性和假阳性的结果，具有一定的局限性。荧光PCR法是目前临床应用较多的病原早期快速诊断的分子生物学方法，但一次通常只能检测一种病原。基因芯片技术可以实现多病原同时检测，但现有芯片技术基本都是扩增后再杂交，操作较为复杂，耗时较长，而且有个开管取PCR产物的过程，这样使高浓度产物暴露空气中，很容易造成样本间的交叉污染。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，可同时检测多重病原体，具有操作简便、快速，封闭系统扩增有效防止交叉污染等特点。
为实现上述目的，本发明公开下述的技术方案。
第一方面，提供一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，该微流控芯片有三层，上下两层为盖片，中间层为芯片基片，其中所述的芯片基片上有一个进样孔、多个反应孔和连接进样孔和反应孔的微流路，将芯片基片与上下盖片焊接形成密闭的反应池，反应池内包被固定有能扩增特异靶基因序列的引物和探针组。
进一步地，芯片基片长度44.9mm±0.5mm，宽度35.9mm±0.5mm，厚度1mm±0.3mm。
进一步地，盖片厚度10-100μm，由PDMS、玻璃、PC等透明材质制成。
进一步地，进样孔为一个带气孔的立柱，所述立柱为圆形，高2-3mm，直径2mm，用于抽真空和进样。
进一步地，反应孔呈阵列式排布在芯片基片上，形状为六边形、矩形、圆形中的至少一种，优选六边形。
进一步地，所述微流控芯片内设有扩增对照、空白对照和提取对照，提取对照为人看家基因，优选RnaseP基因，扩增对照为酵母DNA。
用于检测RnaseP的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQID NO:90所示；
用于检测酵母DNA的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQID NO:93所示。
进一步地，所述呼吸道病原体为新型冠状病毒(SARS-Cov-2)、冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、腺病毒通用、腺病毒3型、腺病毒7型、腺病毒55型、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、肠道病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒(HPIV1)、人副流感病毒(HPIV2)、人副流感病毒(HPIV3)、人副流感病毒(HPIV4)、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和百日咳杆菌。
用于检测乙型流感病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；
用于检测腺病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6所示；
用于检测腺病毒3型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9所示；
用于检测腺病毒7型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示；
用于检测腺病毒55型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示；
用于检测副流感病毒1型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示；
用于检测副流感病毒2型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示；
用于检测副流感病毒3型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示；
用于检测副流感病毒4型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示；
用于检测冠状病毒229E的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示；
用于检测冠状病毒NL63的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33所示；
用于检测冠状病毒HKU1的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36所示；
用于检测冠状病毒OC43的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39所示；
用于检测呼吸道合胞病毒A型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42所示；
用于检测呼吸道合胞病毒B型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45所示；
用于检测甲型流感病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48所示。
用于检测甲型流感病毒H7N9的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51所示；
用于检测甲型流感病毒H5N1的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54所示；
用于检测甲型流感病毒H3N2的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57所示；
用于检测甲型流感病毒H1N1(2009)的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60所示；
用于检测肠道病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63所示；
用于检测鼻病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66所示；
用于检测人偏肺病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69所示；
用于检测新型冠状病毒orf1ab基因的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72所示；
用于检测新型冠状病毒N基因的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75所示；
用于检测肺炎衣原体的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78所示；
用于检测肺炎支原体的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81所示；
用于检测百日咳杆菌的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84所示；
用于检测博卡病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87所示。
第二方面，提供一种前述用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将盖片和芯片基片清洗烘干；
(2)将芯片基片带立柱面与下盖片焊接，形成半封闭反应池；
(3)配制各病原体、扩增对照和提取对照对应的引物探针混合物；
(4)用移液器取1ul引物探针混合物点制到对应的反应池内，晾干；
(5)封接上盖片，形成封闭的微流控芯片；
(6)用真空装置将微流控芯片抽真空后，将气孔封闭。
进一步地，所述步骤3中，引物探针混合物中，引物和探针的终浓度为1-2μmol/L。
进一步地，所述步骤3中，扩增对照的引物探针混合物中还加有酵母菌DNA模板。
第三方面，提供一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的检测方法，采用前述一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，包括如下步骤：
(1)样本处理和核酸提取，得到待测核酸模板；
(2)配制核酸扩增试剂，并与待测模板混合，制成扩增反应液；
(3)取注射器吸取扩增反应液，排出空气，刺破加样孔，将液体注入微流控芯片内；
(4)待液体注满微流控芯片后，拔出注射器，用密封胶封闭加样孔；
(5)将微流控芯片放入配套核酸扩增分析仪中进行扩增；
(6)扩增完毕，由核酸扩增分析仪自带软件进行数据分析并判断阴阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，通过使用多个相对独立的反应池，每个反应池中包含一种病原体的引物探针组，实现多种病原体的同时检测分析。本发明提供的微流控芯片一次可检出的病原体种类多，具有灵敏度高、特异性强等优点；同时，本发明提供的微流控芯片可通过荧光扩增曲线实时监测扩增情况，避免了传统基因芯片扩增后再杂交的过程，操作简便，检测快速；此外，该实验全程为封闭式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1中呼吸道病原核酸检测微流控芯片的反应池顺序图，从1到32孔分别对应新型冠状病毒(SARS-Cov-2)orf1ab基因、新型冠状病毒(SARS-Cov-2)N基因、冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、腺病毒通用、腺病毒3型、腺病毒7型、腺病毒55型、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、肠道病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒(HPIV1)、人副流感病毒(HPIV2)、人副流感病毒(HPIV3)、人副流感病毒(HPIV4)、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳杆菌、扩增对照、提取对照和空白对照。
图3为本发明实施例2中对甲流和乙流共感染样本进行检测的结果图，结果显示FluA、FluAH1、FluB、EC和PC均为阳性。
图4为本发明实施例2中对新冠阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N、EC和PC均为阳性。
图5.为本发明实施例2中对腺病毒阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示AdV、AdV3、EC和PC均为阳性。
图6.为本发明实施例2中对呼吸道合胞阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示RSVA、EC和PC均为阳性。
图7.为本发明实施例2中对冠状病毒阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示HCoV229E、EC和PC均为阳性。
图8.为本发明实施例2中对人偏肺病毒阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示HMPV、EC和PC均为阳性。
图9.为本发明实施例2中对肺炎支原体阳性患者样本进行检测的结果图，结果显示MP、EC和PC均为阳性。
图10.为本发明实施例2中对副流感病毒和甲流共感染样本进行检测的结果图，结果显示FluA、FluAH3、PIFV1、EC和PC均为阳性。
图11.为本发明实施例2中对腺病毒7型感染患者样本进行检测的结果图，结果显示AdV、AdV7、EC和PC均为阳性。
图12.为本发明实施例2中肠道病毒阳性样本进行检测的结果图，结果显示RhV、EV、EC和PC均为阳性。
图13.为本发明实施例2中对混合有腺病毒55型、肺炎衣原体、博卡病毒、百日咳杆菌质粒DNA的模拟咽拭子样本进行检测的结果图，结果显示AdV55、CP、HboV、BP、EC和PC均为阳性。
图14.为本发明实施例2中对混合有副流感病毒2型、冠状病毒NL63、呼吸道合胞病毒B、H5N1假病毒颗粒的模拟咽拭子样本进行检测的结果图，结果显示PIFV2、HCoVNL63、RSVB、FluAH5、EC和PC均为阳性。
图15.为本发明实施例2中对混合有副流感病毒3型、冠状病毒HKU1、H7N9假病毒颗粒的模拟咽拭子样本进行检测的结果图，结果显示PIFV3、HCoVHKU1、FluAH7、EC和PC均为阳性。
图16.为本发明实施例2中对混合有副流感病毒4型、冠状病毒OC43、鼻病毒假病毒颗粒的模拟咽拭子样本进行检测的结果图，结果显示PIFV4、HCoVOC43、RhV、EC和PC均为阳性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围若未特别指明。
实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1呼吸道病原核酸检测微流控芯片制备
呼吸道病原的选择
呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。本方案选择的呼吸道病原体包括新型冠片状病毒(SARS-Cov-2)、冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、腺病毒通用、腺病毒3型、腺病毒7型、腺病毒55型、呼吸道合胞病毒A型和B型、人偏肺病毒、肠道病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒(HPIV1)、人副流感病毒(HPIV2)、人副流感病毒(HPIV3)、人副流感病毒(HPIV4)、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和百日咳杆菌。
2.引物探针的设计与合成
通过查阅文献和分析病原体基因组序列，确定各病原体特异靶基因标志物，然后结合Primer Premier5、Beacon designer软件和Primer-BLAST(NCBI)分析，按照退火温度在55-60℃，扩增产物长度在80-200bp，探针的Tm值比引物至少高5度等参数要求进行设计，各病原体对应引物探针序列如表1所示。设计好以后交给有合成资质的公司合成，其中探针5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1或TAMRA。
此外，为了对样本和扩增试剂质量进行监测，需要设置提取对照和扩增对照，提取对照一般选择人体内稳定表达的看家基因，本方案中选择RnaseP基因，扩增对照选择与待测病原同源性较低的或者完全没有同源性的基因，本方案中选择酵母菌基因，这两个基因按照与病原体同样的参数要求进行引物探针设计，序列见表1。
表1 呼吸道病原体引物探针序列
Figure BDA0002624999260000071
Figure BDA0002624999260000081
*引物探针名称中含F的代表上游引物，含R的代表下游引物，含P的代表探针。
3.引物探针混合物的制备
将合成好的引物探针用TE溶液溶解制成10μmol/L储备液，然后按表2所示比例配制，制成终浓度为1μmol的引物探针混合物,-20℃保存备用。
配制扩增对照(酵母菌)引物探针混合物时，将表中的水替换为1*106拷贝/μL的酵母菌基因组DNA。
表2 引物探针混合物配制
组分 体积(μL)
上游引物(10μmol/L) 0.1
下游引物(10μmol/L) 0.1
探针(10μmol/L) 0.1
10％葡萄糖 0.5
水 0.2
总计 1μL
4.微流控芯片的制备
(1)取适量盖片和芯片基片，现在丙酮中超声清洗10分钟，然后在无水乙醇中超声清洗10分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，最后取出并在烘箱中烘干备用；
(2)将芯片基片带立柱面与下盖片对齐并用超声焊接，形成半封闭反应池；
(3)将(2)中制备芯片摆在洁净工作台面上，用移液器取1ul引物探针混合物点制到各病原和对照相应的反应池内，自然晾干，各病原和对照在芯片内排布如图2和表3所示。
(4)焊接上盖片，形成封闭的微流控芯片；
(5)用真空装置将微流控芯片抽真空后，将气孔封闭，避光保存备用。
表3 芯片反应池对应检测病原体
反应池 检测指标名称 反应池 检测指标名称
1 FluB 17 2019-nCoV-ORF1ab
2 FluA 18 2019-nCoV-N
3 FluAH1 19 HCoV0C43
4 FluAH3 20 HcoV229E
5 FluAH5 21 HCoVNL63
6 FluAH7 22 HCoVHKU1
7 RSVA 23 HMPV
8 RSVB 24 RhV
9 PIFV1 25 EV
10 PIFV2 26 HBoV
11 PIFV3 27 BP
12 PIFV4 28 MP
13 AdV 29 CP
14 AdV3 30 EC
15 AdV7 31 PC
16 AdV55 32 阴性对照(NC)
实施例2应用呼吸道病原核酸检测微流控芯片检测呼吸道样本
1.样本处理和模板提取
以咽拭子为例。取200uL新鲜采集的咽拭子，用天根生化科技(北京)有限公司生产的病毒RNA提取试剂盒(DP315-R)或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit(52904)，并严格按照说明书进行提取，最后用50uL无核酸酶水进行洗脱。
2.扩增体系准备
采用takara公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒进行RT-PCR扩增体系配制。
按表4所列组份配制反应体系(反应液配制在冰上进行)，震荡混匀，短暂离心。
表4 扩增体系配制
Figure BDA0002624999260000101
3.芯片上样
用1mL注射器吸取扩增体系，排出注射器内空气，刺破加样孔，将液体注入微流控芯片内，待液体注满微流控芯片后，拔出注射器，用密封胶封闭加样孔。
4.PCR扩增
将微流控芯片放入配套核酸扩增分析仪，按表5所示设定循环参数进行扩增。
表5 PCR扩增循环参数
Figure BDA0002624999260000102
5.结果分析
扩增完毕，由核酸扩增分析仪自带软件进行数据处理，与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
6.样本检测结果
为验证本方案的实施效果，对收集的临床阳性样本进行了检测，部分未能收集到临床阳性样本的病原，采用质粒DNA或假病毒来制备模拟咽拭子样本进行检测分析，结果如图3-图15所示，检测结果与实际相符，EC阳性表明采集的样本合格且核酸提取成功，PC阳性表明扩增体系正常。其中图12为肠道病毒阳性样本进行检测的结果图，因为肠道病毒和鼻病毒基因组序列高度同源，通过扩增无法进行区分，所以其结果显示RhV、EV均为阳性，这也与实际相符。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京百康芯生物科技有限公司
<120> 一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
<130> 2020
<160> 93
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagccaagac tgcctatg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggaagcac ractttgc 18
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaacgacca tactacgagc aagcagg 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggacgcyt cggagtacct ga 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggtggtcac atcgtgggt 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggtgcagtt ygcccg 16
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttcgcatta ttgaaaatca tggcatc 27
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catccattag ygtcatcggt t 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccagggmaca ggtatcaagg cat 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tattgaaaat catggcgtcg agg 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtgtctct aggtttaatg cctt 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atttgttccc tggtcctatg ccatcc 26
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctattctgg tacggcttac aac 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttcagcttt tacgggagca 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tttcctcttc tgttacgcgc tcct 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtaggc tacttaaact agg 23
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcggacattt gttgaacca 19
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actagatcct caggttggca ctcca 25
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggataatac aacaatctgc tg 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctacatarc agtayaagac ac 22
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acctcctggt atagcagtga ctgaaca 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtggcatcgg ataatactaa tga 23
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tctggacatg actctgaatt g 21
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agaagccttg tattcactcc tgactgt 27
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caggccacat caatgcag 18
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctctgatct tgatgtcatc c 21
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcaccttatg attgctgcca gagcc 25
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagcgtaagc ccttagatta c 21
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcaccatgca crtattcaa 19
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgtcagaaca acctcgccat tgaagag 27
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgacttggt gattatgttc ttac 24
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggacctacaa ctactttagt aaaca 25
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgagcatcac gaacaccacg aacaact 27
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtctgtgtat gaacgygata 20
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cggaaacaac tttactcttc ttatc 25
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acttgaacgt atggcagacc tagcact 27
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cctgttgtgg ttgatgatca 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctcctttact gtaggctgtt c 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aacacgccgt ccagcacaag g 21
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctcacccatc caaccaaa 18
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggacattgta ttgaacagca g 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgccgattag ccaaccagcc aa 22
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggaccttcac tacgagtca 19
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
caaggtgtag ttacatcata tgcta 25
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caactcaaga agtgctgtgc tggctca 27
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ggtgagcgtg aacacaaa 18
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atggctaaag acaagaccaa 20
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cctgtcacct ctgactaagg ggatttt 27
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cacctcaatg tgaccaattc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcccaggat aacagacatc 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttccttctcg cctctca 17
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtgtgacgaa ttyatcaatg tg 22
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttccctgggt aacagagg 18
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccttctccac tatgtaagac cattccg 27
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cagcaragcc tacagcaa 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cggatgaggc aactagtg 18
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttacccttat gatgtgccg 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctggaagaca agcayaacg 19
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gctgtggaga gtgattca 18
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atccagccag caatgttac 19
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cctgaatgcg gctaatcc 18
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
caattgtcac cataagcagc ca 22
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acacggacac ccaaagtagt cggttcc 27
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggcccctgaa tgyggctaa 19
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gaaacacgga cacccaaagt ag 22
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ayggraccra ctactttg 18
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgctgacaat gactcttca 19
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gtccatatca tatcatcwrc ctcta 25
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aggaccatgc tcactg 16
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
agatggcact tgtggcttag 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ttggtgtcct tgtccctcat 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atcaaacgtt cggatgctcg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
atgtctgata atggacccca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctggcagtaa ccagaatgga 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cggccccaag gtttacccaa 20
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
aacaaaccca agggctataa agg 23
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ttgctacgcc agcgtctgt 19
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ttgctttccc cttgcc 16
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ttaccttagg acttgccatt gga 23
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cgcaaaccca gccttcaa 18
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tcccaatgca caagaacaaa caggc 25
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gataacgccg tacttctcgt c 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
attcaggcga actatggcat c 21
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ccatctatgc cgtctgcgag gt 22
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggctcatatc atcaggaaca 20
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tcgtcttcat cacttggtc 19
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ccaatcagcc acctatcgtc ttgc 24
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gtcgcccatc tcacactc 18
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
aacggcttcc tataygaagt a 21
<210> 93
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tgccttccac attccactta gcgact 26

Claims (9)

1.一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于该微流控芯片有三层，上下两层为盖片，中间层为芯片基片，其中所述的芯片基片上有一个进样孔、多个反应孔和连接进样孔和反应孔的微流路，将芯片基片与上下盖片焊接形成密闭的反应池，反应池内包被固定有能扩增特异靶基因序列的引物和探针组，所述微流控芯片内设有扩增对照、空白对照和提取对照，所述扩增对照为RnaseP基因，提取对照为酵母DNA；用于检测RnaseP的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所示；用于检测酵母DNA的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93所示。
2.根据权利要求1所述的用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于盖片厚度10-200μm，由PDMS、玻璃、PC等透明材质制成。
3.根据权利要求1所述的用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于芯片基片进样孔为一个带气孔的立柱，所述立柱为圆形，高2-3mm，直径2mm，用于抽真空和进样。
4.根据权利要求1所述的用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于所述呼吸道病原体为新型冠状病毒(SARS-Cov-2)、冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、腺病毒通用、腺病毒3型、腺病毒7型、腺病毒55型、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、肠道病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒(HPIV1)、人副流感病毒(HPIV2)、人副流感病毒(HPIV3)、人副流感病毒(HPIV4)、博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和百日咳杆菌。
5.用于检测权利要求4中所述生物病原体的引物和探针，其特征在于：
用于检测乙型流感病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示；
用于检测腺病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；
用于检测腺病毒3型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9所示；
用于检测腺病毒7型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12所示；
用于检测腺病毒55型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15所示；
用于检测副流感病毒1型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示；
用于检测副流感病毒2型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示；
用于检测副流感病毒3型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示；
用于检测副流感病毒4型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示；
用于检测冠状病毒229E的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示；
用于检测冠状病毒NL63的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33所示；
用于检测冠状病毒HKU1的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36所示；
用于检测冠状病毒OC43的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39所示；
用于检测呼吸道合胞病毒A型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42所示；
用于检测呼吸道合胞病毒B型的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45所示；
用于检测甲型流感病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48所示。
用于检测甲型流感病毒H7N9的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51所示；
用于检测甲型流感病毒H5N1的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54所示；
用于检测甲型流感病毒H3N2的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57所示；
用于检测甲型流感病毒H1N1(2009)的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:58、SEQID NO:59、SEQ ID NO:60所示；
用于检测肠道病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63所示；
用于检测鼻病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66所示；
用于检测人偏肺病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQID NO:69所示；
用于检测新型冠状病毒orf1ab基因的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:70、SEQID NO:71、SEQ ID NO:72所示；
用于检测新型冠状病毒N基因的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75所示；
用于检测肺炎衣原体的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQID NO:78所示；
用于检测肺炎支原体的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQID NO:81所示；
用于检测百日咳杆菌的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQID NO:84所示；
用于检测博卡病毒的上、下游引物和探针分别如SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87所示。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配制各病原体、扩增对照和提取对照对应的引物探针混合物，备用；
(2)将盖片和芯片基片清洗烘干；
(3)将芯片基片带立柱面与下盖片焊接，形成半封闭反应池；
(4)用移液器取1ul引物探针混合物点制到对应的反应池内，晾干；
(5)封接上盖片，形成封闭的微流控芯片；
(6)用真空装置将微流控芯片抽真空后，将气孔封闭。
7.根据权利要求6所述的一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，扩增对照的引物探针混合物中还加有酵母菌DNA模板。
8.根据权利要求6所述的一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，引物探针混合物中，引物和探针的终浓度为1-2μmol/L，优选1μmol/L。
9.一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片，步骤如下：
(1)样本处理和模板提取，得到待检模板；
(2)配制RT-PCR扩增试剂，并与待检模板混合，制成扩增体系；
(3)取注射器吸取扩增体系，刺破加样孔，将液体注入微流控芯片内，待液体注满微流控芯片后，拔出注射器，用密封胶封死加样孔；
(4)将微流控芯片放入配套核酸扩增分析仪中进行扩增；
(5)扩增完毕，由核酸扩增分析仪自带软件进行数据处理和分析。
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