CN116144840B - 引物组、探针组、检测产品及其应用 - Google Patents

引物组、探针组、检测产品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针组、检测产品及其应用。本发明提供了引物组，包括：引物组1至引物组7中的一个或多个。本发明提供的试剂盒检测靶标覆盖了6种呼吸道病原体，其具有特异性好，灵敏度高，多联检、操作简便快速等优点，同时配合全封闭的PCR扩增与层析的全自动检测微流控芯片，适用于对呼吸道病原体的快速检测。

Description

引物组、探针组、检测产品及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针组、检测产品及其应用。
背景技术
呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占主要地位，每年流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染多伴有鼻炎、咳嗽、咽炎、全身发热等症状，下呼吸道感染包括气管炎、支气管炎和肺炎。急性呼吸道感染(acute respiratorytractinfection，ARTI)可发生于呼吸道的任何部位，是最常见的感染性疾病之一，尤其是下呼吸道感染，是所有感染性疾病的主要死因。当下新型冠状病毒(Novel Coronavirus，2019-nCoV)全球大流行，波及211个国家和地区，已成为影响全球的严重公共卫生事件。新型冠状病毒肺炎目前仍无特效疗法，早期诊断并及时防控是阻止疫情继续传播的关键。引起呼吸道感染的病原体种类很多，包括细菌、病毒、支原体和衣原体等。相关研究显示肺炎支原体肺炎占社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia，CAP)的10％～40％，在所有非典型病原感染所导致的CAP中所占的比例超过了50％；我国的一项调查研究显示，肺炎支原体肺炎在成人CAP中占比高达20.7％，已经超过了肺炎链球菌，成为成人CAP的首要病原；在儿童感染方面，MP肺炎患儿混合其他病原感染达51.2％，其中肺炎衣原体占25.9％，病毒占14.4％，细菌占10.9％。肺炎衣原体是CAP中另一种常见感染方式，占比6％～19％。由于地域差异、人群特征、病原体检测技术和监测时间不同，导致不同国家、不同地区ARTI和CAP的流行病学特征、常见致病原的组成结构及耐药特性存在明显差异。根据近年来流行病学调查发现由病毒和非典型病原体所引发的病毒性肺炎和非典型肺炎在婴幼儿、儿童、青壮年和老年人中的发病率逐渐上升，病毒和非典型病原体已经成为ARTI和CAP主要病原体之一。ARTI和CAP的病原体包括：甲型流感病毒(InfluenzaA，IFA)、乙型流感病毒(InfluenzaB，IFB)、新型冠状病毒(Novel Coronavirus，2019-nCoV)、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus，RSV)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae，CP)和肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)等。在国内的临床诊断中，限于诊疗条件，很多呼吸道感染患者无法接受更准确的诊断，往往采用广谱抗生素治疗，临床上约有20％～25％的抗生素使用不合理。这样不仅难以达到最佳的治疗效果，还可能耽误病情，或诱导细菌耐药性的产生及更为复杂的二重感染等。呼吸道感染往往存在多种病原体混合感染的情况，临床医生需综合考虑何种病原或多种病原的共同作用是引起肺炎患者住院的主要原因。
由于ARTI和CAP疾病的病原谱复杂、发病率高，多联检的核酸检测产品极少，针对ARTI和CAP呼吸道疾病的早期诊断，仍有许多问题急需解决：(1)ARTI和CAP常见的呼吸道病原体种类多样，且多数病例为混合感染，故要求检测试剂盒可实现多种病原体的平行检测，要求特异性好，灵敏度高。(2)ARTI和CAP常见的呼吸道病原体包括DNA病毒，RNA病毒，支原体和衣原体等，故要求检测试剂盒具备同时检测DNA和RNA的能力，多指标联检对引物和探针的特异性及性能优化要求高。(3)多数ARTI和CAP为急性病、集中暴发流行，故要求检测试剂盒具备操作简便、快速和高通量检测的能力。因此，早期快速，准确，多指标联合的病原体检测可以有效的指导临床用药，还可以根据不同的疫情采取针对性预防措施，控制ARTI和CAP的暴发与传播。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了引物组、探针组、检测产品及其应用。本发明提供的试剂盒检测靶标覆盖了6种呼吸道病原体，其具有特异性好，灵敏度高，多联检、操作简便快速等优点，同时配合全封闭的PCR扩增与层析的全自动检测微流控芯片，适用于对呼吸道病原体的快速检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物组，包括：引物组1至引物组7中的一个或多个；
引物组1：用于扩增2019-nCoV-ORF1ab的引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组2：用于扩增2019-nCoV-N的引物组具有：
(5)、如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组3：用于扩增IFA的引物组具有：
(9)、如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或
(10)、与(9)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(9)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(11)、与(9)或(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(9)或(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(12)、与(9)、(10)或(11)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组4：用于扩增IFB的引物组具有：
(13)、如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(14)、与(13)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(13)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(13)或(14)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(16)、与(13)、(14)或(15)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组5：用于扩增RSV的引物组具有：
(17)、如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；或
(18)、与(17)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(17)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(19)、与(17)或(18)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(17)或(18)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(20)、与(17)、(18)或(19)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组6：用于扩增MP的引物组具有：
(21)、如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；或
(22)、与(21)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(21)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(23)、与(21)或(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(21)或(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(24)、与(21)、(22)或(23)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
引物组7：用于扩增CP的引物组具有：
(25)、如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；或
(26)、与(25)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(25)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(27)、与(25)或(26)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(25)或(26)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(28)、与(25)、(26)或(27)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:1的序列为：CAGACAATGCTTTTCACTATGCT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:2的序列为：TGGCTGCTGTTGTAAGAGGT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:3的序列为：TGAAACTCAAGCCTTACCGC。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:4的序列为：GCTCATGGATTGTTGCAATTGT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:5的序列为：GAGGCTCTCATGGAGTGGCT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:6的序列为：CTACGCTGCAGTCCTCGCT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:7的序列为：GCAAGGCAAAAGATAAAGGAGG。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:8的序列为：CCATTGGGGTGTTTGAGGAA。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:9的序列为：AGGTGGGGCAAATATGGAAAC。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:10的序列为：ATGCAGGATCATCATCTTTT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:11的序列为：TCTCTCCCGACGTTTTCCAA。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:12的序列为：ACCGCCTGTAATCATCGTCT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:13的序列为：GCACTTTCATGGGAGCCTTT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:14的序列为：GCGCATTCCAAAAGCTTCAC。
在本发明的一些实施方案中，所述引物组还包括标签序列和第一显色标记物；所述第一显色标记物包括：生物素；
所述引物组1的所述标签序列具有：
(29)、如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；或
(30)、与(29)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(29)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(31)、与(29)或(30)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(29)或(30)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(32)、与(29)、(30)或(31)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组2的所述标签序列具有：
(33)、如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；或
(34)、与(33)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(33)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(35)、与(33)或(34)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(33)或(34)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(36)、与(33)、(34)或(35)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组3的所述标签序列具有：
(37)、如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；或
(38)、与(37)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(37)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(39)、与(37)或(38)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(37)或(38)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(40)、与(37)、(38)或(39)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组4的所述标签序列具有：
(41)、如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；或
(42)、与(41)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(41)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(43)、与(41)或(42)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(41)或(42)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(44)、与(41)、(42)或(43)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组5的所述标签序列具有：
(45)、如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；或
(46)、与(45)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(45)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(47)、与(45)或(46)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(45)或(46)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(48)、与(45)、(46)或(47)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组6的所述标签序列具有：
(49)、如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；或
(50)、与(49)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(49)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(51)、与(49)或(50)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(49)或(50)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(52)、与(49)、(50)或(51)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
所述引物组7的所述标签序列具有：
(53)、如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；或
(54)、与(53)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(53)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(55)、与(53)或(54)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(53)或(54)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(56)、与(53)、(54)或(55)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组还包括内标扩增引物对，其具有：
(57)、如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；或
(58)、与(57)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(57)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(59)、与(57)或(58)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(57)或(58)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(60)、与(57)、(58)或(59)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:15的序列为：CAGAGCACAGAGACACCACT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:16的序列为：GGCGCTCATCTTCATTCAGG。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:17的序列为：CACGGTAAAGTCGAATCG。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:18的序列为：TCCCGCTAGCTTGCTAATCC。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:19的序列为：ATAATCGACTAATCCGTT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:20的序列为：GTAAGAGGTCATTGTTTCGAT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:21的序列为：ACAAGAGACTGGTTACTTAGACG。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:22的序列为：CGTCTAAGTAACCAGTCTCTTGT。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:23的序列为：GCTTCAAGGCTCTACCGG。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述SEQ ID NO:24的序列为：GCTCTAGCCACCAATGAATCTAA。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述内标扩增引物对还包括标签序列和第一显色物；所述第一显色物包括：生物素；
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述内标扩增引物的所述标签序列具有：
(61)、如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；或
(62)、与(61)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(61)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(63)、与(61)或(62)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(61)或(62)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(64)、与(61)、(62)或(63)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述标签序列连接于所述引物组的正向引物5’端，所述第一显色标记物连接于所述引物组的反向引物5’端。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中所述正向引物的5’端与所述标签序列的连接处加入间臂。
在本发明的一些实施方案中，上述引物组中，所述间臂包括：C3spacer间臂。
本发明还提供了探针组，包括：探针组1至探针组7中的一个或多个；
探针组1：用于扩增2019-nCoV-ORF1ab的探针具有：
(65)、如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列；或
(66)、与(65)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(65)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(67)、与(65)或(66)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(65)或(66)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(68)、与(65)、(66)或(67)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组2：用于扩增2019-nCoV-N探针具有：
(69)、如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；或
(70)、与(69)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(69)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(71)、与(69)或(70)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(69)或(70)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(72)、与(69)、(70)或(71)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组3：用于扩增IFA的探针具有：
(73)、如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列；或
(74)、与(73)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(73)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(75)、与(73)或(74)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(73)或(74)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(76)、与(73)、(74)或(75)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组4：用于扩增IFB的探针具有：
(77)、如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；或
(78)、与(77)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(77)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(79)、与(77)或(78)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(77)或(78)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(80)、与(77)、(78)或(79)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组5：用于扩增RSV的探针具有：
(81)、如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列；或
(82)、与(81)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(81)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(83)、与(81)或(82)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(81)或(82)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(84)、与(81)、(82)或(83)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组6：用于扩增MP的探针具有：
(85)、如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；或
(86)、与(85)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(85)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(87)、与(86)或(87)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(86)或(87)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(88)、与(85)、(86)或(87)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；和/或
探针组7：用于扩增CP的探针具有：
(89)、如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列；或
(90)、与(89)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(89)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(91)、与(89)或(90)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(89)或(90)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(92)、与(89)、(90)或(91)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组还包括内标探针，其具有：
(93)、如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列；或
(94)、与(93)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(93)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(95)、与(93)或(94)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(93)或(94)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(96)、与(93)、(94)或(95)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组1的序列与所述引物组1的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组2的序列与所述引物组2的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组3的序列与所述引物组3的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组4的序列与所述引物组4的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组5的序列与所述引物组5的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组6的序列与所述引物组6的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述探针组7的序列与所述引物组7的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述内标探针与所述内标扩增引物的所述标签序列互补。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:25的序列为：GTGCCATTTCAGCTTAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:26的序列为：AGGGCGATCGAACGATTAGG。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:27的序列为：TATTAGCTGATTAGGCAA。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:28的序列为：CATTCTCCAGTAACAAAGCTA。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:29的序列为：TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:30的序列为：GCAGATTCATTGGTCAGAGAACA。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:31的序列为：CGAAGTTCCGAGATGGCC。
在本发明的一些实施方案中，上述探针组中所述SEQ ID NO:32的序列为：CGAGATCGGTGGTTACTTAGATT。
本发明还提供了上述引物组和/或上述探针组在制备检测呼吸道疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测产品，包括上述引物组和/或上述探针组以及可接受的助剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，包括试剂盒和/或试剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，还包括：微流控芯片。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，还包括：酶混合液、引物工作液、DEPC处理水、阴性质控品、阳性质控品和干燥剂；所述酶混合液包括：反转录酶、热启动DNA酶、dNTPs、MgCl2和RNA酶抑制剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，还包括内标模板，所述内标模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:40的序列为：CAGAGCACAGAGACACCACTGACGTGCCTGAGATGCCTCACTCCAAGGGCCAGGGAGAGA GCGATCCTCTGGACCATGAGCCTGCCGTGTCTCCATTGCTCCCTCGAAAAGAGCGAG GTCCCCCGGAGGGCGGCCTGAATGAAGATGAGCGCC。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述引物工作液包括上述引物组和内标模板。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述工程菌液和所述假病毒颗粒的工作浓度为1x105 copies/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述内标模板的浓度为1x105copies/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述引物组中所述引物组1～所述引物组7中每条引物的浓度为0.1μM～0.5μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述引物组中所述引物组1～所述引物组7中每条引物的浓度为0.2μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述阴性质控品包括无菌纯化水；所述阳性质控品包括含有检测RSV目的扩增序列的假病毒颗粒；所述检测RSV目的扩充序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:33的序列为：CAGACAATGCTTTTCACTATGCTTAGAAAGTTGGATAATGATGCACTCAACAACATTATCA ACAATGCAAGAGATGGTTGTGTTCCCTTGAACATAATACCTCTTACAACAGCAGCC A。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:34的序列为：TGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCT GCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:35的序列为：AGGCTCTCATGGAGTGGCTGAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT AGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:36的序列为：GCAAGGCAAAAGATAAAGGAGGAAGTAAACACTCAGAAAGAAGGGAAGTTCCGTTTGAC AATAAAAAGGGATATGCGTAATGTATTGTCCTTGAGAGTGTTGGTAAATGGAACATT CCTCAAACACCCCAATGG。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:37的序列为：AGGTGGGGCAAATATGGAAACATACGTGAACAAGCTTCACGAAGGCTCCACATACACAGC AGCTGTTCAGTACAATGTTCTAGAAAAAGATGATGATCCCGCAT。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:38的序列为：TCTCTCCCGACGTTTTCCAACATCGGCGTCGGCCTCAAAGCGAATGTCCAAGCCACCCTCGGGGGCAGTCAGACGATGATTACAGGCGGT。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述SEQ ID NO:39的序列为：GCACTTTCATGGGAGCCTTTGGCGGAGAGTTCGGAGGTGGAAGCTTCTTTGATGGTCTTTTTGGTGGGCTTGGTGAAGCTTTTGGAATGCGC。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述微流控芯片包括：主芯片、扩增芯片和层析膜条；所述层析膜条包括：硝酸纤维膜和显色微球。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述主芯片设有加样腔和层析腔；所述加样腔用于PCR反应体系加样，底部连接第一通道。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述层析腔与第三通道连通。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述扩增芯片设有扩增腔室，连接第二通道和所述第三通道，与所述第一通道连通，用于PCR反应体系的扩增，与所述主芯片可拆卸连接。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述显色微球包括第二显色标记物；所述第二显色标记物包括链霉亲和素。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述第一显色标记物与所述第二显色标记物连接后显色。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述显色微球富集后显蓝色。
在本发明的一些实施方案中，上述检查产品中，所述显色微球为乳胶微球。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中所述硝酸纤维膜至少附着上述探针组中的任意一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述硝酸纤维素膜上还附着有所述内标探针。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针组中所述探针组1～所述探针组7相邻所述探针之间的距离为0.5mm～1.0mm；所述内标探针与所述探针组1的距离为0.6mm～0.8mm。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针组中所述探针组1～所述探针组7相邻所述探针之间的距离为0.5mm；所述内标探针与所述探针组1的距离为0.8mm。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述层析腔放置有层析膜条，用于结果判读，PCR扩增产物与所述微球发生复溶和释放，释放后的扩增产物与所述层析膜条上的所述探针进行杂交并固定，通过有无蓝色条带进行定性判读。
本发明提供了引物组1～引物组7以及探针组1～探针组7、检测产品及其应用。
本发明的有益效果包括：
(1)特异性强：本发明选择病原体的基因检测区域为特异性的保守区域，基因扩增引物是针对此保守序列设计，经NCBI数据库的blast软件评估保守序列和引物的特异性，有效避免了非特异性扩增及多重引物间的非特异性交叉反应，特异性强、覆盖面广。
(2)灵敏度高：本发明通过优化引物量、探针量及反应体系扩增效率，可检测到100copies/mL的病原体浓度(现有技术灵敏度为500copies/mL)。
(3)多指标联检涵盖新型冠状病毒：本发明可同时检测多达6种ARTI和CAP的呼吸道病原体，兼顾病毒和非典型病原体等多种类型，覆盖面广、病原体种类多，其可为疾控中心、医院等医疗机构提供一个准确、多靶点的平行检测试剂盒。
(4)结合全自动化的核酸检测设备，实现全自动化检测，减少了污染的可能性。
(5)采用内标系统：能够监控假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制物或操作失误所导致假阴性。
(6)检测通道多：本发明杂交膜条固定的8种探针序列，经NCBI数据库软件评估及实验验证，相互间均无任何交叉反应，特异性强，可应用于多种复杂病原体结构的疾病检测或病原体亚型分型。
(7)快速检测：本发明在室温下进行杂交反应，反应时间为5～10min，可直接判读或连接软件分析，扩增和杂交的整个检测过程时长控制在40min内(现有技术在1小时内)，结果分析速度快。
(8)污染少：扩增产物无需开盖可直接在微流控芯片内显色(现有技术扩增产物需开盖)。
(9)操作简便、成本低：依赖普通PCR扩增仪，无需昂贵的荧光PCR仪器、杂交仪等，检测成本低，对技术人员专业要求低，操作简便，便于在常规检测中推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本试剂盒的检测原理和流程示意图；
图2示标准比色卡；
图3示微流控芯片；
图4示临床样本检测结果；其中：1-10为临床样本(1为IFA，2为CP，3为RSV，4为IFA，5为IFB，6为MP，7-10阴性)，11为阴性质控品为无菌纯化水，12为阳性质控品为含有RSV扩增目的序列的假病毒颗粒；
图5示分析灵敏度结果；其中：a为2019-nCov(1-3为2019-nCov，4为阴性)，b为IFA(1-3为IFA，4为阴性)，c为IFB(1-3为IFB，4为阴性)，d为RSV(1-3为RSV，4为阴性)，e为MP(1-3为MP，4为阴性)，f为CP(1-3为CP，4为阴性)，1-4质粒的浓度为5x103copies/mL，500copies/mL，100copies/mL，20copies/mL；
图6示分析特异性结果；其中：1为腺病毒，2为偏肺病毒，3为博卡病毒，4为鼻病毒，5为鹦鹉热衣原体，6为肺炎链球菌，7为白色念珠菌，8为阴性质控品，9为阳性质控品；
图7示本试剂盒与现有技术灵敏度比较结果；其中：a为现有技术灵敏度结果，b为本发明试剂盒灵敏度结果，a-1(1为IFA，2-3为阴性)和b1(1-2为IFA，3为阴性)为IFA灵敏度结果，a-2(1为IFB，2-3为阴性)和b2(1-2为IFB，3为阴性)为IFB灵敏度结果，a-3(1为RSV，2-3为阴性)和b3(1-2为RSV，3为阴性)为RSV灵敏度结果，1-3为标准品的浓度为500，100，20copies/mL。
具体实施方式
本发明公开了引物组、探针组、检测产品及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种用于呼吸道病原体的扩增引物对，所述扩增引物对包括2019-nCoV-ORF1ab基因扩增引物对、2019-nCoV-N基因扩增引物对、IFA扩增引物对、IFB扩增引物对、RSV扩增引物对、MP扩增引物对和CP扩增引物对。
所述2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:17所示的标签序列，2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色；2019-nCoV-N扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，2019-nCoV-N扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:18所示的标签序列，2019-nCoV-N扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；IFA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示，IFA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:19所示的标签序列，IFA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；IFB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7～SEQID NO:8所示，IFB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:20所示的标签序列，IFB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；RSV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示，RSV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:21所示的标签序列，RSV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；MP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示，MP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:22所示的标签序列，MP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；CP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示，CP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:23所示的标签序列，CP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；
正向引物的5’端与标签序列的连接处加入间臂。
作为上述技术方案的改进，第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集显示蓝色的乳胶微球；所述间臂是C3spacer间臂。
作为上述技术方案的改进，所述扩增引物由2019-nCoV-ORF1ab基因扩增引物对、2019-nCoV-N基因扩增引物对、IFA扩增引物对、IFB扩增引物对、RSV扩增引物对、MP扩增引物对和CP扩增引物对组成。
另外，本发明还提供了一种用于检测急性和社区获得性肺炎的呼吸道病原体的体外诊断装置微流控芯片(如图3所示)，其包括主芯片和扩增芯片，所述主芯片设有加样腔和层析腔，加样腔用于PCR反应体系的加样，底部连通第一流道。层析腔放置了层析膜条，用于结果判读，PCR扩增产物与蓝色乳胶微球发生复溶和释放，释放后的扩增产物与膜条上的探针进行杂交并固定，通过有无蓝色条带进行定性判读。层析腔与第三流道连通。扩增芯片设有扩增腔室，连通第二，第三流道，与所述第一流道连通，用于PCR反应体系的扩增，与主芯片可拆卸连接。层析膜条包括聚氯乙烯板和蓝色乳胶微球，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下一种探针：P1～P7，P1的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，P2的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，P3的碱基序列如SEQ ID NO:27所示，P4的碱基序列如SEQ ID NO:28所示，P5的碱基序列如SEQ ID NO:29所示，P6的碱基序列如SEQ ID NO:30所示，P7的碱基序列如SEQ ID NO:31所示。
上述的微流控芯片，工作时，将PCR反应体系加入到加样腔室内部，然后使加样腔室内部的液体通过第一流道与第二流道进入到扩增腔室，在扩增腔室内部完成核酸扩增反应，完成核酸扩增反应后的样本通过第三流道输送到层析腔室，与层析腔室内部的层析膜条进行分子杂交反应，待反应结束后进行结果分析。如此可见，一方面，PCR产物是直接进入到层析腔室内部，无需通过移液枪进行转移，在密闭环境下完成作业，避免扩增产物对外界的污染，极大地提高检测的安全性和可靠性。另一方面，由于扩增芯片与主芯片可拆卸连接，这样生产制造时，扩增芯片可以与主芯片分开制作，然后组装在一起，不仅使得产品结构简化，同时能便于批量化生产扩增芯片，并与主芯片组装在一起，成本低廉。
另外，本发明还提供了一种用于急性和社区获得性肺炎呼吸道检测的试剂盒，其包括所述的扩增引物对，以及体外诊断装置微流控芯片。
作为上述技术方案的改进，硝酸纤维膜上还附着有内标探针P0，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO:32所示。
作为上述技术方案的改进，硝酸纤维膜上从上至下依次附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7，所述杂交膜条上的探针与扩增引物对相匹配。P1～P7相邻探针之间的固定距离为0.5mm，P0与P1之间的固定距离为0.8mm。
另外，本发明还提供一种用于检测急性和社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，其包括所述的扩增引物对，以及外诊断装置微流控芯片；
所述的外诊断装置微流控芯片包括主芯片和扩增芯片，主芯片设有加样腔和层析腔，扩增芯片设有扩增腔室。层析腔内含有杂交膜条，层析膜条包括聚氯乙烯板和蓝色乳胶微球，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下一种探针：P1～P7，P1的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，P2的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，P3的碱基序列如SEQ ID NO:27所示，P4的碱基序列如SEQ ID NO:28所示，P5的碱基序列如SEQ ID NO:29所示，P6的碱基序列如SEQ ID NO:30所示，P7的碱基序列如SEQ ID NO:31所示。所述杂交膜条上的探针与扩增引物对相匹配。
作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括内标模板，所述内标模板的碱基序列SEQ ID NO:40所示；所述扩增引物对还包括内标扩增引物对，所述内标扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示，内标扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:24所示的标签序列，内标扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述硝酸纤维膜上还附着有内标探针，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO:32所示；
所述第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。
作为上述技术方案的改进，所述试剂盒包括A盒和B盒，A盒包含酶混合液、引物工作液、DEPC处理水、阴性质控品和阳性质控品，B盒包含微流控芯片和干燥剂。所述酶混合液包含反转录酶、热启动DNA酶、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和RNA酶抑制剂。所述阴性质控品为无菌纯化水，阳性质控品为含有RSV目的扩增序列的假病毒颗粒，所述病原体目的扩增序列的碱基序列如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示。
作为上述技术方案的更进一步改进，引物工作液由2019-nCoV-ORF1ab基因扩增引物对、2019-nCoV-N基因扩增引物对、IFA扩增引物对、IFB扩增引物对、RSV扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、内标扩增引物对和内标模板组成。
所述微流控芯片包括主芯片，扩增芯片和层析膜条。层析膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7。
P1～P7相邻探针之间的固定距离为0.5mm，P0与P1之间的固定距离为0.8mm。
扩增引物对、探针的设计：
针对呼吸道病原体的核酸信息，进行同源性比对分析，选择病原体特异性的保守序列，设计特异性的引物；所述保守序列为：SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39(如表3所示)。
引物和探针：利用primer 3、primer 5和Oligo 6.0等软件设计而成，在正向引物的5’端连接有与杂交探针互补的标签(Tag)序列，在连接处加入C3 spacer间臂，在反向引物的5’端连接Biotin标记(如图1所示)；扩增引物对的碱基序列为SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:16(如表2所示)；探针的碱基序列为SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32(如表1所示)，标签序列为SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:24(如表1所示)。
该探针和Tag序列与膜条平台相关(由膜条平台决定的，用于结果显色)，与PCR扩增无关。探针与正向引物连接在一起，探针用于与膜条上的Tag杂交显色，引物用于扩增，如图1所示。
表1检测病原体、探针序列和Tag序列
表2检测病原体引物序列
表3检测病原体的保守序列与内标序列
本发明实施例1～实施例4中，酶混合液购自美国迈迪安生命科学公司：一步法RT-PCR混合液；
本发明实施例1～实施例4中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例提供了一种用于检测急性与社区获得性呼吸道病原体的试剂盒，包括A盒和B盒，A盒包含酶混合液、引物工作液、DEPC处理水、阴性质控品和阳性质控品，B盒包含微流控芯片和干燥剂。
酶混合液包含反转录酶、热启动DNA酶、dNTPs、MgCl2和RNA酶抑制剂。所述阴性质控品为无菌纯化水，阳性质控品为含有检测病原体目的扩增序列的克隆菌液或假病毒颗粒，病原体目的扩增序列如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示。工程菌合假病毒的浓度均为1×105copies/mL，内标模板的浓度为1×105copies/mL，扩增引物对中每种引物的浓度为0.2μM。
引物工作液包括扩增引物对和内标模板。扩增引物对包括2019-nCoV-ORF1ab基因扩增引物对、2019-nCoV-N基因扩增引物对、IFA扩增引物对、IFB扩增引物对、RSV扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对和内标扩增内标引物对。内标模板序列如SEQ ID NO:40所示；
2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:17所示的标签序列，2019-nCoV-ORF1ab扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素，微球富集后显色；2019-nCoV-N扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，2019-nCoV-N扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:18所示的标签序列，2019-nCoV-N扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；IFA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示，IFA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:19所示的标签序列，IFA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；IFB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:7～SEQID NO:8所示，IFB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:20所示的标签序列，IFB扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；RSV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示，RSV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:21所示的标签序列，RSV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；MP扩增引物对的碱基序列如SEQID NO:11～SEQ ID NO:12所示，MP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:22所示的标签序列，MP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；CP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示，CP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ IDNO:23所示的标签序列，CP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；内标扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示，内标扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO:24所示的标签序列，内标扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；正向引物的5’端与标签序列的连接处加入C3spacer间臂；
微流控芯片包括主芯片和扩增芯片。主芯片包括加样腔和层析腔。层析腔里面有层析膜条，层析膜条包括聚氯乙烯板和蓝色乳胶微球，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7。
P1～P7相邻探针之间的固定距离为0.5mm，P0与P1之间的固定距离为0.8mm。P0～P7的碱基序列如SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32所示。
实施例2
采用上述实施例1中的检测试剂盒，本实施例出示了临床样本的检测数据。临床样本为已知感染病原体的ARTI和CAP患者的鼻咽拭子、肺泡灌洗液或痰液样本(如表4所示，“/”表示无临床确认的感染病原体类型，这些样本检测为阴性)。
检测步骤流程如下：
1、临床样本的预处理
(1)咽拭子样本：将拭子样本放入1.0mL的生理盐水中充分洗涤、贴壁挤干，丢弃拭子，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用；
(2)肺泡灌洗液样本：取1.0mL样本，12000rpm离心5min，弃上清，再加入1.0mL的生理盐水洗涤1次，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用；
(3)痰液样本：
a、向痰液样本保存管中加入2倍体积的4％NaOH溶液，充分振荡，室温处理20min，使其充分液化；
b、取1.0mL液化后的痰液样本，12000rpm离心5min，弃上清；
c、加入1.0mL的生理盐水，充分振荡，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用。临床样本的核酸提取，经验证推荐使用商品化的核酸提取试剂盒，RNA/DNA共提取，如：广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(备案号：粤穗械备20150224号)，严格按照产品说明书要求操作，取临床样本预处理后的沉淀，提取样本核酸。
2、检测试剂盒用于检测临床样本的操作步骤为：
(1)试剂准备：参照表4中单个测试反应体系的组分和用量，根据待测样本及质品的数量(N)配制反应体系，震荡混匀，短暂离心；
表4反应体系配方表
主要组成 加入量(μL)/测试
酶混合液 10
工作液 2
DEPC处理水 8
核酸 20
合计 40
(2)加样：根据上述推荐配合使用的提取试剂盒提取待测样本和各质控品的核酸，按上述表格向反应体系中加20μL核酸模板，震荡混匀10秒，短暂离心5秒；
(3)PCR扩增：将反应体系转入的微流控芯片的加样腔，再通过第二流道进入扩增腔，放入基因扩增仪中，按照表5设置反应程序进行PCR扩增平行检测；
表5PCR反应程序参数
(4)层析杂交：PCR扩增结束后，PCR产物通过微流控芯片的第三流道输送到层析腔室。5min～10min快速杂交反应后即可判读结果。
(5)结果分析：如图2所示的标准比色卡所示区域的条带相对位置进行定性判读，亦可参照下表，对显色结果进行拍照保存。
表6结果判读
结果 质控区 检测区 判读
1 有/无蓝色条带 有蓝色条带 阳性
2 有蓝色条带 无蓝色条带 阴性
3 无蓝色条带 无蓝色条带 复测
质量控制的标准如下：
1)阴性质控品应出现1条蓝色条带，位于质控线(内标)，且检测线(T线)没有条带或强度＜L4；
2)阳性质控品应出现≥2条蓝色条带，分别位于质控线(内标)和检测限(T线)，强度≥L4；
3)若样本检测为阴性，则质控线(内标)条带强度应≥L2，样本有效；
4)若样本检测为阳性，则质控线(内标)条带强度可强可弱，甚至无条带，样本有效；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验视为无效，需重新进行检测。
如表7所示，根据检测结果分析可知，阳性样本6例，阴性样本4例，阳性样本的膜条检测结果显示病原体的种类与已知感染病原体的种类一致，与临床结果符合率100％(如图4所示)。将上述部分阳性样本的PCR扩增产物，送深圳华大基因股份有限公司测序得到产物序列，将其输入NCBI数据库中，利用blast软件进行比对分析，确认病原体的种类是否与膜条检测结果一致。根据检测结果可知，测序反馈结果与膜条检测结果一致(如表8所示)，说明本发明试剂盒的检测特异性高。
表7临床样本检测结果
编号 样本类型 临床信息 检测结果 测序结果
1 鼻咽拭子 IFA IFA IFA
2 鼻咽拭子 CP CP CP
3 肺泡灌洗液 RSV RSV RSV
4 肺泡灌洗液 IFA IFA IFA
5 痰液样本 IFB IFB IFB
6 痰液样本 MP MP MP
7 鼻咽拭子 阴性 阴性 阴性
8 肺泡灌洗液 阴性 阴性 阴性
9 痰液样本 阴性 阴性 阴性
10 痰液样本 阴性 阴性 阴性
表8本发明试剂盒与测序法一致结果
实施例3
为证明本发明的合理性和可行性，对实施例1获得的检测试剂盒进行了以下性能评估研究：
(1)分析灵敏度测试
企业参考品的配制：2019-nCoV为假病毒颗粒，IFA，IFB，RSV均来源于中国食品药品检定研究院，MP，CP为工程菌。提取假病毒颗粒，参考品和工程菌的核酸，测定核酸浓度，按相关公式进行拷贝数换算，再用0.2×TE将核酸样本进行梯度稀释和检测。将企业自制的参考品1x105copies/mL梯度稀释成5x103copies/mL、500copies/mL、100copies/mL和20copies/mL。
表9参考品信息
参考品 来源 浓度(copies/mL)
2019-nCoV 山东维真生物科技有限公司 5x103，500，100，20
IFA 中国食品药品检定研究院 5x103，500，100，20
IFB 中国食品药品检定研究院 5x103，500，100，20
RSV 中国食品药品检定研究院 5x103，500，100，20
MP 生工生物工程(上海)股份有限公司 5x103，500，100，20
CP 生工生物工程(上海)股份有限公司 5x103，500，100，20
按上述实施例中试剂盒的检测方法对各浓度梯度的参考品进行检测，膜条检测结果如图5所示。根据表10检测结果可知，本发明试剂盒的最低检测限为100copies/mL，具有很高的灵敏度。
表10各浓度梯度的参考品检测结果
病原体类型 5×103copies/mL 500copies/mL 100copies/mL 20copies/mL
2019-nCoV 2019-nCoV 2019-nCoV 2019-nCoV 阴性
IFA IFA IFA IFA 阴性
IFB IFB IFB IFB 阴性
RSV RSV RSV RSV 阴性
MP MP MP MP 阴性
CP CP CP CP 阴性
(2)特异性测试
按上述实施例中试剂盒对的检测方法对本发明中所述6种病原体以外的其它病原体进行检测(如表11所示)，根据检测结果可知，本发明试剂盒具有很高的特异性，无交叉反应(如图6所示)。
表11交叉特异性检测结果
实施例4
为证明本发明的灵敏度高，同时与现有技术进行对比，严格按照试剂盒说明进行检测，检测结果如表13和图7所示。
PCR模板：中国食品药品检定研究院购买标准参考品(如表12所示)，提取参考品的核酸，测定核酸浓度，按相关公式进行拷贝数换算，再用0.2×TE将核酸样本进行梯度稀释和检测。
表12参考品浓度信息
参考品 检测浓度(copies/mL)
IFA 500，100，20
IFB 500，100，20
RSV 500，100，20
表13检测结果
由上述实施例可知，本发明提供了一种针对急性和社区获得性肺炎常见的呼吸道病原体核酸的检测试剂盒，具有特异性好、灵敏度高、检测靶点多、操作简便快速等优点。本发明可同时检测6种ARTI和CAP呼吸道病原体，覆盖面广、病原体种类多，可为疾控中心、医院等医疗机构提供一个准确、多靶点的平行检测试剂盒，结合全自动化的核酸检测设备，实现全自动化检测。设置内标系统，可对检测过程中潜在的PCR抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进行质量控制。设置阴性质控品和阳性质控品可对样本核酸提取过程进行质量控制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.引物组和探针组，其特征在于，所述引物组由引物组1至引物组7组成；
引物组1：用于扩增2019-nCoV-ORF1ab的引物组具有：
如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
引物组2：用于扩增2019-nCoV-N的引物组具有：
如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；和
引物组3：用于扩增IFA的引物组具有：
如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；和
引物组4：用于扩增IFB的引物组具有：
如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；和
引物组5：用于扩增RSV的引物组具有：
如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；和
引物组6：用于扩增MP的引物组具有：
如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；和
引物组7：用于扩增CP的引物组具有：
如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
所述引物组还包括标签序列和第一显色标记物；所述第一显色标记物包括：生物素；
所述引物组1的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；和
所述引物组2的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；和
所述引物组3的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列和
所述引物组4的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；和
所述引物组5的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；和
所述引物组6的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；和
所述引物组7的所述标签序列具有：
如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；所述标签序列连接于所述引物组的正向引物5’端，所述第一显色标记物连接于所述引物组的反向引物5’端；
所述正向引物的5’端与所述标签序列的连接处加入间臂；
所述探针组由探针组1至探针组7组成；
探针组1：用于扩增2019-nCoV-ORF1ab的探针具有：
如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列；和
探针组2：用于扩增2019-nCoV-N探针具有：
如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；和
探针组3：用于扩增IFA的探针具有：
如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列；和
探针组4：用于扩增IFB的探针具有：
如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；和
探针组5：用于扩增RSV的探针具有：
如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列；和
探针组6：用于扩增MP的探针具有：
如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；和
探针组7：用于扩增CP的探针具有：
如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列；
所述探针组1的序列与所述引物组1的所述标签序列互补；
所述探针组2的序列与所述引物组2的所述标签序列互补；
所述探针组3的序列与所述引物组3的所述标签序列互补；
所述探针组4的序列与所述引物组4的所述标签序列互补；
所述探针组5的序列与所述引物组5的所述标签序列互补；
所述探针组6的序列与所述引物组6的所述标签序列互补；
所述探针组7的序列与所述引物组7的所述标签序列互补。
2.如权利要求1所述的引物组和探针组在制备检测呼吸道疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。
3.检测产品，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和探针组以及可接受的助剂。
4.如权利要求3所述的检测产品，其特征在于，还包括：微流控芯片。
5.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，所述微流控芯片包括：主芯片、扩增芯片和层析膜条；所述层析膜条包括：硝酸纤维膜和显色微球。
6.如权利要求5所述的检测产品，其特征在于，所述硝酸纤维膜至少附着如权利要求1所述的引物组和探针组中的所述探针组中的任意一种或多种。
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