CN115155677B - 一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，包括：手动或自动控制的进样部件，以及用于对样本核酸进行纯化扩增的微流控芯片。本发明还公开了其检测方法。本发明的微流控系统能同时检测多种病原体，具有操作简单、检测快速、检测成本低，封闭系统避免污染等特点。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统及其检测方法。
背景技术
呼吸道感染一直是危害人类健康的疾病，其中，急性呼吸道感染的发病率居急性传染病的首位。根据世界卫生组织(WTO)估计，每年有190万儿童死于急性呼吸道感染；根据致死率，呼吸道感染是人类第六大死亡原因。21世纪以来，人类社会多次爆发在全球范围内传播的呼吸道疾病。引起呼吸道感染的病原体有许多，并且急性呼吸道感染通常是病毒和细菌混合感染或者继发感染。尽管引起呼吸道感染的病毒种类多样，但是感染这些病原体的症状却非常相似，比如：发热、咳嗽、头肺炎等。因此，想要根据临床症状来确定病原体种类是非常困难的。快速鉴定病原体种类能够进行针对性治疗，降低致死率、降低治疗费用。
目前常用的呼吸道病原体检测方法包括培养法、血清检测法、分子生物学检测法等。培养法操作繁琐，培养周期长，灵敏度低，易出现假阴性结果。血清检测周期短，但特异性和灵敏度低，易出现假阴性和假阳性结果。目前，用于病原体快速检测的分子生物学方法有荧光PCR法。但是，荧光PCR法通常只能检测一种病原体，不适用于病原体的快速筛查。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统。能同时检测多种病原体，具有操作简单、检测快速、检测成本低，封闭系统避免污染等特点。
一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，包括：
手动或自动控制的进样部件，所述进样部件包括若干独立的注射单元，所述注射单元包括液体石蜡注射单元、磁珠注射单元、乙醇注射单元、洗脱液注射单元、样本注射单元和缓冲液注射单元；
用于对样本核酸进行纯化扩增的微流控芯片，所述微流控芯片包括:
盖板层和设置在所述盖板层下部的基板层；
在所述盖板层上设置有若干进样孔和若干用于平衡气压的气道和若干通气孔；
所述基板层上设置有第一核酸纯化腔室和、或第二核酸纯化腔室；
所述第一核酸纯化腔室与所述第二核酸纯化腔室之间设置有多重扩增腔室；
所述多重扩增腔室内包被固定有多重扩增引物；
所述第一核酸纯化腔室包括依次相连的第一磁珠核酸吸附室，第一、第二乙醇洗涤室以及第一核酸洗脱室；
所述第二核酸纯化腔室包括依次相连的第二磁珠核酸吸附室，第三、第四乙醇洗涤室以及第二核酸洗脱室；
所述第二核酸洗脱室与缓冲液储藏腔室相连；
所述缓冲液储藏腔室的出口处连接有环形主流道，所述环形主流道通过若干子流道与巣式扩增腔室的单个扩增子腔室连接；
所述单个扩增子腔室内设置有对应的包被固定的引物序列或探针。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一核酸纯化腔室包括不规则形状的第一磁珠核酸吸附室，所述第一磁珠核酸吸附室的出口通过第一锥形结构的石蜡阀室与第一乙醇洗涤室相连；
所述第一乙醇洗涤室的出口通过第二锥形结构的石蜡阀室与第二乙醇洗涤室相连；
所述第二乙醇洗涤室的出口通过第三锥形结构的石蜡阀室与第一核酸洗脱室相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一磁珠核酸吸附室的出口向内收缩形成第一出口导流通道与第一锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一乙醇洗涤室的出口向内收缩形成第二出口导流通道与第二锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二乙醇洗涤室的出口向内收缩形成第三出口导流通道与第三锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一核酸洗脱室的出口通过第一毛细管阀与所述多重扩增腔室相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述多重扩增腔室的出口通过第二毛细管阀与第二核酸纯化腔室相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二核酸纯化腔室包括不规则形状的第二磁珠核酸吸附室，所述第二磁珠核酸吸附室的出口通过第四锥形结构的石蜡阀室与第三乙醇洗涤室相连；
所述第三乙醇洗涤室的出口通过第五锥形结构的石蜡阀室与第四乙醇洗涤室相连；
所述第四乙醇洗涤室的出口通过第六锥形结构的石蜡阀室与第二核酸洗脱室相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二磁珠核酸吸附室的出口向内收缩形成第四出口导流通道与第四锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第三乙醇洗涤室的出口向内收缩形成第五出口导流通道与第五锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第四乙醇洗涤室的出口向内收缩形成第六出口导流通道与第六锥形结构的石蜡阀室的膨大端相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二核酸洗脱室的出口通过第三毛细管阀与所述缓冲液储藏腔室相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述缓冲液储藏腔室的出口通过第四毛细管阀与所述环形主流道相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述环形主流道的进口处设置有缓冲流道，所述缓冲流道与所述第四毛细管阀的出口相连。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一核酸纯化腔室或第二核酸纯化腔室的不同子腔室之间均为曲形结构排布。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一核酸纯化腔室的深度大于其他腔室的深度。
在本发明的一个优选实施例中，所述基板层直径200mm±0.5mm，厚度5mm±0.1mm，为不透明材质，优选黑色不透明PMMA材质。
在本发明的一个优选实施例中，所述盖板层直径200mm±0.5mm，厚度2mm±0.1mm，为透明材质，优选PMMA、PDMS透明材质。
在本发明的一个优选实施例中，所述巣式扩增腔室的单个扩增子腔室数量为需检测病原体核酸数量的三倍与至少一空白对照扩增腔室和至少一提取对照扩增腔室之和。
一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统的检测方法，包括如下步骤：
第一步，对待检测样本进行处理获得待检测样本模板，并通过样本注射单元进行提取；
第二步，刺破部分加样孔，通过液体石蜡注射单元向各石蜡阀室中注射液体石蜡
第三步，刺破部分加样孔，通过磁珠注射单元向第一磁珠核酸吸附室和第二磁珠核酸吸附室分别注射磁珠；
第四步，刺破部分加样孔，通过乙醇注射单元向第一、第二乙醇洗涤室和第三、第四乙醇洗涤室分别注射乙醇；
第五步，刺破部分加样孔，通过洗脱液注射单元向第一核酸洗脱室和第二核酸洗脱室分别注射洗脱液；
第六步，刺破部分加样孔，通过缓冲液注射单元向缓冲液储藏腔室注射缓冲液或激活剂；
第七步，对所有加样孔进行密封后，将微流控芯片放入配套核酸扩增检测仪进行核酸纯化、扩增；
扩增完毕后，由核酸扩增检测仪自带软件进行数据分析并判断阴阳性。
本发明的有益效果在于：
本发明的微流控系统能同时检测多种病原体，具有操作简单、检测快速、检测成本低，封闭系统避免污染等特点。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片结构示意图(盖板层)。
图2为本发明的微流控芯片结构示意图(基板层)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下结构中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要的混淆本发明的概念。
本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述。而不是指示或暗示所指的装置或原件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，属于“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
本发明的微控流系统包括两大部分，第一部分是手动或自动控制的进样部件，进样部件包括若干独立的注射单元，所述注射单元包括液体石蜡注射单元、磁珠注射单元、乙醇注射单元、洗脱液注射单元、样本注射单元。
具体的注射单元可以是注射器或者其他移液工具。
第二部分是如图1-2所示的微流控芯片，包括了盖板层1和设置盖板层1下部的基板层2。
重点结合图1，盖板层1上设置有第一通气孔和气道111，第一通气孔和气道111主要是为了增加下附基板层2的通气性能。
盖板层1上设置有若干加样孔120，加样孔120的位置对应于基板层2上对应的加注试剂的反应腔室的位置。
盖板层1上设置有若干安装定位孔130，安装定位孔130与基板层的安装定位件201进行定位。
盖板层1周设有环形气道140，环形气道140与第二通气孔141相连。
重点结合图2，基板层2上设置有用于一次核酸纯化的第一核酸纯化腔室210和用于二次核酸纯化的第二核酸纯化腔室220。
也可以根据需要只设置至少一个核酸纯化腔室210。
在第一核酸纯化腔室210与第二核酸纯化腔室220之间设置有多重扩增腔室230。第一核酸纯化腔室210或第二核酸纯化腔室220的不同子腔室之间均为曲形结构排布,这样的排布方式更便于后续的离心操作。
进一步地，第一核酸纯化腔室210包括不规则形状的第一磁珠核酸吸附室211，第一磁珠核酸吸附室211的出口通过第一锥形结构的石蜡阀室212与第一乙醇洗涤室213相连。
更进一步地，第一磁珠核酸吸附室211的出口向内收缩形成第一出口导流通道与第一锥形结构的石蜡阀室212的膨大端相连。
第一乙醇洗涤室213的出口通过第二锥形结构的石蜡阀室214与第二乙醇洗涤室215相连。
更进一步地，第一乙醇洗涤室213的出口向内收缩形成第二出口导流通道与第二锥形结构的石蜡阀室214的膨大端相连。
第二乙醇洗涤室215的出口通过第三锥形结构的石蜡阀室216与第一核酸洗脱室217相连。
更进一步地，第二乙醇洗涤室215的出口向内收缩形成第三出口导流通道与第三锥形结构的石蜡阀室216的膨大端相连。
第一核酸洗脱室217的出口通过第一毛细管阀251与多重扩增腔室230相连，而多重扩增腔室230的出口通过第二毛细管阀252与第二核酸纯化腔室220相连。多重扩增腔室230内设置有包被固定的多重扩增引物(图中未示出)。来源为将多重扩增引物探针冻干粉末包被固定。具体的扩增引物根据检测对象进行设计。
进一步地，第二核酸纯化腔室220进一步包括不规则形状的第二磁珠核酸吸附室221，第二磁珠核酸吸附室221的出口通过第四锥形结构的石蜡阀室222与第三乙醇洗涤室223相连。
更进一步地，第二磁珠核酸吸附室221的出口向内收缩形成第四出口导流通道与第四锥形结构的石蜡阀室222的膨大端相连。
第三乙醇洗涤室223的出口通过第五锥形结构的石蜡阀室224与第四乙醇洗涤室225相连。
更进一步地，第三乙醇洗涤室223的出口向内收缩形成第五出口导流通道与第五锥形结构的石蜡阀室224的膨大端相连。
第四乙醇洗涤室225的出口通过第六锥形结构的石蜡阀室226与第二核酸洗脱室227相连。
第四乙醇洗涤室225的出口向内收缩形成第六出口导流通道与第六锥形结构的石蜡阀室226的膨大端相连。
第二核酸洗脱室227的出口通过第三毛细管阀253与缓冲液储藏腔室240相连。
缓冲液储藏腔室240的出口处连接有环形主流道260，环形主流道260通过若干子流道261与巣式扩增腔室270的单个扩增子腔室271连接。
进一步地，缓冲液储藏腔室240的出口通过第四毛细管阀254与环形主流道260相连。
环形主流道260的进口处设置有缓冲流道260a，缓冲流道260a与第四毛细管阀254的出口相连。
单个扩增子腔室271内设置有对应的包被固定的引物序列或探针(图中未示出)。
巣式扩增腔室270的单个扩增子腔室271数量为需检测病原体核酸数量的三倍与至少一空白对照扩增腔室和至少一提取对照扩增腔室之和。
比如，包括均匀分布152巢氏扩增反应室，用于同时检测50中病原体核酸，每3个反应室检测同一种病原体作为对照，还有两个反应室用作空白对照和提取对照，每个反应室内包被固定有能扩增特异靶基因序列的引物和探针。来源为配置各病原体、扩增对照和提取对照的引物探针混合物，冻干备用。
巣式扩增腔室270的单个扩增子腔室271周设在环形气道140下方。
第一核酸纯化腔室210的深度大于其他腔室的深度。
另外，基板层1直径200mm±0.5mm，厚度5mm±0.1mm，为不透明材质，优选黑色不透明PMMA材质。
盖板层2直径200mm±0.5mm，厚度2mm±0.1mm，为透明材质，优选PMMA、PDMS透明材质。
基于上述微流控系统，所设计的检测方法为：
第一步，对待检测样本进行处理获得待检测样本模板，并通过样本注射单元进行提取；
第二步，刺破部分加样孔，通过液体石蜡注射单元向各石蜡阀室中注射液体石蜡
第三步，刺破部分加样孔，通过磁珠注射单元向第一磁珠核酸吸附室和第二磁珠核酸吸附室分别注射磁珠；
第四步，刺破部分加样孔，通过乙醇注射单元向第一、第二乙醇洗涤室和第三、第四乙醇洗涤室分别注射乙醇；
第五步，刺破部分加样孔，通过洗脱液注射单元向第一核酸洗脱室和第二核酸洗脱室分别注射洗脱液；
第六步，刺破部分加样孔，通过缓冲液注射单元向缓冲液储藏腔室注射缓冲液或激活剂；
第七步，对所有加样孔进行密封后，将微流控芯片放入配套核酸扩增检测仪进行核酸纯化、扩增；
扩增完毕后，由核酸扩增检测仪自带软件进行数据分析并判断阴阳性。
本发明更进一步的检测方法为：
第一步，微流控芯片制备：
取盖板和基片，在75％乙醇中超声清洗5分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，最后取出并在真空干燥箱中烘干备用；
揭下光学双面胶一面的分离膜，贴在盖板上，在真空热压键合机内，在1Kpa真空，40Kg压力下键合20分钟，使光学双面胶与盖板紧密贴合，没有气泡；
用镊子将引物探针冻干粉末放入到病原体对应的巢氏扩增反应室内；
揭下光学双面胶另一面的分离膜，使用定位销将盖板和基片对准后，在真空热压键合机内，在1Kpa真空，40Kg压力下键合20分钟，盖板和基片紧密贴合，没有气泡，形成微流控芯片。
第二步，芯片上样：
用5mL注射器针头刺破所有加样孔；
用5mL注射器吸取液体石蜡，排除注射器内空气，经过石蜡阀加样孔将液体石蜡注入石蜡阀腔室，待石蜡阀腔室充满后，继续注射下一个石蜡阀腔室，直至所有石蜡阀腔室均注满石蜡；
用200μL移液枪吸取磁珠，经过磁珠加样孔将磁珠注入磁珠吸附室；
用5mL注射器吸取80％乙醇，排除注射器内空气，经过乙醇加样孔将乙醇注入核酸洗涤室，待核酸洗涤充满后，继续注射下一个核酸洗涤室，直至所有核酸洗涤室均注满乙醇；
用50μL移液枪吸取洗脱液，经过洗脱液加样孔将洗脱液注入核酸洗脱室；
用500μL移液枪吸取Buffer，经过Buffer加样孔将Buffer注入Buffer储存室；
用30μL移液枪吸取激活剂，经过Buffer加样孔将激活剂注入Buffer储存室；
使用密封膜封闭所有加样孔。
第三步，核酸扩增：
将微流控芯片放入配套的核检测仪，进行扩增检测。
第四步，结果分析：
扩增完毕，由核酸检测仪自带软件进行结果分析，反应室的荧光值大于系统预设的检测限判定为阳性，小于检测限为阴性。
因为具备上述结构，本发明的工作原理在于：
首先通过加样孔120对各腔室进行加样，经过第一核酸纯化腔室210进行一次核酸纯化后在多重扩增腔室230内完成多重扩增，后进入第二核酸纯化腔室220进行二次纯化。
对芯片整体进行离心旋转(旋转方向为图二箭头方向)后将二次纯化后的洗脱液排入缓冲液储藏腔室240后流入巣式扩增腔室270的单个扩增子腔室271中进行扩增和后续处理。
与现有技术相比，本发明可一次进行几十种扩增检测，且系统占地面积小更利于实验室管理。
Claims (8)
1.一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，包括：
手动或自动控制的进样部件，所述进样部件包括若干独立的注射单元，所述注射单元包括液体石蜡注射单元、磁珠注射单元、乙醇注射单元、洗脱液注射单元、样本注射单元和缓冲液注射单元；
用于对样本核酸进行纯化扩增的微流控芯片，所述微流控芯片包括:
盖板层和设置在所述盖板层下部的基板层；
在所述盖板层上设置有若干进样孔和若干用于平衡气压的气道和若干通气孔；
所述基板层上设置有第一核酸纯化腔室和第二核酸纯化腔室；
所述第一核酸纯化腔室与所述第二核酸纯化腔室之间设置有多重扩增腔室；
所述多重扩增腔室内包被固定有多重扩增引物；
所述第一核酸纯化腔室包括依次相连的第一磁珠核酸吸附室，第一、第二乙醇洗涤室以及第一核酸洗脱室；
所述第二核酸纯化腔室包括依次相连的第二磁珠核酸吸附室，第三、第四乙醇洗涤室以及第二核酸洗脱室；
所述第二核酸洗脱室与缓冲液储藏腔室相连；
所述缓冲液储藏腔室的出口处连接有环形主流道，所述环形主流道通过若干子流道与巣式扩增腔室的单个扩增子腔室连接；
所述单个扩增子腔室内设置有对应的包被固定的引物序列或探针。
2.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述第一核酸纯化腔室包括不规则形状的第一磁珠核酸吸附室，所述第一磁珠核酸吸附室的出口通过第一锥形结构的石蜡阀室与第一乙醇洗涤室相连；
所述第一乙醇洗涤室的出口通过第二锥形结构的石蜡阀室与第二乙醇洗涤室相连；
所述第二乙醇洗涤室的出口通过第三锥形结构的石蜡阀室与第一核酸洗脱室相连。
3.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，
所述第一核酸洗脱室的出口通过第一毛细管阀与所述多重扩增腔室相连；
所述多重扩增腔室的出口通过第二毛细管阀与第二核酸纯化腔室相连。
4.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述第二核酸纯化腔室包括不规则形状的第二磁珠核酸吸附室，所述第二磁珠核酸吸附室的出口通过第四锥形结构的石蜡阀室与第三乙醇洗涤室相连；
所述第三乙醇洗涤室的出口通过第五锥形结构的石蜡阀室与第四乙醇洗涤室相连；
所述第四乙醇洗涤室的出口通过第六锥形结构的石蜡阀室与第二核酸洗脱室相连。
5.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述第二核酸洗脱室的出口通过第三毛细管阀与所述缓冲液储藏腔室相连；
所述缓冲液储藏腔室的出口通过第四毛细管阀与所述环形主流道相连；
所述环形主流道的进口处设置有缓冲流道，所述缓冲流道与所述第四毛细管阀的出口相连。
6.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述第一核酸纯化腔室和第二核酸纯化腔室的不同子腔室之间均为曲形结构排布；
所述第一核酸纯化腔室的深度大于其他腔室的深度。
7.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述基板层直径200mm±0.5mm，厚度5mm±0.1mm，为不透明材质；
所述盖板层直径200mm±0.5mm，厚度2mm±0.1mm，为透明材质。
8.如权利要求1所述的一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的微流控系统，其特征在于，所述巣式扩增腔室的单个扩增子腔室数量为需检测病原体核酸数量的三倍与至少一空白对照扩增腔室和至少一提取对照扩增腔室之和。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109536366A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-03-29 | 合肥中科易康达生物医学有限公司 | 一种基于改性毛细管的核酸检测微流控芯片及核酸检测系统 |
| CN110218819A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测猪呼吸道疫病病原的高通量微流控芯片及检测方法 |
| CN110616143A (zh) * | 2018-06-28 | 2019-12-27 | 北京中科生仪科技有限公司 | 一种用于核酸快速检测的微流控芯片及其使用方法 |
| CN110885749A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-03-17 | 西人马联合测控（泉州）科技有限公司 | 病毒检测系统及其微流控芯片 |
| CN111910021A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-10 | 北京百康芯生物科技有限公司 | 一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 |
| CN112538537A (zh) * | 2020-06-20 | 2021-03-23 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控lamp芯片及检测方法 |
| CN113528625A (zh) * | 2020-04-17 | 2021-10-22 | 国家纳米科学中心 | 一种微流控核酸检测方法及应用 |
| CN113522380A (zh) * | 2020-04-17 | 2021-10-22 | 国家纳米科学中心 | 用于核酸检测的碟式微流控芯片及应用 |
| CN114471751A (zh) * | 2020-10-27 | 2022-05-13 | 京东方科技集团股份有限公司 | 检测芯片及其操作方法、检测装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10962527B2 (en) * | 2016-02-05 | 2021-03-30 | The Broad Institute, Inc. | Multi-stage, multiplexed target isolation and processing from heterogeneous populations |
-
2022
- 2022-05-23 CN CN202210567346.4A patent/CN115155677B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110616143A (zh) * | 2018-06-28 | 2019-12-27 | 北京中科生仪科技有限公司 | 一种用于核酸快速检测的微流控芯片及其使用方法 |
| CN109536366A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-03-29 | 合肥中科易康达生物医学有限公司 | 一种基于改性毛细管的核酸检测微流控芯片及核酸检测系统 |
| CN110218819A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测猪呼吸道疫病病原的高通量微流控芯片及检测方法 |
| CN110885749A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-03-17 | 西人马联合测控（泉州）科技有限公司 | 病毒检测系统及其微流控芯片 |
| CN113528625A (zh) * | 2020-04-17 | 2021-10-22 | 国家纳米科学中心 | 一种微流控核酸检测方法及应用 |
| CN113522380A (zh) * | 2020-04-17 | 2021-10-22 | 国家纳米科学中心 | 用于核酸检测的碟式微流控芯片及应用 |
| CN112538537A (zh) * | 2020-06-20 | 2021-03-23 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控lamp芯片及检测方法 |
| CN111910021A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-10 | 北京百康芯生物科技有限公司 | 一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 |
| CN114471751A (zh) * | 2020-10-27 | 2022-05-13 | 京东方科技集团股份有限公司 | 检测芯片及其操作方法、检测装置 |
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