CN111206030A - 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法 - Google Patents

一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，包括以下几个步骤：步骤一，在生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；步骤二，加入结合缓冲液和Carrier RNA，上下颠倒充分混匀；步骤三，将混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；步骤四，用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集洗脱液即获得所需核酸。本方法将玻纤滤纸引入核酸抽提方法中，可以用于生物样本中核酸的富集和提取。该方法简化了核酸抽提的步骤和所需仪器设备，节省了操作时间，降低了提取成本，同时保证了高效的核酸回收率。

Description

一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法
技术领域
本发明属于用于医学检测的样本核酸提取技术领域，具体涉及一种从生物样本中快速提取核酸的方法，更具体涉及一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法。
背景技术
血浆、血清和组织液等体液可被用于多种血源性传染病的主要检测分析样本。常见的血源性传染病有疟疾、慢性乙型病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合征等，这些疾病由寄生于人体血液和淋巴中的病原体所引起，主要透过血液、伤口的接触与交换将疾病传递至另一个体身上。因此通过提取并检测血液中病原体核酸含量，可帮助判定是否感染疾病、感染进程及预后状态等情况。
玻璃纤维滤纸呈化学惰性，不含粘合剂，采用100％硼硅酸玻璃纤维制造而成。具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，具有流速快，耐高温，纳污能力强的特点，并可以过滤细小的颗粒。作为玻璃钢制品的重要组成部分，玻璃纤维的应用非常广泛，其中滤纸的应用与日常生活非常紧密。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。
传统的核酸提取方法主要有：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法和EtBr-CsCl梯度离心法。这些传统提取方法可从不同组织样本中分离出核酸，但这些技术中包含沉淀和离心等操作步骤，其所需的生物样本量较大，且提取的步骤较为繁杂、费时费力，得率也不高。以固相吸附物载体为基础的新型核酸提取方法如旋转离心柱提取法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法和玻璃粉吸附法等。其中离心柱提取法和纳米磁珠提取法得到了广泛运用，但不足的是离心柱法提取核酸需要反复离心，且需要离心机这样的仪器设备满足需求，而纳米磁珠提取法需要则外加磁场，且所需样本通常在200uL及以上，体积相对较大，且富集和洗脱过程较为繁琐。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，能够实现现场快速提取和纯化核酸，操作方便。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
为实现上述目的，本发明提出了一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液，蛋白酶K帮助裂解病毒以释放核酸；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入结合缓冲液和Carrier RNA，结合缓冲液帮助核酸吸附在玻纤膜上，核糖核酸载体帮助富集核酸；
步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去，此时所需核酸吸附在玻纤滤纸上；
步骤四，用洗涤缓冲液清洗1～2次，用吸水纸吸去废液，目的是去除可能严重影响下游应用的任何残留污染物；
步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液。
作为优选，所述步骤一中，蛋白酶K浓度为20-200ug/mL。
作为优选，所述步骤二中，Carrier RNA浓度为1-8ug/mL，更优选的，所述CarrierRNA浓度为3-6ug/mL。
作为优选，所述步骤二中，结合缓冲液主要包括1-8M盐酸胍、10-200mM Tris-HCl、10-100mM EDTA、100-800mM NaCl、0.5％-2％SDS；
更优选的，所述结合缓冲液主要包括2-8M盐酸胍、50-100mM Tris-HCl、10-80mMEDTA、100-800mM NaCl、0.5％-1％SDS。
更优选的，所述结合缓冲液中Tris-HCl的pH值为6.0-8.0。
作为优选，所述步骤四中，洗涤缓冲液主要包括1-10mM EDTA、10-100mM Tris-HCl、10-100mM NaCl和55％-75％乙醇。
作为优选，所述步骤四中，洗脱缓冲液主要包括10-100mM Tris-HCl、1-10mMEDTA。
更优选的，所述洗脱缓冲液由10mM Tris-HCl、1mMEDTA组成。
作为优选，所述玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维。
作为优选，所述步骤三中，玻纤滤纸为圆形，直径为6-10mm，用PET单面透明胶带固定在双圈滤纸的亲水区域中。
更优选的，所述玻纤滤纸的直径为6-8mm。
作为优选，所述步骤三中，双圈滤纸包含喷蜡疏水区和亲水区，亲水区域为圆形，直径为8-12mm。
作为优选，所述生物样本包括血清、血浆和组织液。
有益效果
本发明提供的一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
本方法引入玻纤滤纸直接吸附纯化核酸，该提取方法提取操作快速方便，不需要笨重的仪器设备，所需样本量小，可用于提取血清、血浆和组织液的核酸，使得核酸提取方法适用于现场检测。
附图说明
图1是本发明实施例1一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图；
图2是本发明实施例2一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图；
图3是本发明实施例3一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与将玻纤滤纸分别替换为双圈滤纸、fusion 5的核酸提取方法对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1
一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，取两份含乙型肝炎病毒(HBV病毒)的血清50uL分别放置于1.5mL离心管作为实验组1(并标记为HBV11、HBV16)中作为待提取核酸的生物样本，加入5uL蛋白酶K后快速混匀，得混合溶液；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入80uL结合缓冲液和0.7uL Carrier RNA，混匀后室温孵育10分钟；
步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去；
步骤四，在上述玻纤滤纸上缓慢滴加125uL洗涤缓冲液，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去，在通风处晾干不超过10分钟；
步骤五，在上述玻纤滤纸上滴加30uL洗脱缓冲液，将过滤的溶液收集在1.5mL离心管中，即获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存；其中，蛋白酶K浓度为80ug/mL，Carrier RNA浓度为6ug/mL；结合缓冲液由6M盐酸胍、50mM Tris-HCl、20mMEDTA、500mM NaCl和0.5％SDS组成，洗涤缓冲液由10mM EDTA、50mM Tris-HCl(pH 6.5)、100mM NaCl和75％乙醇组成，洗脱缓冲液由10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA组成，玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维且直径为6mm。
设置与上述实验组数量相同的对照组1，采用全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒，取样体积为200uL，洗脱体积为120uL，并完成对照组核酸的提取。
对对照组1和采用本发明提取方法提取的核酸量采用Nanodrop 2000进行总核酸量测定，检测结果如下表一：
表一总核酸量测定结果
对照组1 发明实验组1
样品编号 核酸浓度(ng/uL) A260/A280 核酸浓度(ng/uL) A260/A280
HBV11 3.5 1.32 53.9 1.62
HBV16 4.6 1.65 50.2 1.21
选取上述实验组和对照组中的核酸1uL做模板采用聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见图1，扩增目的片段长度为1203bp。
表二HBV荧光定量聚合酶链式反应检测结果
样品编号 实验组1Ct值 对照组1Ct值
HBV11 23.98 26.40
HBV16 21.40 25.03
选取上述实验组和对照组中的核酸1uL做模板采用HBV荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表二。
实施例2
一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，取两份含乙型肝炎病毒(HBV病毒)的血清50uL分别放置于1.5mL离心管作为实验组2(并标记为HBV1、HBV5)中作为待提取核酸的生物样本，加入5uL蛋白酶K后快速混匀，得混合溶液；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入80uL结合缓冲液和0.7uL Carrier RNA，混匀后室温孵育10分钟；
步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去；
步骤四，在步骤三的玻纤滤纸上缓慢滴加125uL洗涤缓冲液，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去，在通风处晾干不超过10分钟；
步骤五，在步骤四的玻纤滤纸上滴加30uL洗脱缓冲液，将过滤的溶液收集在1.5mL离心管中，即获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存。
其中，蛋白酶K浓度为100ug/mL，Carrier RNA浓度为6ug/mL，结合缓冲液由8M盐酸胍、100mM Tris-HCl、80mM EDTA、800mM NaCl和1％SDS组成，洗涤缓冲液由10mM EDTA、100mM Tris-HCl(pH 6.5)、100mM NaCl和75％乙醇组成，洗脱缓冲液由10mM Tris-HCl(pH8.5)和1mM EDTA组成，玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维且直径为8mm。
设置与上述实验组数量相同的对照组2，采用全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒，取样体积为200uL，洗脱体积为120uL，并完成对照组核酸的提取。
对对照组2和采用本发明提取方法提取的核酸量采用Nanodrop 2000进行总核酸量测定，检测结果如下表三：
表三总核酸量测定结果
对照组2 发明实验组2
样品编号 核酸浓度(ng/uL) A260/A280 核酸浓度(ng/uL) A260/A280
HBV1 3.1 1.81 60.7 1.60
HBV5 8.9 1.79 157.5 1.32
选取上述实验组和对照组中的核酸1uL做模板采用聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见图2，扩增目的片段长度为1203bp。
选取上述实验组和对照组中的核酸1uL做模板采用HBV荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表四。
表四HBV荧光定量聚合酶链式反应检测结果
样品编号 实验组2Ct值 对照组2Ct值
HBV1 20.92 24.93
HBV5 20.71 23.94
实施1和实施2结合表一、表二、表三、表四和图1、图2可知，采用本发明核酸提取方法比对照试剂提取核酸总量高，实际目标核酸量高，本发明优点在于不需要外加仪器设备，核酸提取应用的效果更优，提取时间缩短。
实施例3
一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，取一份含乙型肝炎病毒(HBV病毒)的血清150uL均匀分为三份放置于1.5mL离心管(并分别标记为LZ、BX、F5)中作为待提取核酸的生物样本，加入5uL蛋白酶K后快速混匀，得混合溶液；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入80uL结合缓冲液和0.7uL Carrier RNA，混匀后室温孵育10分钟；
步骤三，将步骤二所得混合液标记为LZ的滴加在双圈滤纸上，标记为BX的滴加在玻纤滤纸上，标记为F5的滴加在Fusion 5滤膜上，在三种滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去；
步骤四，在步骤三的双圈滤纸、玻纤滤纸和Fusion 5滤膜上缓慢滴加125uL洗涤缓冲液，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去，在通风处晾干不超过10分钟；
步骤五，在步骤四的双圈滤纸、玻纤滤纸和Fusion 5滤膜上滴加30uL洗脱缓冲液，将过滤的溶液收集在1.5mL离心管中，即获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存。
其中，蛋白酶K浓度为20ug/mL，Carrier RNA浓度为3ug/mL，结合缓冲液由2M盐酸胍、50mM Tris-HCl、10mM EDTA、100mM NaCl和0.5％SDS组成，洗涤缓冲液由1mM EDTA、10mMTris-HCl(pH 7.0)、100mM NaCl和70％乙醇组成，洗脱缓冲液由10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA组成，玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维且直径为6mm。
对将玻纤滤纸分别替换为双圈滤纸、fusion 5的核酸提取方法和采用本发明提取方法提取的核酸量采用Nanodrop 2000进行总核酸量测定，检测结果如下表五：
表五总核酸量测定结果
样品编号 核酸浓度(ng/uL) A260/A280
F5 4.4 1.93
LZ 6.3 2.88
BX 25.2 2.66
分别选取上述标记为F5、LZ、BX的核酸1uL做模板采用聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见图3，扩增目的片段长度为1203bp。
实施例3结合表五和图3可知，采用玻纤滤纸比采用双圈滤纸、Fusion 5滤膜提取核酸总量高，实际目标核酸量高，核酸提取应用的效果更优。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入结合缓冲液和Carrier RNA；
步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；
步骤四，用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；
步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液。
2.如权利要求1所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤三中，玻纤滤纸为圆形，直径为6-10mm，用PET单面透明胶带固定在双圈滤纸的亲水区域中。
3.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤三中，双圈滤纸包含喷蜡疏水区和亲水区，亲水区域为圆形，直径为8-12 mm。
4.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤一中，蛋白酶K浓度为20-100ug/mL。
5.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤二中，Carrier RNA浓度为1-8ug/mL。
6.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤二中，结合缓冲液主要包括1-8M盐酸胍、10-200mM Tris-HCl、10-100mM EDTA、100-800mM NaCl、0.5%-2% SDS。
7.如权利要求6所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述结合缓冲液中Tris-HCl的pH值为6.0-7.0。
8.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤四中，洗涤缓冲液主要包括1-10mM EDTA、10-100mM Tris-HCl、10-100mM NaCl和55％-75％乙醇。
9.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤四中，洗脱缓冲液主要包括10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA；优选的，所述Tris-HCl 的pH值为7.0-8.5。
10.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤一中，生物样本包括血清、血浆和组织液。
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