WO2021100801A1 - 核酸の分離方法、検出方法、核酸精製カラム及びその製造方法 - Google Patents

核酸の分離方法、検出方法、核酸精製カラム及びその製造方法 Download PDF

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WO2021100801A1
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WO
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nucleic acid
phase carrier
binding solid
solid
chaotropic agent
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PCT/JP2020/043168
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洋二 上田
笑美 下川
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東レ株式会社
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating nucleic acid from a sample containing nucleic acid, a method for detecting the separated nucleic acid, a nucleic acid purification column for separating nucleic acid, and a method for producing the nucleic acid purification column.
  • RNA and nucleic acids such as RNA from samples such as biological samples
  • impurities other than the target nucleic acid should be removed from the sample, and the nucleic acid should be separated or isolated.
  • the impurities include proteins, carbohydrates, lipids, polyphenols and the like.
  • nucleic acid-binding solid-phase carrier there are an extraction method using an organic solvent such as an ethanol precipitation method, dialysis of nucleic acid, purification using an ultrafiltration membrane, and a method of separation using a nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • the ethanol precipitation method is a widely used method, and nucleic acids can be separated by a simple operation.
  • nucleic acids can be separated by a simple operation.
  • the recovery rate of nucleic acid is low and the recovery rate varies depending on the operation method.
  • dialysis and purification methods using ultrafiltration membranes are also used, there are restrictions on the molecular weight and applicable samples.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • This method is called the boom method, in which the nucleic acid binds to a solid phase carrier such as silica in the presence of a chaotropic agent such as guanidinium salt or urea, and the nucleic acid bound to the solid phase carrier elutes with water. It is a method for purifying nucleic acid utilizing its properties.
  • a solution containing nucleic acid is brought into contact with a solid support carrier such as silica in the presence of a chaotropic agent, so that the nucleic acid in the sample is adsorbed on the solid support carrier, and then the nucleic acid is adsorbed on the solid support carrier.
  • a solid support carrier such as silica
  • Excess components such as salts are washed and removed by passing a washing solution through the carrier, and then the nucleic acid is eluted with water or the like.
  • Non-Patent Document 2 reports that when RNA obtained by purifying a human sample using a commercially available nucleic acid purification column was analyzed, nucleic acid not derived from the human sample was detected. The authors of Non-Patent Document 2 have clarified that the nucleic acid was contaminated in the nucleic acid purification column product, and tried to remove the nucleic acid, but reported that it remains only by washing with water.
  • the nucleic acid purification column used for purification of the nucleic acid is contaminated with an impurity nucleic acid
  • the measurement data of the target nucleic acid will vary widely.
  • challenges In particular, when applying the nucleic acid amplification technique as described above or using a high-sensitivity nucleic acid microarray, it is extremely important to reduce the variability of data between experiments in order to perform highly reliable nucleic acid analysis.
  • the nucleic acid mixed in the nucleic acid purification column is removed to cause variation in measurement data. The purpose is to provide a method of reduction.
  • nucleic acid purification column having a nucleic acid-binding solid phase carrier.
  • the nucleic acid mixed in the nucleic acid purification column can be removed, and the measurement variation when measuring the target nucleic acid after separation can be reduced. I found what I could do.
  • the present invention provides the following. 1.
  • the following steps (1) and (2) From (1) a step of contacting a sample containing the target nucleic acid with a nucleic acid-binding solid-phase carrier capable of adsorbing the nucleic acid, and (2) from the nucleic acid-binding solid-phase carrier to which the nucleic acid was adsorbed in the step (1).
  • Step of eluting the nucleic acid A method of separating the nucleic acid from a sample containing nucleic acid, which comprises.
  • a method comprising contacting the nucleic acid-binding solid phase carrier with a solution containing a chaotropic agent prior to the step (1). 2.
  • 3. The method according to item 1 or 2, wherein the nucleic acid-binding solid-phase carrier is a silica membrane.
  • the chaotropic agent is any of a guanidinium salt, urea, iodide salt, chlorate, perchlorate, thiocyanate or isothiocyanate. .. 5.
  • a method comprising contacting the nucleic acid-binding solid phase carrier with a solution containing a chaotropic agent prior to the step (1).
  • a nucleic acid purification column having a hollow body provided with an inlet opening and an outlet opening and a nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • a nucleic acid purification column produced by a method including step A in which a solution containing a chaotropic agent is passed through a nucleic acid-binding solid-phase carrier and then the nucleic acid-binding solid-phase carrier is dried.
  • a method for producing a nucleic acid purification column having a hollow body provided with an inlet opening and an outlet opening and a nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • a production method comprising a step A of passing a solution containing a chaotropic agent through a nucleic acid-binding solid-phase carrier and then drying the nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • nucleic acid-binding solid-phase carrier is a silica membrane.
  • chaotropic agent is a guanidinium salt, urea, iodide salt, chlorate, perchlorate, thiocyanate or isothiocyanate.
  • the present invention it is possible to reduce variations in measuring the nucleic acid separated and purified from the sample containing the target nucleic acid.
  • the sample to be used in the nucleic acid purification column of the present invention is not particularly limited as long as it may contain nucleic acid.
  • a sample derived from an animal a sample derived from a plant, a sample derived from a microorganism such as a fungus or a bacterium, or a sample that may contain some nucleic acid can be mentioned.
  • animal-derived samples include body fluid samples such as blood, serum, plasma, urine, stool, cerebrospinal fluid, saliva, swab, and various tissue fluids, various tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded samples (FFPE). It can, but is not limited to these.
  • the target nucleic acid is not particularly limited.
  • the DNA or RNA contained in the above sample can be used, and the nucleic acid may be a nucleic acid obtained by subjecting these nucleic acids to a chemical reaction or an enzymatic reaction in vitro.
  • DNA include chromosomal DNA, viral DNA, DNA such as bacteria and mold, cDNA in which RNA is reverse transcribed, and fragments that are a part thereof.
  • the nucleic acid is DNA, it may be either double-stranded DNA or single-stranded DNA.
  • RNA includes messenger RNA, ribosomal RNA, small RNA, microRNA, and fragments that are a part thereof.
  • chemically synthesized nucleic acids such as DNA or RNA can also be used as the target nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid-binding solid-phase carrier (hereinafter, also simply referred to as “solid-phase carrier” or “carrier”) is not particularly limited as long as it can adsorb nucleic acids.
  • nucleic acid binding property is a substance capable of forming a hydrophobic bond with a nucleic acid in the coexistence of a chaotropic salt.
  • an inorganic material such as silica, glass, alumina, zeolite, or clay mineral, or a polymer material such as polystyrene is preferably used.
  • a silica-based material such as the material described in US Pat. No. 5,234,809, a polymer material containing latex and polystyrene-based materials such as the material described in International Publication No. 96/18731, and the like.
  • Examples of the shape of the solid phase carrier include particles, beads, sheets (membranes, membranes), woven fabrics, fibers and the like.
  • a silica membrane is particularly preferable as the solid phase carrier.
  • the silica membrane is a film-like material made of silica, glass or quartz fibers, or a thin film made of silica gel, and is disclosed in Japanese Patent No. 3329813 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-501321.
  • These solid-phase carriers can be used by being filled in a column and passed through a sample solution or the like, or can be used in a suspended state by being immersed in the sample solution or the like as it is.
  • magnetic particles are also preferably used as the solid phase carrier because the carrier can be easily separated from the suspension and recovered by using a magnetic field.
  • Common materials used in magnetic particles include magnetic metal oxides, especially iron oxide.
  • a useful magnetic oxide optionally replaces all or part of its ferrous iron with a divalent transition metal such as calcium, chromium, cobalt, copper, magnesium, manganese, nickel, vanadium and / or zinc. , Contains iron oxide.
  • Examples of silica-based magnetic particles include the particles described in US Pat. Nos. 6,279,945 and 5,945,525.
  • a nucleic acid purification column is a column packed with a solid-phase carrier, and is used for the purpose of separating nucleic acids in the solution through a sample solution.
  • Nucleic acid purification columns using a silica membrane as a solid phase carrier can be obtained commercially available from a plurality of manufacturers. Typical examples are “miRNeasy serum / plasma kit” (model number 217184), “miRNeasy 96 kit” (model number 217061, *), “miRNeasy Mini Kit” (model number 217004), and “QIAamp DNA mini kit” manufactured by Kiagen. (Model number 51304), “RNeasy micro kit” (model number 74004), “RNeasy UCP micro kit” (model number 73934), “RNeasy MinElute Cleanup Kit” (model number 74204), “Nucleo Spin miRNA Plasma” (model number 74204) manufactured by MACHEREY-NAGEL.
  • the method for separating nucleic acids of the present invention can be applied when separating target nucleic acids using these commercially available nucleic acid purification columns.
  • An asterisk was added after the model number to the kit containing the nucleic acid purification column in the 96-well plate format described later.
  • Nucleic acid purification columns using the above magnetic particles as a solid phase carrier can be obtained commercially available from a plurality of manufacturers. Typical examples are Promega's "Maxwell RSC miRNA from Tissue and Plasma or Serum” (model number AS1680), “Maxwell RSC Whole Blood DNA Kit” (model number AS1520), and Beckman's "RNAdvance Blood Kit” (model number AS1680). Included in nucleic acid purification kits such as “RNAdvance Cell v2 Kit” (model number A47942), “MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit” (model number A27827), “Dynameads mRNA Purification Kit” (model number 61006) manufactured by Thermo Fisher. Nucleic acid purification columns can be mentioned.
  • the step (1) in the method for separating nucleic acid of the present invention is a step of bringing a sample containing a target nucleic acid into contact with a solid phase carrier and adsorbing the nucleic acid in the sample to the solid phase carrier.
  • the solid-phase carrier When the solid-phase carrier is used in a state of being filled in the column, it can be carried out by passing the sample solution through the column and, if necessary, separating and removing the sample solution in the column by centrifugation or suction. Specifically, a solution of a sample containing a target nucleic acid is placed on a column packed with a solid-phase carrier.
  • the solid-phase carrier can be passed by the weight of the sample solution, but if it takes time, the column on which the sample solution is placed can be centrifuged to allow the sample solution to pass through the solid-phase carrier. Centrifugal conditions are appropriately set depending on the shape of the column, but in the case of a commercially available column packed with a solid-phase carrier, the concentration can be 8000 xg to 10000 xg.
  • the solid-phase carrier may not be packed in the column, and the solid-phase carrier may be immersed in the sample solution as it is, and then the solution may be separated and removed by centrifugation, suction, or the like.
  • an arbitrary amount of solid-phase carrier is added to a sample containing nucleic acid and immersed.
  • the solid-phase carrier to which the nucleic acid is bound can be taken out by submerging the solid-phase carrier in the lower layer of the solution by centrifugation and removing the supernatant.
  • the centrifugation condition at this time can be appropriately set from the specific gravity of the solid phase carrier. When the specific gravity of the solid-phase carrier is sufficiently large, the solid-phase carrier is submerged in the lower layer without centrifugation, so that the solid-phase carrier can be taken out by removing the supernatant liquid.
  • the step (2) in the method for separating the nucleic acid of the present invention is a step of eluting the nucleic acid adsorbed on the solid phase carrier in the step (1) from the solid phase carrier.
  • the nucleic acid can be eluted by using water or a solvent having a low polarity such as TE buffer as the eluate.
  • the solid-phase carrier is used in a state of being filled in the column, the eluate containing nucleic acid is eluted by passing the eluate through the column and separating the eluate in the column by centrifugation or suction as necessary.
  • the liquid can be obtained.
  • the eluted nucleic acid is contained by immersing the solid phase carrier in the eluate as it is and then separating and removing the solid phase carrier by centrifugation, suction, or the like. An eluate can be obtained.
  • the solid-phase carrier is subjected to a chaotropic agent before the step (1) of contacting the sample containing the target nucleic acid with the solid-phase carrier and adsorbing the nucleic acid in the sample to the solid-phase carrier. It is characterized by being brought into contact with a solution containing.
  • Chaotropic agents are generally substances that destabilize the structure of nucleic acids in solution by reducing the interaction between water molecules. Nucleic acid has a secondary structure due to hydrogen bonds between bases, but the secondary structure is eliminated by adding a chaotropic agent.
  • chaotropic agent guanidinium salt, urea, iodide salt, chlorate, perchlorate, thiocyanate, isothiocyanate and the like can be used.
  • Preferred chaotropic agents include guanidinium thiocyanate and guanidinium chloride.
  • concentration of the solution containing the chaotropic agent is preferably in the range of 1M to 8M.
  • the solution containing the chaotropic agent can be used as an aqueous solution, but it may be an aqueous solution containing alcohol.
  • the alcohol ethanol generally used in molecular biology experiments is preferable.
  • the concentration of alcohol in the solution containing the chaotropic agent can be used in the range of 10 to 80% by volume.
  • the solid-phase carrier As a method of contacting the solid-phase carrier with the solution containing the chaotropic agent, when the solid-phase carrier is used in a state of being filled in the column, it is necessary to pass (pass) the solution containing the chaotropic agent through the column. Depending on the situation, the solution in the column can be separated by centrifugation or suction.
  • the solid-phase carrier When the solid-phase carrier is used in a state where the column is not filled, the solid-phase carrier is immersed in a solution containing a chaotropic agent as it is, and then the solution is separated and removed by centrifugation, suction, or the like. it can.
  • the amount of the solution containing the chaotropic agent used is about 0.1 mL to 1.5 mL, preferably about 0.6 mL to 1.0 mL, based on 10 mg of the solid phase carrier.
  • the temperature is not particularly limited, and is usually about 4 ° C. to 60 ° C., but it is convenient and preferable to carry out at room temperature.
  • the amount of water or alcohol aqueous solution used at this time is not particularly limited, but is usually about 0.1 mL to 1.5 mL with respect to 10 mg of the solid phase carrier.
  • FIG. 1 shows an outline of an example of a step of contacting a solution containing a chaotropic agent with a solid phase carrier.
  • a solution containing a chaotropic agent is passed through a solid-phase carrier, and the solution is removed by a method such as centrifugation or suction (procedure 1).
  • water is passed through the solid-phase carrier and removed by a method such as centrifugation or suction (procedure 2).
  • an alcohol aqueous solution such as 10 to 80% by volume ethanol may be used.
  • the solid-phase carrier prepared in this way can be used for separating a sample containing nucleic acid.
  • a target nucleic acid obtained by contacting a solid-phase carrier with a solution containing a chaotropic agent as described above and then performing the above steps (1) and (2) is used. It includes a step (3) of detection.
  • Nucleic acid can be detected by labeling with a labeling substance.
  • the labeling substance can be incorporated by using an enzyme such as DNA polymerase or Thermal Deoxidil Transferase.
  • nucleic acid is detected by electrophoresis, it can be labeled by incorporating an intercalator such as ethidium bromide.
  • RNA When the nucleic acid is RNA, a method of binding the labeling substance to the 3'end of RNA, a method of binding the labeling substance to the 5'end, or a method of binding the labeling substance to the nucleoside may be used, or these methods may be used. It may be used in combination.
  • An enzymatic reaction can be used in the method of binding the labeling substance to the 3'end and the method of binding the labeling substance to the 5'end.
  • T4 RNA Ligase, Thermal Deoxytyl Transferase, Poly A polymerase, or the like may be used.
  • the labeling substance may be a nucleic acid having one or more labeled substances. It may also contain a linker sequence that is a polymer of at least two or more nucleic acids.
  • the labeling substance that can be used known substances used for labeling, such as fluorescent dyes, phosphorescent dyes, and radioisotopes, can be used. Fluorescent dyes that are easy to measure and easy to detect signals are preferred. Specifically, cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorosane, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), cyanine.
  • cyanine 2 aminomethylcoumarin, fluorosane
  • indocarbocyanine (cyanine 3) cyanine 3.5
  • tetramethylrhodamine rhodamine red
  • Texas red Texas red
  • indocarbocyanine (cyanine 5) cyanine.
  • cyanine 5 cyanine.
  • Known fluorescent dyes such as 5.5, cyanine 7, and oyster can be mentioned.
  • a fluorescence microscope, a fluorescence scanner, or the like can be used to detect the fluorescent dye.
  • nucleic acid When the nucleic acid is DNA, PCR, sequencing, hybridization and the like can be mentioned as a method for detecting nucleic acid.
  • the nucleic acid When the nucleic acid is RNA, it can be detected by PCR, sequencing, hybridization or the like after being converted into a DNA fragment by reverse transcriptase.
  • the nucleic acid When the nucleic acid is RNA, it can be detected by LC / MS / MS after hydrolyzing RNA into a monomer.
  • the detection step (3) itself is well known and can be performed by a conventional method.
  • the variation in measurement data can be expressed using the coefficient of variation as an index.
  • the coefficient of variation is obtained by dividing the standard deviation of the values obtained in a plurality of measurements by the average value and then multiplying by 100.
  • the coefficient of variation is small, it can be said that the variation in the measurement data is small.
  • it is less than 5% it can be said that the variation in the measurement data is small.
  • the nucleic acid purification column of the present invention has a hollow body (tube) provided with an inlet opening and an outlet opening and a nucleic acid-binding solid-phase carrier, and "a solution containing a chaotropic agent in the nucleic acid-binding solid-phase carrier". It is produced by a method including step A, which is a step of drying the nucleic acid-binding solid-phase carrier after passing the solution.
  • FIG. 2 shows one aspect of the nucleic acid purification column of the present invention.
  • the hollow body 1 has a cylindrical structure, and has an inlet opening 2 provided for injecting a sample solution and an outlet opening 6 for discharging the solution that has passed through the solid phase carrier 5.
  • the material of the hollow body the same material as the existing nucleic acid purification column such as polypropylene, polyethylene, polymethylmethacrylate, polytetrafluoroethylene, polyethyl terephthalate, polyacrylonitrile and other resins, and glass can be used.
  • the inside of the hollow body 1 is filled with the nucleic acid-binding solid-phase carrier 5.
  • a fixture 4 for immobilizing the solid-phase carrier 5 may be attached to the inlet opening side.
  • the same resin material as that of the hollow body 1 can be used.
  • the fixture 4 preferably has an outer diameter having the same dimensions as the inner diameter of the hollow body 1 and has an O-ring structure in which the central portion is hollowed out.
  • the hollow body 1 may have a rim 3.
  • the rim 3 By providing the rim 3, when the present device is used with a centrifuge, it can be attached to the container 8 and used as shown in FIG.
  • a support 7 for holding the solid-phase carrier 5 can be provided so that the solid-phase carrier 5 does not deform or fall off during, for example, centrifugation.
  • the support 7 has a microporous structure having a size that the solid-phase carrier 5 does not pass through, and allows the solution to pass through.
  • a plastic film such as sintered glass, polypropylene, glass, ceramics, or nylon, or a non-woven fabric made of polypropylene, polyethylene, nylon, or the like can be used.
  • FIG. 5 shows a 96-well plate format, which is another aspect of the nucleic acid purification column of the present invention. It has a structure in which 8 ⁇ 12 nucleic acid purification columns shown in FIGS. 2 and 3 are arranged and bound at the outer peripheral portion of the hollow body 1. Each has an inlet opening 2 and an outlet opening 6 for discharging the solution that has passed through the solid phase carrier 5. The solution can be separated and removed by centrifugation or suction.
  • a 96-well plate format column is commercially available as a plate in which a plurality of columns are grouped, but the number and arrangement of columns is not limited to 8 ⁇ 12, and other columns may be used. Other arrangements (different number of rows and columns) can be adopted.
  • the nucleic acid purification column having the hollow body provided with the inlet opening and the outlet opening and the nucleic acid-binding solid-phase carrier can be produced by the following procedure.
  • the hollow body 1 is filled with the solid phase carrier 5.
  • the solid phase carrier 5 when the solid phase carrier 5 is in the form of particles or beads, it may be filled as it is with a spatula or the like, but after being dispersed in a solvent such as water or a buffer solution, it is dispersed with a pipette or the like. You may pour it.
  • the solid-phase carrier 5 is in the form of a sheet or a woven fabric, the solid-phase carrier 5 is cut out according to the inner diameter of the hollow body 1, filled in the hollow body 1, and if necessary, the above-mentioned O
  • the solid-phase carrier 5 can be fixed by fitting the ring-structured fixture 4.
  • the nucleic acid purification column of the present invention is produced by a method including step A in which a solution containing a chaotropic agent is passed through a nucleic acid-binding solid-phase carrier and then the nucleic acid-binding solid-phase carrier is dried.
  • the solution containing the chaotropic agent the same solution as that used in the method for separating the nucleic acid of the present invention can be used.
  • a chaotropic agent an aqueous solution or an alcohol-containing aqueous solution containing guanidinium salt, urea, iodide salt, chlorate, perchlorate, thiocyanate, isothiocyanate and the like at a concentration of 1M to 8M. Can be preferably used.
  • the solid phase carrier As a method for passing (passing) a solution containing a chaotropic agent through the nucleic acid-binding solid phase carrier, the solid phase carrier is placed in the column as in the case of the method for separating the nucleic acid of the present invention shown in FIG.
  • a solution containing a chaotropic agent is passed through (passing) the column, separated by centrifugation or suction (procedure 1), and subsequently, if necessary, water or 10 to 80% by volume ethanol or the like is used. It can be carried out by passing an aqueous alcohol solution of the above and removing it by centrifugation or suction (procedure 2).
  • the step of passing the solution containing the chaotropic agent through the nucleic acid-binding solid-phase carrier can be carried out before the solid-phase carrier is filled in the column. Specifically, it can be carried out by immersing the solid phase carrier in a solution containing a chaotropic agent, immersing it in water if necessary, and separating and removing the solution by centrifugation or suction.
  • the nucleic acid-binding solid-phase carrier After passing (passing) the solution containing the chaotropic agent, the nucleic acid-binding solid-phase carrier is preferably washed with water or an aqueous alcohol solution as described above, and then the nucleic acid-binding solid-phase carrier is dried.
  • the drying may be carried out by natural drying, and specifically, the water content of the solid-phase carrier can be evaporated by allowing it to stand for several minutes to several hours or more. .. Alternatively, the water may be evaporated by leaving it in a heated oven.
  • the temperature in this case can be appropriately set depending on the material of the hollow body, the fixture, the support, and the like, but it is preferably carried out in the range of 20 ° C. to 80 ° C.
  • the solid-phase carrier When the solid-phase carrier is passed through a solution containing a chaotropic agent before being filled in the column, the solid-phase carrier can be dried in the same manner, and then the solid-phase carrier is filled inside the hollow body. Can be done.
  • a nucleic acid purification column can be prepared by fitting a fixture having an O-ring structure and fixing the solid-phase carrier on the solid-phase carrier, if necessary.
  • nucleic acid purification column comprising a solid phase carrier is commercially available. Therefore, as described in the examples below, a commercially available nucleic acid purification column is passed through a chaotropic agent as described above, and then a solid phase is preferable.
  • the nucleic acid purification column of the present invention can also be produced by washing the carrier with water or an aqueous alcohol solution and then drying the solid phase carrier.
  • nucleic acid purification column included in the nucleic acid purification kit "miRNeasy Mini Kit” manufactured by Kiagen Co., Ltd., which uses a silica membrane having a diameter of 8 mm as a nucleic acid purification column having a commercially available nucleic acid-binding solid phase carrier ( Nucleic acid purification column (hereinafter referred to as "column B") included in the MACHEREY-NAGEL nucleic acid purification kit "NucleoSpin miRNA Plasma" using a silica membrane having a diameter of 8 mm (hereinafter referred to as "column A”), nucleic acid purification manufactured by Qiagen.
  • column B included in the MACHEREY-NAGEL nucleic acid purification kit "NucleoSpin miRNA Plasma” using a silica membrane having a diameter of 8 mm
  • Nucleic acid purification column included in the kit “RNeasy 96 kit” (hereinafter referred to as “column C”), nucleic acid purification column included in the nucleic acid purification kit “RNeasy UCP micro kit” manufactured by Qiagen (hereinafter referred to as “column D”), Nucleic acid purification column included in Zymo Research's nucleic acid purification kit “RNA Clean & Concentrator Kit” (hereinafter referred to as “column E”), nucleic acid purification column included in citiva's nucleic acid purification kit "96 Well 800 ⁇ l UNIFILTER Microplate” (Hereinafter referred to as “column F”) was used (Table 1).
  • the step of passing the solution containing the chaotropic agent through the nucleic acid-binding solid-phase carrier of the nucleic acid purification column was carried out by the following procedure.
  • a solution containing 800 ⁇ L of a chaotropic agent was placed on a column and centrifuged at 12,000 ⁇ g for 1 minute to remove the solution.
  • a solution containing a chaotropic agent a 1.3 M guanidine hydrochloride solution (Example 1) and a 67% ethanol solution of 1.3 M guanidine hydrochloride (Example 2) were used, respectively.
  • 800 ⁇ L of water was placed on the column and centrifuged at 12,000 ⁇ g for 1 minute to remove the water.
  • the nucleic acid in the eluate obtained as described above was labeled with "3D-Gene” miRNA labeling kit (manufactured by Toray Industries, Inc.).
  • the labeled nucleic acid (RNA) was hybridized and washed according to the standard protocol of "3D-Gene” miRNA chip (manufactured by Toray Industries, Inc.).
  • the fluorescence signal of the reacted DNA microarray was detected using a "microarray scanner” (manufactured by Toray Co., Ltd.), the number of miRNAs for which a signal significantly higher than the background noise was obtained was determined, and the value was measured between multiple measurements. The standard deviation and coefficient of variation were calculated in (Table 1).
  • Example 1 passing a 1.3M guanidine hydrochloride solution
  • Example 2 passing a 67% ethanol solution of 1.3M guanidine hydrochloride
  • the average number of detected miRNAs was 1407
  • the standard deviation was 21, and the coefficient of variation was 1.5%. In both cases, the variation was greatly reduced as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 1 passing a 1.3M guanidine hydrochloride solution
  • Example 2 passing a 67% ethanol solution of 1.3M guanidine hydrochloride
  • the average number of detected miRNAs was 1401
  • the standard deviation was 18, and the coefficient of variation was 1.3%. In both cases, the variation was greatly reduced as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 3 Separation of nucleic acid from a sample containing nucleic acid by using guanidine thiocyanate instead of guanidine hydrochloride as a chaotropic agent and using nucleic acid purification columns A to F shown in Table 1 in the same manner as in Examples 1 and 2. And the nucleic acid separated by the DNA microarray was measured (Example 3).
  • the centrifugal acceleration condition at the time of removing the solution was set to 3,000 ⁇ g.
  • Nucleic acid was separated from the prepared nucleic acid sample using each column in the same manner as in Examples 1 and 2, and then the nucleic acid was measured by a DNA microarray, and the miRNA detected between the multiple measurements was performed from each measured value. The standard deviation and coefficient of variation of the numbers were determined (Table 3).
  • the coefficient of variation was 5.2% to 5.9% under the condition of passing the sterile purified water of Comparative Example 3 through the liquid, but it was 1.2% to 1.9% under the condition of passing the chaotropic agent of Example 3 through the liquid.
  • the effect of reducing variation was confirmed in all the columns to which the present invention was applied.
  • the nucleic acid purification column of the present invention was prepared by passing a solution containing a chaotropic agent through a nucleic acid-binding solid-phase carrier and then drying the nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • a silica membrane manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd., model number QR-100 was used as the nucleic acid-binding solid-phase carrier.
  • a column for microbiospin chromatography Bio-Rad, model number 7362204 was used as a hollow body provided with an inlet opening and an outlet opening.
  • Silica filter paper was hollowed out in a circle with a round hole punch with a diameter of 7 mm and filled in a column for microbiospin chromatography.
  • the silica membrane was fixed to the column (hollow body) by attaching a polypropylene O-ring having a diameter of 7 mm from above.
  • the step of passing the solution containing the chaotropic agent through the nucleic acid-binding solid-phase carrier was carried out in the following procedure. 800 ⁇ L of a 67% ethanol solution of 2.1 M guanidine thiocyanate as a solution containing a chaotropic agent was placed on a column and centrifuged at 12,000 ⁇ g for 1 minute to remove the solution. Next, 800 ⁇ L of water was placed on the column and centrifuged at 12,000 ⁇ g for 1 minute to remove the water. Then, the column was allowed to stand indoors for 6 hours and allowed to air dry.
  • column G the nucleic acid purification column of the present invention
  • the nucleic acid purification column of the present invention was prepared by passing a solution containing a chaotropic agent through the nucleic acid purification columns A to F included in the commercially available nucleic acid purification kits shown in Table 1.
  • the nucleic acid purification columns of the present invention (hereinafter referred to as "column A'” to “column F'” respectively) were prepared by passing a solution containing guanidine thiocyanate as a chaotropic agent.
  • Example 6 Using the columns A'to F'prepared in Example 5 and the columns G prepared in Example 4, nucleic acids were separated from the prepared nucleic acid samples in the same manner as in Examples 1 and 2, and the nucleic acids were prepared by DNA microarray. The standard deviation and coefficient of variation of the number of detected miRNAs between multiple measurements were obtained from each measured value (Table 4).
  • the coefficient of variation was 1.2% to 1.7% for columns A'to F'and 1.0% for column G. Compared with the fact that the coefficient of variation was 5.2% to 5.9% in Comparative Example 3 in which sterilized purified water was passed through the liquid, it was confirmed that the nucleic acid purification column of the present invention had an effect of reducing measurement variation. ..
  • Example 6 Each column (Example 6) after passing a 67% ethanol solution of 2.1M guanidine thiocyanate through commercially available nucleic acid purification columns A to F in Example 3, and columns A'to F prepared in Example 5 'And for column G (Example 7) prepared in Example 4, whether or not nucleic acid contamination (residual) is observed in each column is detected by detecting the nucleic acid contained in the eluate with sterile purified water. Verified. For comparison, the same measurement was performed for each column (Comparative Example 6) after passing sterile purified water through the commercially available nucleic acid purification columns A to F in Example 3.
  • nucleic acid purification columns were contaminated with nucleic acids, and the commercially available nucleic acid purification columns were contaminated by subjecting the commercially available nucleic acid purification columns to a liquid-passing treatment with a chaotropic agent. It was found that the nucleic acid was removed. Furthermore, it was found that no nucleic acid contamination was observed in the nucleic acid purification column of the present invention produced by passing a liquid through a chaotropic agent.

Abstract

要約　非常に微量の試料の核酸を分離して、その核酸を検出しようとする場合において、核酸精製カラムに混入した核酸を除去することにより、測定データのばらつきを低減する方法が開示されている。核酸を含有する試料から当該核酸を分離する方法は、工程（１）標的とする核酸を含む試料を、当該核酸を吸着可能な核酸結合性固相担体に接触させる工程、及び工程（１）で核酸が吸着した核酸結合性固相担体から当該核酸を溶出させる工程（２）を含み工程（１）の前に、核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを含む。

Description

核酸の分離方法、検出方法、核酸精製カラム及びその製造方法
　本発明は、核酸を含有する試料から核酸を分離する方法、当該分離した核酸の検出方法、核酸を分離するための核酸精製カラム及び当該核酸精製カラムの製造方法に関する。
　生体試料等の試料からのＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸の分離、精製に関する技術は、生物工学において重要である。核酸の検出及びハイブリダイゼーション、増幅、シーケンシングなどにおいて、再現性よく精度の高い実験結果を得るためには、試料中から対象核酸以外の不純物質を除去し、核酸を分離もしくは単離しておくことが必要である。核酸を含有する試料が生体試料である場合、不純物質としては、タンパク質、炭水化物、脂質及びポリフェノール等が挙げられる。
　これまで、生体試料からの核酸の分離において、様々なアプローチがなされてきた。例えば、エタノール沈殿法等の有機溶媒を用いた抽出方法や、核酸の透析、限外濾過膜を用いた精製、核酸結合性の固相担体を用いて分離する方法などがある。
　これらのうち、エタノール沈殿法は、広く用いられている方法であり、簡単な操作で核酸を分離することができる。しかし、一般に、核酸の回収率が低く、操作方法によって回収率がばらつくという問題がある。透析や限外濾過膜を用いた精製方法も用いられているが、分子量に制限があり、適用できる試料に制限がある。
　近年、上記の核酸結合性の固相担体を用いて分離する方法において一般的に用いられている方法として、試料中の標的核酸を、カオトロピック剤の存在化で、固相担体と結合させて分離する方法が挙げられる（特許文献１、非特許文献１）。この方法はブーム法と呼ばれており、グアニジニウム塩や尿素等のカオトロピック剤の存在下で核酸はシリカなどの固相担体に結合する性質、及び、固相担体に結合した核酸は水で溶出する性質を利用した核酸の精製方法である。ブーム法を用いた核酸精製の手順としては、核酸を含む溶液をカオトロピック剤の存在下でシリカなどの固相担体に接触させることで、試料中の核酸を固相担体に吸着させ、続いてその担体に洗浄液を通じて塩などの余分な成分を洗浄して除去した後、水等を用いて核酸を溶出させる。
　上記のような既存の方法を用いて生体試料から標的の核酸を分離する際、生体試料が微量しか入手できない場合には、分離して得られる核酸も極めて微量となる。そのため、このようにして分離した極微量の核酸を分析又は検出しようとするためには、高感度な分析手法を用いる必要がある。例えば、紫外線吸光度や蛍光を用いての定量が技術的に困難な場合、例えば、検出限界未満（例えば、核酸量が１ｎｇ未満）となるような場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅等の核酸増幅技術を適用した上で、シークエンシングや電気泳動による検出、高感度な核酸マイクロアレイによる検出などが行われる。また、核酸分子を質量分析で直接的に分析するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（特許文献２）などが用いられる。
　非特許文献２は、ヒト試料を市販の核酸精製カラムを用いて精製して得たＲＮＡを分析したところ、ヒト試料由来ではない核酸が検出されたことを報告している。非特許文献２の筆者らは、核酸精製カラム製品に当該核酸が混入していたことを明らかにし、その除去を試みたが水で洗浄するだけでは残留することを報告している。
米国特許第６０２７９４５号明細書 特開２０１７－２２３４６９号公報
Ｒ　Ｂｏｏｍら、１９９０年、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８（３）：４９５－５０３ Ａ　Ｈｅｉｎｔｚ－Ｂｕｓｃｈａｒｔら、２０１８年、ＢＭＣ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６：５２
　上記のような標的とする微量の核酸を検出しようとする場合、当該核酸の精製に使用する核酸精製カラムに不純物である核酸が混入していると、標的核酸の測定データのばらつきが大きくなるという課題がある。特に、上記のような核酸増幅技術を適用し又は高感度核酸マイクロアレイを用いる場合、実験間でのデータのばらつきを低減させることは、信頼性の高い核酸の分析を行うために極めて重要となる。本発明は、非常に微量の試料、例えば１ｎｇ程度の量の核酸を分離して、その核酸を検出しようとする場合において、核酸精製カラムに混入した核酸を除去することにより、測定データのばらつきを低減する方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、標的とする核酸を含有する試料から核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムを用いて当該核酸を分離（精製）する場合に、予め核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させておくことにより、核酸精製カラムに混入した核酸を除去し、分離後の標的核酸を測定する際の測定ばらつきを低減させることができることを見いだした。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
１．下記工程（１）及び（２）
（１）標的とする核酸を含む試料を、当該核酸を吸着可能な核酸結合性固相担体に接触させる工程、及び
（２）前記工程（１）で核酸が吸着した核酸結合性固相担体から当該核酸を溶出させる工程、
を含む、核酸を含有する試料から当該核酸を分離する方法であって、
　前記工程（１）の前に、前記核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを含む、方法。
２．前記核酸結合性固相担体を前記カオトロピック剤を含む溶液に接触させた後、水又はアルコール水溶液で前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程をさらに含む、１項に記載の方法。
３．核酸結合性固相担体がシリカメンブレンである１項又は２項に記載の方法。
４．前記カオトロピック剤が、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩のいずれかである、１項～３項のいずれか１項に記載の方法。
５．前記カオトロピック剤を含む溶液が、アルコールを含む、１項～４項のいずれか１項に記載の方法。
６．前記アルコールがエタノールである、５項に記載の方法。
７．前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、１項～６項のいずれか１項に記載の方法。
８．下記工程（１）、（２）及び（３）
（１）標的とする核酸を含む試料を、当該核酸を吸着可能な核酸結合性固相担体に接触させる工程、
（２）前記工程（１）で核酸が吸着した核酸結合性固相担体から当該核酸を溶出させる工程、及び
（３）前記溶出させた核酸を標識化して検出する工程
を含む、核酸の検出方法であって
　前記工程（１）の前に、前記核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを含む、方法。
９．入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体および核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムであって、
核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程Ａを含む方法によって製造された、核酸精製カラム。
１０．入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体および核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムの製造方法であって、
　核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程Ａを含む、製造方法。
１１．前記核酸結合性固相担体を前記カオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、水又はアルコール水溶液で前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程をさらに含む、１０項に記載の方法。
１２．前記工程Ａは、前記核酸結合性固相担体が中空体に充填された状態で行われる、１０項又は１１項に記載の方法。
１３．前記核酸結合性固相担体がシリカメンブレンである、１０項～１２項のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記カオトロピック剤が、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩である、１０項～１３項のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、標的とする核酸を含有する試料から分離・精製した当該核酸を測定する際のばらつきを低減できる。
本発明の方法における、カオトロピック剤を含む溶液による核酸結合性固相担体の処理の工程を示す図である。 本発明の核酸精製カラムの一態様を示す断面図である。 本発明の核酸精製カラムの別の形態を示す断面図である。 本発明の核酸精製カラムと容器を組み合わせた状態を示す断面図である。 本発明の核酸精製カラムの別の形態を示す斜視図である。
　本発明の核酸精製カラムに供せられる試料としては、核酸を含有する可能性のあるものであれば、特に限定されない。例えば、動物に由来する試料、植物に由来する試料、菌類や細菌等の微生物に由来する試料等、何らかの核酸を含み得る試料等が挙げられる。動物に由来する試料として、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液試料や、各種組織、ホルマリン固定パラフィン包埋検体（ＦＦＰＥ）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
　標的とする核酸は、特に限定されない。例えば、上記試料に含まれるＤＮＡやＲＮＡを用いることができ、これら核酸を試験管内で化学反応あるいは酵素反応処理した核酸であっても構わない。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ、それらの一部である断片などがある。核酸がＤＮＡである場合、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡのいずれであってもよい。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ、マイクロＲＮＡやそれらの一部である断片などがある。また、化学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸も、本発明の標的核酸として用いることができる。
　核酸結合性固相担体（以下、単に「固相担体」又は「担体」ともいう。）は、核酸を吸着し得るものであれば特に限定されない。ここで、「核酸結合性」とは、カオトロピック塩の共存下で、核酸との間に疎水結合を形成しうる物質である。
　固相担体の材質としては、例えば、シリカ、ガラス、アルミナ、ゼオライト、粘土鉱物等の無機材料や、ポリスチレン等のポリマー材料が好ましく用いられる。具体的には、米国特許第５２３４８０９号に記載の材料などのシリカをベースとする材料、国際公開第９６／１８７３１号に記載の材料などのラテックス及びポリスチレンベースの材料を含むポリマー材料等を用いることができる。固相担体の形状としては、粒子、ビーズ、シート（膜、メンブレン）、織布及び繊維等が挙げられる。固相担体として特に好ましくはシリカメンブレンである。シリカメンブレンはシリカ、ガラス又は石英の繊維からなる膜状のもの、もしくはシリカゲルでできた薄膜であり、特許第３３２９８１３号あるいは特表平８－５０１３２１に開示されている。
　これら固相担体は、カラム中に充填されて試料溶液等を通すことで用いるか、又はそのまま試料溶液等に浸漬させて懸濁状態で使用することができる。
　固相担体を上記懸濁状態で使用する場合、磁場を利用することで懸濁液から担体を容易に分離して回収できることから、固相担体として磁性粒子も好ましく用いられる。磁性粒子において使用される一般的な材料としては、磁性酸化金属、特に酸化鉄が挙げられる。有用な磁性酸化物には、任意にその第一鉄のすべて又は一部が、カルシウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、ニッケル、バナジウム及び／又は亜鉛などの二価遷移金属で置換される、酸化鉄が含まれる。シリカベースの磁性粒子としては、例えば、米国特許第６０２７９４５号及び同第５９４５５２５号に記載の粒子が挙げられる。
　一般に、核酸精製カラムは、固相担体をカラムに充填したものであり、試料溶液を通して溶液中の核酸を分離する目的で用いられる。
　シリカメンブレンを固相担体として用いる核酸精製カラムは、複数のメーカーから市販されているものを入手できる。代表的なものとして、キアゲン社製の「miRNeasy serum/plasma kit」（型番217184）、「miRNeasy 96 kit」（型番217061、*）、「miRNeasy Mini Kit」（型番217004）、「QIAamp DNA mini kit」（型番51304）、「RNeasy micro kit」（型番74004）、「RNeasy UCP micro kit」（型番73934）、「RNeasy MinElute Cleanup Kit」（型番74204）、MACHEREY-NAGEL社製の「NucleoSpin miRNA Plasma」（型番740981.1）、「NucleoSpin RNA」（型番740955.1）、「NucleoSpin 96 RNA」（型番740709.24、*）、「NucleoSpin 8 RNA」（型番740698）、「NucleoSpin RNA Plus」（型番740984.1）、Zymo Research社製の「RNA Clean & Concentrator Kit」（型番R1080、*）、「RNA Clean & Concentrator-5」（型番R1013）、「RNA Clean & Concentrator-25」（型番R1017）、「UNIFILTER Microplate, 96-well, 800 μl, DNA binding, clear polystyrene」（型番7700-2810、*）、「UNIFILTER Microplate, 96-well, 800 μl, GF/C, clear polystyrene, filter bottom with long drip director」（型番7700-2801*）、Thermo Fisher社製の「mirVana miRNA Isolation Kit, with phenol」（型番AM1560）、「PureLink miRNA Isolation Kit」（型番K157001）、「PureLink RNA Mini Kit」（型番12183018A）等の核酸精製キットに含まれる核酸精製カラムが挙げられる。本発明の核酸を分離する方法は、これら市販の核酸精製カラムを用いて標的の核酸の分離をする場合に適用することができる。なお、後述する96ウエルプレートフォーマットの核酸精製カラムを含むキットには、型番の後ろにアスタリスクを付与した。
　前記の磁気粒子を固相担体として用いる核酸精製カラムは、複数のメーカーから市販されているものを入手できる。代表的なものとして、プロメガ社製の「Maxwell RSC miRNA from Tissue and Plasma or Serum」（型番AS1680）、「Maxwell RSC Whole Blood DNA Kit」(型番AS1520)、ベックマン社製の「RNAdvance Blood Kit」（型番A35604）,「 RNAdvance Cell v2 Kit」(型番A47942),サーモフィッシャー社製の「MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit」（型番A27827）,「Dynameads mRNA Purification Kit」(型番61006)等の核酸精製キットに含まれる核酸精製カラムが挙げられる。
　本発明の核酸を分離する方法における工程（１）は、標的核酸を含む試料を固相担体に接触させ、試料中の核酸を固相担体に吸着させる工程である。固相担体がカラム中に充填されている状態で用いる場合、当該カラムに試料溶液を通過させ、必要に応じて、カラム中の試料溶液を遠心又は吸引により分離除去することで行うことができる。具体的には、固相担体が充填されたカラムに標的核酸を含む試料の溶液を載せる。試料溶液の自重によって固相担体を通過させることができるが、時間がかかる場合には、試料溶液を載せたカラムを遠心することで、固相担体中を通過させることができる。遠心条件はカラムの形状によって適宜設定されるが、市販されている固相担体を充填させたカラムの場合には、８０００ｘｇ～１００００ｘｇで行うことができる。
　また、固相担体をカラムに充填せず、試料溶液中に固相担体をそのまま浸漬させた後、遠心又は吸引等により溶液を分離除去することで行うこともできる。具体的には、核酸を含む試料に任意の量の固相担体を加え、浸漬する。この方法の場合には、粒子やビーズ状の固相担体を用いることが好ましい。浸漬後、核酸が結合した固相担体の取り出しは、遠心によって固相担体を溶液の下層に沈め、上澄み液を除去することで実施できる。この時の遠心条件は固相担体の比重から適宜設定できる。固相担体の比重が十分に大きい場合は、遠心せずとも固相担体は下層に沈んでいるため、上澄み液を除去することで固相担体を取り出すことができる。
　本発明の核酸を分離する方法における工程（２）は、工程（１）で固相担体に吸着させた核酸を固相担体から溶出させる工程である。核酸の溶出は、水、又はＴＥバッファー等の極性の低い溶媒を溶出液として用いることで行うことができる。固相担体がカラム中に充填されている状態で用いる場合は、当該カラムに溶出液を通過させ、必要に応じて、カラム中の溶出液を遠心又は吸引により分離することで、核酸を含む溶出液を得ることができる。また、固相担体をカラムに充填せず用いる場合には、固相担体を溶出液にそのまま浸漬させた後、遠心又は吸引等により固相担体を分離除去することにより、溶出された核酸を含む溶出液を得ることができる。
　なお、上記工程（１）及び（２）自体は周知であり、従来の方法で行うことができる。
　本発明の核酸を分離する方法は、標的核酸を含む試料を固相担体に接触させ、試料中の核酸を固相担体に吸着させる上記工程（１）を行う前に、固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを特徴とする。
　カオトロピック剤は、一般に、水分子間の相互作用を減少させることで、溶液中の核酸の構造を不安定化する物質のことである。核酸は、塩基間の水素結合により二次構造をとるが、カオトロピック剤を添加することにより、二次構造が解消される。
　カオトロピック剤としては、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩等を用いることができる。好ましいカオトロピック剤としては、チオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウムが挙げられる。カオトロピック剤を含む溶液の濃度は、１Ｍ～８Ｍの範囲であることが好ましい。
　カオトロピック剤を含む溶液は、水溶液として用いることができるが、アルコールを含有する水溶液であってもよい。アルコールとしては、分子生物学実験で一般的に用いられるエタノールが好ましい。カオトロピック剤を含む溶液におけるアルコールの濃度は、１０～８０容量％の範囲で用いることができる。
　固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させる方法としては、固相担体がカラム中に充填されている状態で用いる場合は、当該カラムにカオトロピック剤を含む溶液を通過（通液）させ、必要に応じて、カラム中の溶液を遠心又は吸引により分離することで行うことができる。また、固相担体がカラムに充填されていない状態で用いる場合には、固相担体をカオトロピック剤を含む溶液にそのまま浸漬させた後、遠心又は吸引等により溶液を分離除去することにより行うことができる。この際、カオトロピック剤を含む溶液の使用量としては、固相担体１０ｍｇに対して０．１ｍＬ～１．５ｍＬ程度、好ましくは０．６ｍＬ～１．０ｍＬ程度である。また、温度は特に限定されず、通常、４℃～６０℃程度で行われるが、室温下で行うことが簡便で好ましい。さらに、固相担体とカオトロピック剤を接触させた後、水又は１０～８０容量％エタノール等のアルコール水溶液で、固相担体を洗浄することが好ましい。この際の水又はアルコール水溶液の使用量は、特に限定されないが、通常、固相担体１０ｍｇに対して０．１ｍＬ～１．５ｍＬ程度である。
　固相担体にカオトロッピック剤を含む溶液を接触させる工程の一例の概略を図１に示す。まず、固相担体に、カオトロピック剤を含む溶液を通し、遠心や吸引等の方法により溶液を除去する（手順１）。次に、必要に応じて、固相担体に水を通し、遠心や吸引等の方法により除去する（手順２）。ここで、水の代わりに、１０～８０容量％エタノール等のアルコール水溶液を用いてもよい。このように準備した固相担体を、核酸を含む試料の分離に用いることができる。
　本発明の核酸の検出方法は、上記のようにして固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させた後、上記の工程（１）及び工程（２）を行って得た標的とする核酸を検出する工程（３）を含むものである。
　核酸の検出は、標識物質により標識化することにより行うことができる。核酸の標識化は、核酸がＤＮＡである場合、ＤＮＡポリメラーゼやＴｅｒｍｉｎａｌ　Ｄｅｏｘｉｔｉｄｉｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ等の酵素を用いて標識物質を取り込ませることができる。核酸を電気泳動で検出する場合には、エチジウムブロマイドなどのインターカレーターを取り込ませることで標識できる。
　核酸がＲＮＡである場合は、ＲＮＡの３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法又はヌクレオシドに標識物質を結合させる方法を用いればよく、又はこれらの方法を組み合わせて用いてもよい。３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法では、酵素反応を用いることができる。酵素反応には、Ｔ４　ＲＮＡ　ＬｉｇａｓｅやＴｅｒｍｉｎａｌ　Ｄｅｏｘｉｔｉｄｉｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｏｌｙ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを用いてもよい。いずれの標識方法も、例えば「ｍｉＲＮＡ実験プロトコール」（羊土社、２００８年）に記載されている方法を参考にすることができる。また、逆転写酵素を用いてＲＮＡをＤＮＡの相補鎖に置き換えた上で、上述のＤＮＡの標識方法を用いることもできる。
　標識物質は、一つ以上の標識体をもった核酸であってもよい。また、少なくとも２つ以上の核酸の重合体であるリンカー配列を含んでいてもよい。
　本発明において、使用できる標識体としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられる。
　蛍光色素の検出には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いることができる。
　核酸を検出する方法として、核酸がＤＮＡである場合、ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどが挙げられる。核酸がＲＮＡである場合、逆転写酵素によってＤＮＡ断片に変換したのち、ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどで検出できる。また、核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡを加水分解しモノマーにした上でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって検出することができる。
　なお、上記検出工程（３）自体は周知であり、従来の方法で行うことができる。
　測定データのばらつきは、変動係数を指標として表すことができる。変動係数は、複数回の測定で得られた値の標準偏差を平均値で除算した上で、１００倍することで得られ、変動係数が小さい場合に測定データのばらつきが小さいということができる。一般に、５％未満であれば測定データのばらつきが小さいと言える。
　本発明の核酸精製カラムは、入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体（チューブ）および核酸結合性固相担体を有し、「核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程」である工程Ａを含む方法によって製造されたものである。
　本発明の核酸精製カラムの一つの態様を図２に示す。中空体１は円筒形状の構造をしており、試料溶液を注入するために設けられた入口開口部２と、固相担体５を通過した溶液を排出するための出口開口部６を有している。当該中空体１の材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチルテレフタレート、ポリアクリロニトリル等の樹脂、ガラス等、既存の核酸精製カラムと同様のものを用いることができる。
　中空体１の内部には、核酸結合性固相担体５が充填される。その入口開口部側に固相担体５を固定化するための固定具４を装着してもよい。固定具４は、中空体１と同様の樹脂製の材質を用いることができる。固定具４は、中空体１の内径と同じ寸法の外径を持ち、中央部をくりぬいたＯリング構造が好ましい。
　中空体１は、リム３を有していてもよい。リム３を設けることにより、遠心分離機を用いて本装置を用いる場合に、図４に示すように、容器８に装着して使用することができる。
　本発明の核酸精製カラムの別の態様を図３に示す。固相担体５が、例えば遠心分離中に変形あるいは脱落しないように、固相担体５を保持するための支持体７を設けることができる。支持体７は、固相担体５が通過しないサイズの微細多孔質構造を有し、溶液を通過させることができる。焼結ガラス、ポリプロピレン、ガラス、セラミックス、ナイロン等プラスチック製の膜、またはポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン等でできた不織布を用いることができる。
　本発明の核酸精製カラムの別の態様である96ウエルプレートフォーマットを図５に示す。図２及び図３で示した核酸精製カラムを８×１２個並べ、中空体１の外周部で結合させた構造である。それぞれ入口開口部２と、固相担体５を通過した溶液を排出するための出口開口部６を有している。溶液の排出は遠心、または吸引により分離除去できる。なお、複数のカラムをプレート状にまとめたものとして、96ウエルプレートフォーマットのカラムが市販されているが、カラムの本数や配置は、８×１２個に限定されるものではなく、他の本数や他の配置（異なる行数と列数）を採用することもできる。
　上記の入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体および核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムは、次の手順で製造できる。
　まず、中空体１に固相担体５を充填する。この工程は、固相担体５が粒子状又はビーズ状である場合には、そのまま薬さじ等を用いて充填してもよいが、水や緩衝液等の溶媒に分散させた上でピペット等で流し込んでもよい。固相担体５がシート状又は織布状である場合には、中空体１の内径に合わせて固相担体５を切り出し、中空体１に充填し、必要に応じてその上から、前記のＯリング構造の固定具４をはめ、固相担体５を固定することができる。
　本発明の核酸精製カラムは、核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通過（通液）させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程Ａを含む方法によって製造される。
　カオトロピック剤を含む溶液は、前記の本発明の核酸を分離する方法で用いるものと同様の溶液を用いることができる。具体的には、カオトロピック剤として、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩等を、１Ｍ～８Ｍの濃度で含む、水溶液又はアルコール含有水溶液を好ましく用いることができる。
　核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通過（通液）させる方法としては、図１に示す前記の本発明の核酸を分離する方法の場合と同様に、固相担体がカラム中に充填されている状態で、当該カラムにカオトロピック剤を含む溶液を通過（通液）させ、遠心又は吸引によって分離し（手順１）、続いて、必要に応じて水又は１０～８０容量％エタノール等のアルコール水溶液を通過させ、遠心又は吸引によって除去する（手順２）ことにより行うことができる。
　また、核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通過させる工程は、固相担体がカラムに充填される前に実施することもできる。具体的には固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に浸漬させた後、必要に応じて水に浸漬させ、遠心又は吸引により溶液を分離除去することにより行うことができる。
　カオトロピック剤を含む溶液を通過（通液）させた後、好ましくは、上記のとおり水又はアルコール水溶液で核酸結合性固相担体を洗浄し、その後、核酸結合性固相担体を乾燥させる。固相担体が中空体に充填された状態である場合、乾燥は自然乾燥で行ってもよく、具体的には数分から数時間以上静置させることで固相担体の水分を蒸発させることができる。または、加温したオーブンの中に放置して水分を蒸発させてもよい。この場合の温度は、中空体、固定具及び支持体の材質等に応じて適宜設定することができるが、20℃～80℃の範囲で実施することが好ましい。固相担体がカラムに充填される前にカオトロピック剤を含む溶液を通過させた場合も、同様にして固相担体を乾燥させることができ、その後に、固相担体を中空体内部に充填することができる。この場合、前記のように、必要に応じてその上から、Ｏリング構造の固定具をはめて固相担体を固定し、核酸精製カラムを作製することができる。
　なお、上記のとおり、固相担体を具備する核酸精製カラムは市販されているので、下記実施例に記載するとおり、市販の核酸精製カラムに、上記のとおりカオトロピック剤を通し、次いで好ましくは固相担体を水又はアルコール水溶液で洗浄し、次いで固相担体を乾燥することによっても本発明の核酸精製カラムを製造することができる。
　本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例により技術的範囲が限定されるものではない。
　以下の実施例、比較例においては、市販の核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムとして、直径８ｍｍのシリカメンブレンを用いるキアゲン社製核酸精製キット「miRNeasy Mini Kit」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＡ」という。）、直径８ｍｍのシリカメンブレンを用いるMACHEREY-NAGEL社製核酸精製キット「NucleoSpin miRNA Plasma」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＢ」という。）、Qiagen社製核酸精製キット「RNeasy 96 kit」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＣ」という。）、Qiagen社製核酸精製キット「RNeasy UCP micro kit」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＤ」という。）、Zymo Research社製核酸精製キット「RNA Clean & Concentrator Kit」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＥ」という。）、cytiva社製核酸精製キット「96 Well 800 μl UNIFILTER Microplate」に含まれる核酸精製カラム（以下「カラムＦ」という。）を用いた（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜実施例１、２、比較例１、２＞
(1)　核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通す工程
　核酸結合性固相担体として、カラムＡ及びカラムＢを用いた。
　核酸精製カラムの核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通す工程は、次の手順で行った。まず、800μLのカオトロピック剤を含む溶液をカラムに載せ、12,000×ｇで1分間遠心し、溶液を除去した。ここで、カオトロピック剤を含む溶液として、１．３Ｍグアニジン塩酸塩溶液（実施例１）、１．３Ｍグアニジン塩酸塩の67％エタノール溶液（実施例２）をそれぞれ用いた。次に、800μLの水をカラムに載せ、12,000×ｇで1分間遠心し、水を除去した。
　本発明の効果を比較するため、カオトロピック剤を含む溶液の代わりに、67％エタノールを上記と同様にしてカラムに通したカラムを用意した（比較例２）。
　また、固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通す工程を施さない無処理のカラムを用意した（比較例１）。
(2)　核酸を含む試料の調製と核酸の分離
　「Isogen LS」（ニッポンジーン社）を用い、ヒト血清３００μLから核酸を含む溶液を取得し、上述のカラムＡ及びカラムＢを用いて核酸を分離した。再現性を検証するため、カラムＡについては４回、カラムＢについては３回実施し、それぞれ核酸を検出するためのサンプルを得た。
　まず、上述のヒト血清３００μLから得た核酸を含む溶液に、その1.5倍量のエタノールを添加し、それぞれカラムＡ、カラムＢに載せた。これを、12,000×ｇで１分間遠心することにより、核酸を含む溶液とカラム中の固相担体とを接触させ、溶液に含まれる核酸を固相担体に吸着させた。続けて、カラムＡ、カラムＢそれぞれの核酸精製キットに添付されている洗浄液をカラムに載せ、12,000×ｇで１分間遠心することで、カラムに残存している核酸以外の成分を洗い流した。最後に、７０μL の水をカラムに載せ、12,000×ｇで１分間遠心することで、核酸を含む溶出液を得た。
(3)　ＤＮＡマイクロアレイによる核酸の測定
　東レ株式会社製の「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ」（ｍｉＲＢａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２１対応、2556種のｍｉＲＮＡを検出可能）を用いて、以下の実験を行った。
　上記のようにして得た溶出液中の核酸を、「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｍｉＲＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ」（東レ社製）を用いて標識した。標識した核酸（ＲＮＡ）に対し、「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｍｉＲＮＡ　ｃｈｉｐ」（東レ社製）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのＤＮＡマイクロアレイの蛍光シグナルを、「マイクロアレイスキャナー」（東レ社製）を用いて検出し、バックグラウンドノイズよりも有意に高いシグナルが得られたｍｉＲＮＡの数を求め、その値の複数測定間での標準偏差及び変動係数を求めた（表１）。
　その結果、カラムＡを用いた場合、比較例１（無処理）では、平均して１５３５個のｍｉＲＮＡが検出された。標準偏差は１３０であり、測定回ごとに大きなばらつきがみられた。比較例２（67％エタノールを通液）も、比較例１と同様に、検出されたｍｉＲＮＡの数がばらついていた。変動係数は、比較例１は8.5％、比較例２は6.6％であった。
　一方、実施例１（１．３Ｍグアニジン塩酸塩溶液を通液）では、検出されたｍｉＲＮＡ数の平均値は1451個、標準偏差は34、変動係数は2.4％となった。実施例２（１．３Ｍグアニジン塩酸塩の67％エタノール溶液を通液）では、検出されたｍｉＲＮＡ数の平均値は1407個、標準偏差は21、変動係数は1.5％となり、実施例１、２ともに比較例１、２に比べ、ばらつきが大きく低減した。
　カラムＢを用いた場合、比較例１（無処理）では、平均して1593個のｍｉＲＮＡが検出された。標準偏差は82であり、測定回ごとに大きなばらつきがみられた。比較例２も比較例１と同様に検出されたｍｉＲＮＡの数がばらついていた。変動係数は、比較例１は5.1％、比較例２は5.6％であった。
　一方、実施例１（１．３Ｍグアニジン塩酸塩溶液を通液）では、検出されたｍｉＲＮＡ数の平均値は1548個、標準偏差は47、変動係数は3.0％となった。実施例２（１．３Ｍグアニジン塩酸塩の67％エタノール溶液を通液）では、検出されたｍｉＲＮＡ数の平均値は1401個、標準偏差は18、変動係数は1.3％となり、実施例１、２ともに比較例１、２に比べ、ばらつきが大きく低減した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜実施例３、比較例３＞
カオトロピック剤として、グアニジン塩酸塩の代わりにグアニジンチオシアン酸塩を用い、表１に示す核酸精製カラムＡ～Ｆを用いて、実施例１、２と同様にして、核酸を含む試料からの核酸の分離およびＤＮＡマイクロアレイによる分離した核酸の測定を行った（実施例３）。
　ここで、カオトロピック剤を含む溶液としては、２．１Ｍグアニジンチオシアン酸塩の６７％エタノール溶液を用いた。また、カラムＣ，Ｅ，Ｆは９６ウエルプレートフォーマットであることから、溶液除去時の遠心加速度条件は3,000×ｇとした。
　比較のため、カオトロピック剤を含む溶液の代わりに滅菌精製水を用いて実施したカラムを用意した（比較例３）。
　実施例１、２と同様にして、調製した核酸試料から各カラムを用いて核酸の分離を行った後、ＤＮＡマイクロアレイによる核酸の測定を行い、各測定値から複数測定間での検出されたmiRNA数の標準偏差及び変動係数を求めた（表３）。
　解析の結果、比較例３の滅菌精製水を通液処理した条件では変動係数が5.2％～5.9％であったが、実施例３のカオトロピック剤を通液処理した条件では1.2％～1.9％となり、本発明を適用したいずれのカラムにおいてもばらつき低減効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜実施例４＞
　核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程を行うことにより、本発明の核酸精製カラムを作製した。
　核酸結合性固相担体として、シリカメンブレン（アドバンテック東洋社製、型番ＱＲ－１００）を用いた。入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体として、マイクロバイオスピンクロマトグラフィー用カラム（バイオラッド、型番7326204）を用いた。
　直径７mmの丸穴ポンチで円形にシリカ濾紙をくりぬき、マイクロバイオスピンクロマトグラフィー用カラムに充填した。その上から直径７mmのポリプロピレン製Ｏリングを装着することでシリカメンブレンをカラム（中空体）に固定した。核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通す工程は、次の手順で行った。カオトロピック剤を含む溶液として２．１Ｍグアニジンチオシアン酸塩の６７％エタノール溶液800μLをカラムに載せ、12,000×ｇで1分間遠心し、溶液を除去した。次に、800μLの水をカラムに載せ、12,000×ｇで1分間遠心し、水を除去した。その後、カラムを室内に６時間静置し自然乾燥させた。
　以上のようにして、本発明の核酸精製カラム（以下「カラムＧ」という。）を作製した。
　＜実施例５＞
　表１に記載の市販の核酸精製キットに含まれる核酸精製カラムＡ～Ｆに、カオトロピック剤を含む溶液を通して、本発明の核酸精製カラムを作製した。
　カラムＡ～Ｆについて、カオトロピック剤を含む溶液を通す工程（水洗工程を含む）を実施例３記載の手順で実施した。遠心分離による溶液除去後、各カラムを室内に６時間静置し自然乾燥させた。
　以上のようにして、カオトロピック剤としてグアニジンチオシアン酸塩を含む溶液を通液した本発明の核酸精製カラム（以下、それぞれ「カラムＡ’」～「カラムＦ’」という。）を作製した。
　＜実施例６＞
　実施例５で作製したカラムＡ’～Ｆ’および実施例４で作成したカラムＧを用いて、実施例１、２と同様にして、調製した核酸試料から核酸の分離を行い、ＤＮＡマイクロアレイによる核酸の測定を行い、各測定値から複数測定間での検出されたmiRNA数の標準偏差及び変動係数を求めた（表４）。
　解析の結果、変動係数は、カラムＡ’～Ｆ’では1.2％～1.7％、カラムＧでは1.0%となった。滅菌精製水を通液処理した比較例３では変動係数が5.2％～5.9％であったことと比較すると、本発明の核酸精製カラムでは、測定ばらつき低減効果が得られていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜実施例６、７、比較例６＞
　実施例３において市販の核酸精製カラムＡ～Ｆに２．１Ｍグアニジンチオシアン酸塩の６７％エタノール溶液を通液した後の各カラム（実施例６）、実施例５で作製したカラムＡ’～Ｆ’および実施例４で作成したカラムＧ（実施例７）について、各カラム中に核酸の混入（残留）がみられるかどうかを、滅菌精製水による溶出液に含まれる核酸を検出することにより、検証した。比較のため、実施例３において市販の核酸精製カラムＡ～Ｆに滅菌精製水を通液した後の各カラム（比較例６）について、同様に測定を行った。
　各カラムに滅菌精製水７０μＬを滴下し、遠心分離することで溶出液を得た。当該溶出液に含まれる核酸の測定を、実施例１、２と同様の手順で実施した。検出されたmiRNAの数を表５に示した。
　カオトロピック剤を含む溶液を通液せず滅菌精製水で通液処理を施した後のカラムＡ～Ｆの溶出液では、５０～２６９種のmiRNAが検出された。一方、２．１Ｍグアニジンチオシアン酸塩の６７％エタノール溶液で処理した後のカラムＡ～Ｆ、及びカオトロピック剤の通液処理をして製造した本発明のカラムＡ’～Ｆ’、Ｇでは、溶出液中に核酸がほぼ検出されなかった。このことから、市販の核酸精製カラムには、いずれも核酸が混入していたこと、また、本発明の方法によって市販の核酸精製カラムにカオトロピック剤の通液処理をすることにより、混入していた核酸が除去されたことが分かった。さらに、カオトロピック剤の通液処理をして製造された本発明の核酸精製カラムにおいて、核酸の混入がみられないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
１　中空体
２　入口開口部
３　リム
４　固定具
５　核酸結合性固相担体
６　出口開口部
７　固定具
８　容器

Claims (14)

  1. 　下記工程（１）及び（２）
    （１）標的とする核酸を含む試料を、当該核酸を吸着可能な核酸結合性固相担体に接触させる工程、及び
    （２）前記工程（１）で核酸が吸着した核酸結合性固相担体から当該核酸を溶出させる工程、
    を含む、核酸を含有する試料から当該核酸を分離する方法であって、
    　前記工程（１）の前に、前記核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを含む、方法。
  2. 　前記核酸結合性固相担体を前記カオトロピック剤を含む溶液に接触させた後、水又はアルコール水溶液で前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　核酸結合性固相担体がシリカメンブレンである請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記カオトロピック剤が、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩のいずれかである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記カオトロピック剤を含む溶液が、アルコールを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記アルコールがエタノールである、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　下記工程（１）、（２）及び（３）
    （１）標的とする核酸を含む試料を、当該核酸を吸着可能な核酸結合性固相担体に接触させる工程、
    （２）前記工程（１）で核酸が吸着した核酸結合性固相担体から当該核酸を溶出させる工程、及び
    （３）前記溶出させた核酸を標識化して検出する工程
    を含む、核酸の検出方法であって
    　前記工程（１）の前に、前記核酸結合性固相担体をカオトロピック剤を含む溶液に接触させることを含む、方法。
  9. 　入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体および核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムであって、
    核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程Ａを含む方法によって製造された、核酸精製カラム。
  10. 　入口開口部と出口開口部とが設けられた中空体および核酸結合性固相担体を有する核酸精製カラムの製造方法であって、
    　核酸結合性固相担体にカオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、当該核酸結合性固相担体を乾燥させる工程Ａを含む、製造方法。
  11. 　前記核酸結合性固相担体を前記カオトロピック剤を含む溶液を通液させた後、水又はアルコール水溶液で前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記工程Ａは、前記核酸結合性固相担体が中空体に充填された状態で行われる、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記核酸結合性固相担体がシリカメンブレンである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記カオトロピック剤が、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
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