JPH09505724A - 核酸精製用組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸がその中にｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで存在している細胞、ゲル、溶液及び他の媒体から約５０塩基長以上の核酸を単離するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物はシリカ材料シリカゲルとガラス粒子、特にガラス微細繊維の混合物；塩酸グアニジニウム又はチオシアン酸グアニジニウムなどのカオトロピック塩を混合したこのような混合物；及びカオトロピック塩の水溶液中のこのような混合物の懸濁液である。本発明の方法では、核酸を含有する水溶液をカオトロピック塩の水溶液と混合し、得られた溶液をシリカ材料の混合物に接触させると、溶液中の核酸がシリカ材料と結合する。本発明の方法で処理した水溶液からのカオトロピック塩及びシリカ材料に吸着した核酸以外の成分をシリカ材料から洗い流す。最後に、シリカ材料から溶離させることにより核酸が得られる。本発明の方法は、その後の処理又は分析を妨げるいかなる塩又は高分子によっても汚染されていない核酸の水溶液又はＴＥ緩衝液などの緩衝液溶液を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸精製用組成物及び方法 技術分野 本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸と結合している他の物 質から核酸を分離し、その後の処理又は分析に適した状態で核酸を単離するため の組成物及び方法に関する。発明の背景 ＲＮＡ及びＤＮＡを含む核酸に逆転写、クローニング、制限分析、配列決定な どの分子生物学的技術を適用するには、ある種の汚染物質を実質的に含有しない 核酸を提供することが必要である。このような汚染物質としては特に、分子生物 学的技術で使用される核酸ハイブリダイゼーション、酵素触媒反応及び他の型の 反応を含む化学反応を阻止ないし阻害する物質；対象核酸の分解ないし解重合を 触媒する物質；又はサンプル中に実際には存在しない所定量の対象核酸がサンプ ル中に存在することを示す「バックグラウンド」を提供する物質が挙げられる。 これらの汚染物質 には、酵素、他の型のタンパク質、多糖類又はポリヌクレオチドなどの高分子量 物質と、脂質、低分子量酵素阻害剤又はオリゴヌクレオチドなどの低分子量物質 がある。 分子生物学的方法を適用するために十分な程度に汚染物質を含有しない対象Ｄ ＮＡ又はＲＮＡを得るという問題は、ＤＮＡ又はＲＮＡが典型的には複合系に存 在するので複雑になっている。これらの系は組織からの細胞や、体液（例えば血 液、リンパ液、乳汁、尿、糞便、精液等）からの細胞や、培養物、アガロースゲ ル若しくはポリアクリルアミドゲル中の細胞、又はターゲット核酸増幅を実施し た溶液などであり、有意量の汚染物質を含有しているのが典型であり、分子生物 学的手順を実施する前に対象ＤＮＡ又はＲＮＡを無傷で取り出さなければならな い。 細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを得るための慣用プロトコルは当業者に周知であり 、例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ ｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）の第２章（ＤＮＡ）及び第４章（ＲＮＡ ）に記載されている。これらのプロトコルによりＤＮＡを得るには、一般に細胞 を温 和に溶解させてＤＮＡを可溶化させ、タンパク質、ＲＮＡ及び他の物質などの汚 染性物質をＤＮＡから酵素的又は化学的に実質的に除去する（即ち対象分子生物 学的手順を実施できるような十分低いレベルまでＤＮＡと同一溶液中のこれらの 汚染物質の濃度を低下させる）。ＲＮＡを単離するには、溶解及び可溶化手順は ＲＮＡから分離すべきリボヌクレアーゼ及びＤＮＡを含む汚染物質を阻害するた めの手段が含まれていなければならない。 慣用プロトコルは更に、一般に（ＤＮＡを得るためには）ＤＮＡを用いる分子 生物学的手順を妨げる汚染物質を実質的に含有しないフェノール／クロロホルム 抽出（即ちフェノール／クロロホルム又はフェノール／クロロホルム／イソアミ ルアルコールによる抽出）及びエタノール（又はイソプロパノール）沈殿を使用 する。しかしながら、フェノール／クロロホルム抽出には大きな欠点がある。こ れらの欠点は、抽出に多段階が必要なため長時間を要することや、フェノール又 はクロロホルムの使用に危険を伴うことである。フェノールに接触すると重度火 傷を生じる。クロロホルムは高揮発性、毒性且つ引火性である。これらの危険に より、ヒュームフード中でフェノールを取り扱ったりフェ ノール／クロロホルム抽出を行わなければならない。フェノール／クロロホルム 抽出の別の望ましくない特徴は、フェノールの酸化生成物が核酸を損傷する恐れ があるという点である。新たに再蒸留したフェノールしか実際に使用することが できず、核酸をフェノールの存在下に置くことができない。また、一般にはフェ ノール／クロロホルム抽出後にＲＮＡを単離するためには、多段階手順が必要で ある。ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出水溶液からＤＮＡを沈殿させ、Ｄ ＮＡから残留フェノール及びクロロホルムを除去するためには、エタノール（又 はイソプロパノール）沈殿を使用しなければならない。更に、ある種のヌクレオ シド三リン酸及び短い（約３０塩基又は塩基対以下の）１本鎖又は２本鎖オリゴ ヌクレオチド汚染物質をＤＮＡから除去するためにもエタノール（又はイソプロ パノール）沈殿が必要である。 分子生物学的手順を使用する操作に十分な程度までＤＮＡを精製するために、 フェノール／クロロホルム抽出／エタノール沈殿よりも簡単、安全又は有効な方 法が業界で必要とされている。 また、操作に十分な純度でＲＮＡを単離する改善方法も 業界で必要とされている。 多くの分子生物学的手順には、細胞から回収したＤＮＡのサイズによる分画が 必要であり、このような分画は典型的にはアガロース又はポリアクリルアミドゲ ル電気泳動により実施される。分画後に分子生物学的手順により分析又は処理す るためには、このような電気泳動で使用したゲル中のアガロース、他の多糖類、 ポリアクリルアミド、アクリルアミド又はアクリル酸などの汚染物質から対象フ ラクション中のＤＮＡを分離しなければならない。そこで、このような分離を実 施するための方法が業界で必要とされている。 周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば米国特許第４，６８３，２ ０２号参照）などの核酸又はそのセグメントの増幅方法では、酵素、ヌクレオシ ド三リン酸、オリゴヌクレオチド及び他の核酸類の複合混合物の溶液が生成され る。通常上記方法は、著しく多量の単一核酸セグメント（「ターゲットセグメン ト」）を得るために行なわれる。多くの場合には増幅プロセスの実施後に溶液中 の他の成分からこの核酸を分離することが必要である。そこで、これらの分離を 実施する簡単な方法が必要とされている。 この点でＰＣＲ法による増幅で特に問題となるのは、プロセスで増幅しようと する核酸（通常は２本鎖ＤＮＡ）を同様にプロセスで高レベルまで増幅された「 プライマー二量体」から分離する問題である。「プライマー二量体」は、別のプ ライマー上のＰＣＲ増幅で鋳型として使用されるプライマーの１つによるＤＮＡ 合成のプライミングにより生成されるＤＮＡである。プライマー二量体はＰＣＲ 増幅で高濃度まで増幅し得る。 ＤＮＡを他の物質から分離し、分子生物学的手順でのＤＮＡの使用を妨げる汚 染物質をＤＮＡから実質的に除去することによりＤＮＡをこのような手順に適応 させるために、例えばガラス粉末、シリカ粒子及びガラス繊維濾紙を粉砕するこ とにより作成されるガラス微細繊維などのガラス粒子や、珪藻土を含むシリカ材 料がカオトロピック塩の水溶液と併用されてきた。米国特許第５，０７５，４３ ０号と、Ｍａｒｋｏら， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２１，３８２−３８ ７（１９８２）及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ７６，６１５−６１９（１９７９）を含むその引用文献参 照。更にＢｏｏｍら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８，４９５−５０３（１９９０）も参照。ＤＮＡを他の物質から分離するため にカオトロピック塩の水溶液と併用する無傷のガラス繊維濾紙については、Ｃｈ ｅｎとＴｈｏｍａｓ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０１，３３９−３４１ （１９８０）を参照されたい。前出のＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎらは、シリカゲルが ＤＮＡ分離で使用するのに適していないと示唆している。シリカ材料とカオトロ ピック物質を使用するＲＮＡの分離については、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，米国特 許第５，１５５，０１８号を参照されたい。 ガラス粒子とシリカゲルの混合物、カオトロピック物質の水溶液中のこのよう な混合物の懸濁液、及びＤＮＡもしくはＲＮＡを他の物質から分離するため、又 はこうして分離したＤＮＡもしくはＲＮＡを単離するためにこのような懸濁液を 使用することは本発明以前には知られていなかった。発明の要約 ＤＮＡ又はＲＮＡを他の物質から分離し、分子生物学的手順で使用するのに適 切な程度まで十分にＤＮＡ又はＲＮＡから汚染物質を除去し、このような用途に 適したＤＮＡ 又はＲＮＡを単離するために、シリカゲルとガラス粒子の混合物をカオトロピッ ク塩の水溶液と併用すると有利であることが茲に知見された。このような混合物 はＲＮＡを分離及び単離するのに使用しても有利である。 従って、本発明はシリカゲルとガラス粒子の混合物、これらの混合物とカオト ロピック塩及びカオトロピック塩の水溶液の組み合わせ、カオトロピック塩の水 溶液中のシリカゲルとガラス粒子の混合物の懸濁液、並びにＤＮＡ又はＲＮＡを 含む水溶液からＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、こうして分離したＤＮＡ又はＲＮＡ を単離する際におけるこのような組み合わせ及び懸濁液の使用方法を提供する。 本発明のこれらの使用方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡのこのような分離及び単離にお いて、珪藻土単独又はガラス粒子単独をカオトロピック塩と併用又はカオトロピ ック塩水溶液中懸濁液として使用する方法を、予想外に改善するものである。発明の詳細な説明 １態様において、本発明はシリカゲルとガラス粒子の混合物である。 別の態様では、本発明は１種以上のカオトロピック塩を含有する水溶液中のシ リカゲルとガラス粒子の懸濁液を包 含する。 更に別の態様では、本発明はＤＮＡ又はＲＮＡを含有する第１の水溶液からＤ ＮＡ又はＲＮＡを分離する方法であり、該方法は、（１）１種以上のカオトロピ ック塩を含有する第３の水溶液と前記第１の水溶液のアリコートを混合すること により第２の水溶液を調製する段階と、（２）前記第２の水溶液のアリコートを シリカゲルとガラス粒子の混合物に接触させる段階とを含む。 ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する水溶液からＤＮＡ又はＲＮＡを分離するための本 発明の方法は、段階（２）の後に、（３）段階（２）で第２の水溶液の前記アリ コートと接触させたシリカゲルとガラス粒子の混合物の第１の部分から、前記混 合物の前記第１の部分に結合していない前記アリコートの実質的に全部を分離す る段階と、（４）シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第１の部分の一部 である前記混合物の第２の部分を、シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記 第２の部分からカオトロピック塩の実質的に全部を除去するのに有効であり且つ 短いオリゴヌクレオチド以外のＤＮＡ（又は場合によりＲＮＡ）を除去するのに は実質的に無効な第４の水溶液で洗浄する段階と、段階 （４）の後に（５）シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第２の部分の一 部である前記混合物の第３の部分を水又は第５の水溶液で洗浄し、前記第３の部 分からＤＮＡ（又は場合によりＲＮＡ）を溶離させる段階とを加えることにより 、ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法になる。第５段階で溶離した ＤＮＡ又はＲＮＡは本発明に従って単離されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、分子生 物学的手順でそれ以上精製せずに使用するのに適している。 本明細書中で使用する「シリカ材料」なる用語は、大部分がシリカであるシリ カゲル又はガラス粒子を意味する。 本発明で使用するシリカゲルは慣用シリカゲルであり、好ましくは少なくとも 「クロマトグラフィーグレード」である。 シリカゲルは広く市販されている。シリカゲルは「細孔径」、「粒度」及び比 表面積により特徴を表すことができる。本発明に適切なシリカゲルは、約３０〜 約３００Å、好ましくは約６０Åの細孔径と、約５μｍ〜約３００μｍ、好まし くは約１０μｍの粒度と、約１００ｍ²／ｇ〜約１０００ｍ²／ｇ、好ましくは約 ５００ｍ²／ｇの比表面積を有する。本発明に最適なシリカゲルは細孔径約６０ Å、粒 度９〜１１μｍ及び比表面積約４５０〜５５０ｍ²／ｇを有する。 本明細書中で使用する「ガラス粒子」なる用語は、結晶質シリカ（例えばα石 英、ガラス質シリカ）の粒子を意味し、結晶質シリカは非晶質でないために正し くは「ガラス」でないものや、主にシリカから構成されるガラスの粒子であって もよい。ガラス粒子は一般に少なくとも７５重量％のＳｉＯ₂を含有し、通常の シリカガラスに典型的な他の成分、例えば酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化 アルミニウム、酸化ホウ素、酸化カルシウムなども含有し得る。ガラス粒子の組 成は、例えばα石英、通常のソーダ石灰ガラス又はホウケイ酸ガラス［例えばＰ ｙｒｅｘ（登録商標）］のように、本発明によりＤＮＡを分離又は単離する際に 本発明により粒子と併用する全水溶液が受ける全条件下で、粒子がこのような水 溶液中約１０^-3気圧〜数気圧で少なくとも１００℃まで固体又は固体様に維持さ れるようなものである。また、本発明のシリカ混合物中のガラス粒子は、α石英 、通常のソーダ石灰ガラス又はホウケイ酸ガラスと同様に、本発明によりＤＮＡ を分離又は単離する際に本発明により粒子と併用する水溶液が受ける全条件下で このよ うな水溶液にほとんど溶けない。この「ほとんど溶けない」という表現は、通常 のガラスと同様に、ガラス粒子から浸出する成分の量が本発明の方法の実施に影 響を与えないような少量であることを意味する。 ガラス粒子は、粉砕結晶質シリカ粉末；ガラスを粉砕することにより得られる ソーダ石灰及びホウケイ酸ガラス粉末を含むガラス粉末；及び下記のようにガラ ス繊維濾紙から得られるガラス繊維を含めてガラス繊維を粉砕することにより得 られるガラス微細繊維を含む。下記のように得られるガラス微細繊維が好適であ る。ＤＮＡ分離でカオトロピック塩溶液と併用するガラス粒子の使用及びこのよ うな粒子の寸法については、Ｂｏｏｍら， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ． ２８，４９５−５０３（１９９０）； Ｍａｒｋｏら， Ａｎａｌ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ． １２１，３８２−３８７（１９８２）；及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７６，６１５−６１ ９（１９７９）を参照されたい。 シリカゲル又はガラス粒子は、クロマトグラフィーグレード以上で市販されて いるのでそれ以上精製せずに本発明の混合物又は懸濁液中で使用できるが、低純 度の粒子のよ うに使用前に洗浄してもよい。 本発明の混合物中のシリカゲルとガラス粒子の重量比は１：１〜１００：１の 範囲であり、より好適な範囲は約５：１〜約５０：１、最適範囲はＤＮＡでは約 １０：１（約９：１〜約１１：１）であり、ＲＮＡでは約３０：１（約２５：１ 〜３５：１）である。 本発明のシリカゲルとガラス粒子の混合物は、乾燥状態又は液体に懸濁したシ リカゲルを同様に乾燥状態又は液体に懸濁したガラス粒子と単に混合することに より調製される。同様に、本発明のシリカゲル、ガラス粒子及びカオトロピック 塩の混合物も、乾燥状態、液体懸濁状態又は塩の場合には溶液の形態であり得る 成分を単に混合することにより調製される。カオトロピック塩の懸濁液又は溶液 に好適な「液体」は水又は水溶液である。 蒸留水を用いて調製する樹脂のｐＨは、グアニジニウム塩の存在により５．５ 〜６．５である。純水の代わりに緩衝液を調製物に加えることにより樹脂のｐＨ を変えることができ、例えばクエン酸塩を加えるとｐＨ４．０〜５．０、酢酸塩 を加えるとｐＨ５．５〜６．５、Ｔｒｉｓを加えるとｐＨ７．０〜９．０になる 。 シリカゲルとガラス粒子の混合物又は懸濁液がシリカゲルと特定型のガラス粒 子（例えばガラス微細繊維）「から主に構成される」という場合には、混合物中 のシリカ材料が主にシリカゲルと特定型のガラス粒子だけから構成されることを 意味する。このような混合物又は懸濁液中にはシリカ材料以外の型の材料（例え ば水、緩衝液、塩類）が存在していてもよく、シリカ材料中には微量の非必須又 は無意味な成分（例えば不純物）が存在していてもよい。 カオトロピック塩はカオトロピックイオンの塩である。このような塩は水溶液 によく溶ける。このような塩によりタンパク質又は核酸の水溶液中に十分高濃度 で提供されるカオトロピックイオンは、タンパク質を変性させ、核酸の二次構造 を失わせ、あるいは２本鎖核酸の場合には融解（即ち鎖分離）させる。カオトロ ピックイオンがこれらの効果を有するのは、液体水中に存在する水素結合の網目 を破壊し、変性タンパク質及び核酸を正しい折り畳み又は構造のものよりも熱力 学的に安定にするためであると考えられる。カオトロピックイオンはグアニジニ ウムイオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン及びトリクロロ酢酸イオンを含む 。本発明ではグアニジニウムイオンが好適である。 カオトロピック塩は塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム（場合に よりイソチオシアン酸グアニジニウムとも言う）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸 ナトリウム及びトリクロロ酢酸ナトリウムを含む。グアニジニウム塩が好適であ る。 シリカ材料と接触させるか又はこのような材料の懸濁液を調製するために本発 明で使用するカオトロピック塩水溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましく は約２Ｍ以上である。ＤＮＡを含有する水溶液と混合してＤＮＡを導入する以前 のカオトロピック塩水溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましくは約４Ｍ以 上、より好ましくは約５Ｍ以上である。更に、（ＤＮＡ又はＲＮＡの導入以前の ）カオトロピック塩水溶液の容量と本発明のＤＮＡ分離方法を実施する際にカオ トロピック塩溶液と混合するＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液の容量の比は好ましくは １以上である。ＲＮＡ分離法では約４：１（３：１〜５：１）が好ましい。 従って、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡを分離しようとするＤＮＡ又はＲＮＡ溶液 と混合する以前のカオトロピック塩水溶液中にシリカゲルとガラス粒子を含有す る本発明の懸濁液中のカオトロピック塩濃度は、カオトロピック塩が塩 酸グアニジニウムである場合には好ましくは６Ｍ〜８Ｍであり、カオトロピック 塩がチオシアン酸グアニジニウムである場合には好ましくは５Ｍ〜７Ｍである。 シリカゲル、ガラス粒子及びチオシアン酸グアニジニウム溶液を含有する組成 物には、組成物が調製後数日以内に肉眼で明らかに識別可能な黄色に変色すると いう問題があった。このような変色は商業的に許容できない。本発明に関連して 、クエン酸塩、ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡなどのキレート化剤を加えることによりこ れらの組成物の変色を回避できることが予想外にも判明した。この点では組成物 の溶液中に約５ｍＭ〜約１５ｍＭのＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを加えると好適である 。溶液にＥＤＴＡを加えるにはＥＤＴＡの２ナトリウム塩として加えると好適で ある。更に、懸濁液の調製に使用する固体（シリカ材料）をキレート化剤含有溶 液で洗浄することにより、チオシアン酸グアニジニウムを含有する本発明の懸濁 液の変色を回避できることが予想外にも判明した。 本発明を実施する際には溶液中で塩を使用するが、本発明で使用する全カオト ロピック塩に関してこのような全溶液中の塩の濃度は、本発明を実施する際にこ のような溶液 が受ける全条件下で溶液中の塩の溶解度未満に維持されることが望ましい。 本発明の組成物及び方法は、約５０塩基〜約５０〜６０キロベースの長さを有 するＤＮＡを他の成分から分離又は単離するのに特に適している。本発明の組成 物及び方法は、細胞、ウイルス等に天然に存在する実質的に任意の長さのＲＮＡ を分離又は単離するのにも適している。従って、本発明の方法は例えばベクター ＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ、λＤＮＡ）をゲノムＤＮＡから分離するため 、及び約２００塩基長以上のＰＣＲ増幅ターゲット又は被分析ＤＮＡをこれより も著しく短い（典型的には約２０〜約１００塩基長の）プライマー又はプライマ ー二量体ＤＮＡから分離するために適している。ＤＮＡは直鎖状、環状、１本鎖 、２本鎖又は部分的２本鎖など任意の形態で本発明の方法に提供され得る。 本発明の方法を定義する際に、溶液の「アリコート」という場合には溶液の容 量の全部又は一部を表し、シリカゲルとガラス粒子の混合物の「一部」という場 合には混合物の重量の一部又は全部を表す。 ＤＮＡ又はＲＮＡを分離又は単離するための本発明の方 法では、まず第１段階で分離又は単離しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを含有する 水溶液（第１の溶液）のアリコートをカオトロピック塩の水溶液（第３の溶液） と混合して第２の溶液を形成し、第１段階後又は場合によっては第１段階と同時 に、第２の溶液のアリコートをシリカゲルとガラス粒子の混合物に接触させる第 ２段階を行う。第２の溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましくは少なくと も２Ｍであり、第３の溶液中のカオトロピックイオン濃度が４Ｍ以下の場合には 第２の溶液の容量を第３の溶液の容量の２倍未満にすることが好ましい。 シリカゲルとガラス粒子の混合物は好ましくは均質である（即ちシリカゲル粒 子とガラス粒子が混合物全体に可能な限り均質に混ざり合っている）。混合物は 乾燥状態でカラムに充填又は膜に封入され、カラム又は膜に第２の溶液を通じる ことにより第２の溶液と接触し得る。例えば米国特許第５．０７５，４３０号参 照。より好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する水溶液のアリコートをカオト ロピック塩の水溶液中の本発明のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液と混合するこ とにより、本発明の方法の第１段階と第２段階を同時に実施する。 本発明の方法により分離又は単離するＤＮＡ又はＲＮＡは実質的に任意のＤＮ Ａ又はＲＮＡ源から得られる。本発明の方法を実施する前に、本発明の方法を実 施するＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液を提供するように処理を行ってもよい。従って 、ＤＮＡ又はＲＮＡは培養真核もしくは原核細胞から得てもよいし、組織、動物 及び植物を含む多細胞生物、体液（例えば血液、リンパ液、尿、糞便又は精液） 、胚又は胎児、食料品、化粧品又は任意の他の細胞源から抽出ないし取得した細 胞から得てもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは細胞に感染するオルガネラ、ウイルス、 ファージ、プラスミド、ウイロイドなどのＤＮＡ又はＲＮＡでもよい。細胞を溶 解させ、通常は当業者に周知の種々の方法で溶解物を処理してＤＮＡ又はＲＮＡ の水溶液を得、これに本発明の分離又は単離方法を適用する。このような溶液中 のＤＮＡ又はＲＮＡは典型的にはタンパク質、ＲＮＡ（ＤＮＡ分離の場合）、Ｄ ＮＡ（ＲＮＡ分離の場合）、又は他の型の成分などの他の成分と併存している。 本発明の方法により処理可能なＤＮＡの別の例は、溶液を用いてＰＣＲなどの 増幅法を実施した後の溶液中のＤＮＡであり、通常はこのような溶液を本発明の 方法で直接使 用する。 本発明の方法により処理するＤＮＡの別の例は、アガロース又はポリアクリル アミドゲルなどのサイズ分画ゲルから得られるＤＮＡである。本発明の方法を適 用するＤＮＡの水溶液を調製する際には、ＤＮＡをゲルのスライスから溶液中に 溶離させるか又は溶液中でゲルもしくはそのスライスを融解もしくは他の方法で 分解させるなどの方法によりＤＮＡをゲルマトリックスから分離する。 本発明の方法では、最初の２段階を実施したことにより、ＤＮＡ又はＲＮＡが シリカ材料に結合することにより分離される。分離したＤＮＡ又はＲＮＡを分子 生物学的手順でそれ以上精製する必要なしに使用できるように単離するためには 、後続段階が必要である。 そこで第３段階として、少なくとも一部（典型的には全部）のシリカ材料（Ｄ ＮＡ又はＲＮＡが結合している）から、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離するシリカ材料 と混合した第２の溶液のアリコートの実質的に全部を、シリカ材料の前記一部と 結合しなかったものを除き、分離する。第２の溶液／シリカ材料の組み合わせを （実施例に記載するように）カラム内又は膜間（米国特許第５，０７５，４３０ 号参照） に維持する場合には、カラム内のシリカ材料／第２の溶液の組み合わせの最上部 に第４の溶液を積層し、室温で真空を使用してシリカ材料から第２の溶液及び第 ４の溶液の液体を吸引することにより、第２の溶液の前記アリコートの実質的に 全部を分離する前記第３段階を下記第４段階と部分的に同時に実施することがで きる。あるいは、第４段階を開始する前に第２の溶液の液体をシリカ材料から吸 引してもよい。更に別の方法では、第２の溶液／シリカ材料の組み合わせを遠心 し、上清をペレットから十分に除去した後にペレットを用いて第４段階を開始し てもよい。シリカ材料から第２の溶液の液体を分離するには液体を蒸発乾涸する 。当業者に理解されるように、結合していない第２の溶液の成分からシリカ材料 を分離するこの工程は、シリカ材料に強く結合していないカオトロピック塩、タ ンパク質及び他の汚染物質の大部分を除去する。 他方、シリカ材料にある程度強く結合している汚染物質や他の物質を十分に除 去するためには、本発明の単離方法で第４段階を実施する。この段階は、対象Ｄ ＮＡ又はＲＮＡと結合しており且つ第２の溶液の未結合成分の実質的に全部を除 去したシリカ材料の一部（典型的には全部）を第 ４の水溶液で洗浄することからなる。この第４の水溶液は、この第４の水溶液で 洗浄したシリカ材料の前記一部からカオトロピックイオンの実質的に全部を除去 するのに有効であり且つ短いオリゴヌクオチド（約２００ヌクレオチド未満であ るが、本発明の方法では約４０ｂｐ程度のＤＮＡ又はＲＮＡも低収率で分離する ことができる）以外のＤＮＡ又はＲＮＡを除去するのには実質的に無効な容量及 び組成を有する。典型的には、第４の溶液は第２の溶液の液体の除去後に残って いるカオトロピック塩を除去するのに有効である以外に、この除去後に残ってい るタンパク質及び短いオリゴヌクレオチドを除去するのにも有効である。当業者 に自明の通り、この溶液はＤＮＡ又はＲＮＡをシリカ材料からさほど溶離させな い。本発明の方法のこの洗浄段階に適した多くの洗浄溶液が当業者に公知である 。典型的にはこれらの溶液は、アルキル部分中に１〜４、好ましくは２又は３個 の炭素を有するアルカノール約２０容量％〜約９５容量％の水溶液である。溶液 は例えば０．０５Ｍ〜０．２０Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨをほぼ中性に維持するための 低濃度緩衝液（例えば５ｍＭ〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）；及び低濃度キレ ート化剤（１ｍＭ〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｅ ＧＴＡ、ＣＤＴＡ等）など他の成分も含み得る。 第４段階では任意の標準洗浄手順を使用することができる。上述のように、第 ４段階は少なくとも部分的に第３段階と同時に実施することができる。実施例に 示すように、第４の溶液をシリカ材料から真空吸引する場合には、第４の溶液を 蒸発乾涸せずに、残留している第４の溶液を含むシリカ材料を遠心し、残留して いる第４の溶液をシリカ材料から除去すると好適である。シリカ材料をクロマト グラフィーカラムに充填する場合には、適切な容量の第４の溶液をカラム内の材 料に通じてカオトロピック塩及び他の対象汚染物質を実質的に完全に除去する。 カオトロピック塩及び他の対象汚染物質を実質的に完全に除去するために必要な 回数だけ反復し得る別の手順では、シリカ材料を第４の溶液に懸濁した後、遠心 によりペレット化してペレットから上清を除去することにより溶液から除去する 。第５段階前に、第４の溶液を蒸発乾涸せずに例えば実施例に示すように遠心に より第４の溶液の実質的に全部をシリカ材料から分離すると好適である。 ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法の第５段階では、分離したＤ ＮＡ又はＲＮＡと結合しており且つ 上記のように第４の溶液で洗浄した後のシリカ材料の一部を水又は第５の溶液で 洗浄してＤＮＡ又はＲＮＡを材料から溶離させる。次に、単離したＤＮＡ又はＲ ＮＡを水又は第５の水溶液に溶解する。洗浄は、遠心、加圧又は真空吸引により ＤＮＡ又はＲＮＡと結合したシリカ材料を保持するカラムに第５の溶液を通じる など当業者に周知の種々の方法の任意のものにより実施することができる。第５ の溶液は「低塩」（即ち下記実施例に記載するＴＥ緩衝液の約２倍未満の低イオ ン強度を有する）であり、好ましくはｐＨ約６．５〜８．５、より好ましくは７ ．０〜８．０に緩衝する。ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法で使 用するのに特に好適な第５の水溶液は当業者に周知のＴＥ緩衝液である。 実施例に示すように、ＴＥ緩衝液を使用して本発明の方法により単離したＤＮ Ａ又はＲＮＡは使用まで緩衝液中で保存することができる。 本発明の方法の記載に関連して使用する「実質的に全部」、「実質的に完全」 、「実質的に無効」などの表記は必然的に機能的に定義され、第５段階で溶離後 に実施しようとする対象分子生物学的手順に適切な分離ＤＮＡ又はＲＮＡ を得るために十分であることを意味する。当業者は、本発明の方法によりこのよ うな分離ＤＮＡを得るために洗浄溶液の容量と組成及び洗浄手順に関する要件を 容易に決定することができる。 上述のように、シリカゲルとガラス粒子を含むシリカゲル材料混合物を使用す る本発明のＤＮＡ及びＲＮＡ分離及び単離方法は、予想外にも従来技術の方法よ りもそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡを有効に回収することができる。 ＤＮＡ又はＲＮＡをそれぞれ単離するための本発明の方法により提供される溶 離ＤＮＡ又はＲＮＡは、それ以上精製せずに分子生物学的手順により分析又は更 に処理するのに適している。溶離核酸は例えば配列決定、制限分析又は核酸プロ ーブハイブリダイゼーションにより分析することができる。従って、本発明の方 法はＤＮＡ又はＲＮＡの分析に基づく方法、特に病気の診断；病原体の同定；食 品、化粧品、血液もしくは血液製品又は他の製品の病原体汚染試験；法廷試験； 実父確定試験；及び胎児又は胚の性別鑑定方法の一部として適用することができ る。 本発明の方法により提供される溶離ＤＮＡ又はＲＮＡは、それぞれＤＮＡ又は ＲＮＡとの反応を触媒する種々のエキ ソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの任意のものにより処理することができ 、ＤＮＡの場合にはＤＮＡ中に存在する制限部位で切断する制限酵素で消化する ことができる。溶離ＤＮＡからの制限フラグメントをベクターに連結し、クロー ニング又は発現に適した宿主に形質転換することができる。溶離ＤＮＡ又はＲＮ Ａのセグメントはターゲット核酸セグメントを増幅するために当業者に公知の種 々の方法の任意のものにより増幅することができる。溶離ＤＮＡがプラスミド又 は別の型の自律複製ＤＮＡである場合には、形質転換宿主中で発現することが可 能なＤＮＡ上の遺伝子のクローニング又は発現に適した宿主に形質転換すること ができる。本発明の方法により単離したプラスミドＤＮＡは、従来技術の方法（ 珪藻土が本発明の適用方法のシリカゲルの代わりに使用される）により単離した ものよりも有効に真核細胞にトランスフェクトできることが判明した。 以下、非限定的な実施例により本発明の種々の態様を教示する。実施例とその 他の明細書及び請求の範囲に記載する容量及びモル濃度は特に指定しない限り室 温値である。 実施例１ 塩酸グアニジニウムを用いた懸濁液の調製 超純粋グアニジン−ＨＣｌ（米国、オハイオ州、クリーブランドに所在のＡｍ ｒｅｓｃｏ製Ａｍｒｅｓｃｏ Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ）２０ｋｇを脱イオン蒸留水 ３０Ｌに溶解することにより７Ｍグアニジン−ＨＣｌ（即ち塩酸グアニジニウム ）溶液を調製した。 次に樹脂用ガラス粒子（即ち本実施例ではガラス微細繊維）を次のように作成 した。１２．５ｃｍのガラス繊維濾紙（多数の実験室科学装置販売業者を通して Ｗｈａｔｍａｎから広く販売されているＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａ，Ｃａｔａｌ ｏｇ Ｎｏ．１８２０−１２５）６３枚（総重量約４１．７ｇ）を４分の１に切 断した。次に中〜高速ポリトロンで分散しながら濾紙を５Ｍ ＮａＣｌ ６Ｌに 漸次加えた。濾紙の全部を加えた後、残留している紙が見えなくなるまで均質ス ラッジ状に均質化し、この均質化を約５分間続けた。次にスラッジをブフナー漏 斗で集め、脱イオン蒸留水約２４Ｌで洗浄した。 本実施例ではＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａ濾紙を特定しているが、Ｗｈａｔｍａ ｎ ＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ及びＧＦ／Ｆ濾紙、並びに本明細書に記載するガラス微 細繊維作成過程により除去可能な結合剤を含有する任意のガラス繊維濾 紙も同様に適切である。 次に懸濁液（本明細書では「樹脂」又は「スラリー」とも呼ぶ）を次のように 調製した。洗浄したガラス微細繊維スラッジ４１．７ｇとシリカゲル６０−１０ （米国、メリーランド州、ボルチモアに所在のＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ， Ｄａｖｉ ｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製、細孔径６０Å、粒度９〜１１ μｍ）４５０ｇを７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液３０Ｌに加えた。 シリカゲル６０−１０が好ましいが、細孔径６０Å、粒度３０μｍ〜１０５μ ｍのシリカゲル、細孔径１００Å、粒度３０μｍ〜１０５μｍのシリカゲル、細 孔径２５０Å、粒度３０μｍ〜５０μｍのシリカゲル、細孔径１００Å、粒度７ ０μｍ〜２００μｍのシリカゲルグレード２２、細孔径６０Å、粒度７０μｍ〜 ２００μｍのシリカゲルグレード６２も許容できる。 均質懸濁液が得られるまで混合物を撹拌した。この懸濁液が本発明の懸濁液で ある。 均質懸濁液のｐＨは５．５であり、脱イオン蒸留水１０ｍｌに樹脂１０μｌを 混合することにより得られた懸濁液の導電率は１１５０μｍｈｏであった。 本実施例の懸濁液を調製するために使用したシリカゲル：ガラス繊維濾紙の重 量比は約１０：１であり、５：１〜２０：１の範囲の比が許容できる。 シリカゲルの量を塩酸グアニジニウム溶液１Ｌ当たり１ｇからグアニジニウム 塩溶液１Ｌ当たり２０ｇまで変化させた以外は本実施例に記載したと同様に各々 調製した種々の懸濁液で実施した一連の実験によると、ＤＮＡをその水溶液から 回収するのに最も有効な懸濁液は本実施例に記載した塩酸グアニジニウム溶液１ Ｌ当たり１５ｇの濃度の懸濁液であることが判明した。 撹拌後、放置すると材料は非常に迅速に懸濁液から沈殿した。沈殿した材料を 上清と十分に撹拌又は混合することにより、使用直前に均質懸濁液（樹脂）を再 構成しなければならない。 実施例２ チオシアン酸グアニジニウムを用いた樹脂の調製 ７Ｍグアニジン−ＨＣｌの代わりにチオシアン酸グアニジニウム（米国、オハ イオ州、クリーブランドに所在のＡｍｒｅｓｃｏ製結晶Ａｍｒｅｓｃｏ Ｕｌｔ ｒｏｐｕｒｅ）の６Ｍ溶液を使用した以外は実施例１の手順に従って本実 施例の標記樹脂を調製した。ＥＤＴＡ（米国、ミズーリ州、セントルイスに所在 のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製ＥＤＴＡ２ナトリウム塩） を最終濃度１０ｍＭまで加えることによりチオシアン酸グアニジニウムが変色し ないように安定化した。 チオシアン酸グアニジニウムは高融点及び低融点のどちらのアガロース組成物 も有効に溶解するので、核酸フラグメントをアガロース及び他のゲルから単離す るために本発明を使用する場合にはチオシアン酸グアニジニウムを使用するのが 好適である。 実施例３ プラスミド精製プロトコル 本実施例は、大腸菌培養物１〜３ｍｌから出発して実施例１の樹脂を使用する 標準プラスミド単離手順について記載する。 Ａ．緩衝液組成 １．細胞再懸濁溶液： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １０ｍＭ ＥＤＴＡ １００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ（リボヌクレアーゼ Ａ）（ＤＮアーゼ非含有） ２．カラム洗浄溶液： （ａ）２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＥＤ ＴＡ，ｐＨ７．５ （ｂ）（ａ）１：１．４を９５％ＥｔＯＨ（エタノール）で希釈 ３．ＴＥ緩衝液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １ｍＭ ＥＤＴＡ ４．中和用溶液： １．３２Ｍ ＫＯＡｃ（酢酸カリウム），ｐＨ４．８ ５．細胞溶解溶液： ０．２Ｍ ＮａＯＨ １％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） Ｂ．清澄溶解物の生成 １．細胞１〜３ｍｌをマイクロ遠心機で１〜２分間最高速度で遠心することに よりペレット化する。細胞ペレットを細胞再懸濁溶液２００μｌに再懸濁する。 再懸濁細胞をマイクロ遠心管に移す。 ２．細胞溶解溶液２００μｌを加え、管を数回反転する ことにより混合する。細胞懸濁液はほとんどすぐに清澄になる。すぐに清澄にな らない場合には清澄になるまで反転を続ける。 ３．中和用溶液２００μｌを加え、管を数回反転することにより混合する。 ４．マイクロ遠心機を最高速度で５分間回転させる。 ５．清澄上清を新しいマイクロ遠心管にデカントする。清澄上清はＤＮＡを含 有する水溶液であり、この水溶液から本発明の方法によりＤＮＡを分離又は単離 することができる。 真空マニホールドを使用できる場合には、下記Ｃを実施する。真空マニホール ドを使用できない場合には、下記Ｄを実施する。 Ｃ．真空マニホールドを使用するプラスミド精製 １．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．５からの上清に加え、管を反転すること により混合する。アリコートを取り出す前に実施例１の樹脂を十分に混合する。 必要であれば樹脂を２５〜３７℃まで（１０分以下）昇温させ、結晶を溶解させ る。３０℃を越える温度では樹脂を使用しない。シリカゲル樹脂が多少沈降する が、シリカゲルの粒度が微 細であるため、粒子はシリカゲルでなく珪藻土から作成した樹脂より長時間溶液 に懸濁し続ける。 ２．各プラスミドミニプレップ毎に１本のＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐミニカラムを使用する。もっと大きい調製物にはＷｉｚａｒｄ（登録商 標）Ｍｉｄｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍａｘｉｐｒｅｐ又はＷｉｚ ａｒｄ（登録商標）Ｍｅｇａｐｒｅｐカラムを使用できる。Ｗｉｚａｒｄ（登録 商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｄｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚ ａｒｄ（登録商標）Ｍａｘｉｐｒｅｐ又はＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｅｇａｐ ｒｅｐカラムは米国、ウィスコンシン州、マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されており、クロマトグラフィー樹脂を充填せずに供給され 、核酸を含有する水溶液から核酸を回収するのに好都合に使用できるように設計 されたクロマトグラフィーカラムである。当業者は、核酸を分離又は単離するた めの本発明の方法で使用するのに同様に適切な類似のカラムをＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．以外からも容易に入手できることを理解されよう。本実施例に記載す る手順ではＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐミニカラムを使用してい る が、当業者は大型のカラムで使用する場合の手順の改変方法を容易に理解されよ う。３ｍｌ容使い捨て注射器からプランジャーを取り外しておく。３ｍｌ容使い 捨てルアーロック注射器筒を各ミニカラムのルアーロック伸長部に装着し、ミニ カラム／注射器筒アセンブリの先端を真空マニホールド（例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ａ７２３１のＶａｃ−Ｍａｎ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ）に挿入する。 ３．樹脂／ＤＮＡ混合物を注射器筒にピペットで移し、真空を加えることによ り樹脂（スラリー）をミニカラムに吸引する。樹脂／ＤＮＡ混合物がカラムに入 ったら真空を遮断する。 ４．カラム洗浄溶液２ｍｌを注射器筒に加えることによりミニカラムを真空下 に洗浄した後、再び真空を加えて溶液をミニカラムから吸引する。 ５．真空を更に０．５〜２分間持続することにより樹脂を乾燥する。本発明の 方法に関して、段階Ｃ．４及びＣ．５はシリカ材料の混合物からカオトロピック イオン（及びヌクレオチド又は短いオリゴヌクレオチドなどの他の低分子量物質 ）の「実質的に全部」を分離すると同時に、前記 シリカ材料からタンパク質を実質的に完全に溶離させる第４の（例えばアルカノ ールの）水溶液で前記シリカ材料混合物を洗浄する方法である。 ６．注射器筒を取り外し、ミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移す。 ミニカラムをマイクロ遠心機で２分間最高速度で回転させ、残留カラム洗浄溶液 を除去する。 ７．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。ミニカラムに水又はＴＥ緩衝 液５０μｌを加えて１分間待機する。大きいプラスミド（１０ｋｂ以上）の場合 には予熱（６５〜７０℃）した水又はＴＥ緩衝液を使用すると収率を高めること ができる。２０ｋｂ以上のプラスミドでは８０℃の水又はＴＥ緩衝液を使用する 。 ８．ＤＮＡを溶離させるためにマイクロ遠心管に入れたミニカラムを０．５〜 １．０分間最高速度で回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。プラスミ ドＤＮＡはマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中で４℃又は−２０℃で保存す ることができる。各回の単離毎のプラスミドＤＮＡの収量は１０μｇに及ぶ。収 量に影響する因子［即ち使用する細菌培養物の容量（１〜３ｍｌ）、プラスミド のコピー数及び使用する細菌種］を一定に保つと、プラスミド ＤＮＡの収量は非常に安定する。細菌培養物１．５ｍｌを各々使用する連続試験 の結果、４．１μｇ±０．４μｇという予想外に安定したプラスミドＤＮＡ収量 が得られた。シリカゲルの代わりに珪藻土を使用すると、収量の変動幅が広くな り、細菌培養物１．５ｍｌから得られるプラスミドＤＮＡの収量は５．４μｇ± １．５μｇであった。得られたプラスミドＤＮＡは、分析（例えば制限分析、配 列決定）又は他の分子生物学的手順（例えば形質転換、特定制限フラグメントの 取得）に適した状態である。 Ｄ．（真空を用いずに）使い捨て注射器を使用するプラスミド精製 １．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．５からの上清に加え、管を反転すること により混合する。アリコートを取り出す前に実施例１の樹脂を十分に混合する。 必要であれば樹脂を２５〜３７℃まで（１０分以下）昇温させ、結晶を溶解させ る。３０℃を越える温度では樹脂を使用しない。 ２．各ミニプレップ毎に１本のミニカラム（上記Ｃ参照）を使用する。３ｍｌ 容使い捨て注射器からプランジャーを取り外しておく。使い捨て注射器筒をミニ カラムのルアーロック伸長部に装着する。 ３．樹脂／ＤＮＡ混合物を注射器筒にピペットで移す。注射器プランジャーを 挿入し、注射器プランジャーでスラリーをミニカラムに静かに押し込む。 ４．注射器をミニカラムから取り外し、プランジャーを注射器から取り外す。 注射器筒をミニカラムに再装着する。カラム洗浄溶液２ｍｌをピペットで注射器 に移す。注射器プランジャーを注射器に挿入し、注射器プランジャーを用いてカ ラム洗浄溶液をミニカラムに静かに押し込む。 ５．注射器を取り外してミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、マ イクロ遠心機に入れる。ミニカラムをマイクロ遠心機で最高速度で２分間回転さ せ、樹脂を乾燥する。 ６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。 ７．プラスミドＤＮＡを溶離させるために、ミニカラムに水又はＴＥ緩衝液５ ０μｌを加え、１分間待機する。もっと大きいプラスミド（１０ｋｂ以上）の場 合には予熱（６５〜７０℃）した水又はＴＥ緩衝液を使用すると収率を高めるこ とができる。２０ｋｂ以上のプラスミドでは８０℃の水又はＴＥ緩衝液を使用す る。 ８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管をマイクロ遠心 機で０．５〜１．０分間回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。プラス ミドＤＮＡは遠心管内で４℃又は−２０℃で保存することができる。各回の単離 毎のプラスミドＤＮＡの収量は１０μｇに及ぶ。収量に影響する因子［即ち使用 する細菌培養物の容量（１〜３ｍｌ）、プラスミドのコピー数及び使用する細菌 種］を一定に保つと、プラスミドＤＮＡの収量は非常に安定する。得られたプラ スミドＤＮＡは分析（例えば制限分析、配列決定）又は別の分子生物学的手順（ 例えば形質転換、特定制限フラグメントの取得）に適した状態にある。 カオトロピック塩として過塩素酸ナトリウムを使用することが米国特許第５， ０７５，４３０号に教示され、塩の水溶液と共に珪藻土を単独使用する市販のＤ ＮＡ精製用キットではこの塩を用しているが、本実施例に記載する方法でカオト ロピック塩として塩酸グアニジニウムの代わりに過塩素酸ナトリウムを使用する のは望ましくないことが判明した。理由は不明であるが、過塩素酸ナトリウム含 有懸濁液を細菌溶解物からのＤＮＡを含有する溶液と混合すると沈殿が形成され る。この沈殿の形成により、シリカ材料に結合可能なＤＮＡの量が著しく減少し 、本実施例に記載す る手順では、ＤＮＡ溶液とカオトロピック塩溶液中のシリカ材料の懸濁液の組み 合わせをミニカラムに充填すると、ミニカラムが目詰まりを起こす。有利且つ予 想外なことに、カオトロピック塩として塩酸グアニジニウムを使用すると沈殿は 形成されない。 実施例４ 低ゲル化／融解温度アガロースゲルからのＤＮＡフラグメント単離 本実施例は、実施例２の樹脂（懸濁液）を使用する標準ＤＮＡフラグメント精 製プロトコルについて記載する。 Ａ．緩衝液の組成 カラム洗浄溶液： 水中８０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール ＴＥ緩衝液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １ｍＭ ＥＤＴＡ Ｂ．低融点／ゲル化点アガロース電気泳動 １．標準プロトコルを使用して低融点／ゲル化点アガロースゲル中でＤＮＡサ ンプルを電気泳動及び染色する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照。 ２．清潔な滅菌した剃刀の刃又は解剖刀を使用して所望のＤＮＡフラグメント を切り出す。フラグメントのＵＶ光照射を最小限にするように迅速に、中波長又 は長波長ＵＶ光でフラグメントを可視化する。フラグメントはアガロース≦３０ ０ｍｇ（約３００μｌ）中で単離すべきである。 ３．アガローススライスを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、アガロースが 完全に融解するまで約２分間サンプルを７０℃でインキュベートする。本発明の ＤＮＡ分離／単離方法に関して、ＤＮＡを含有する融解ゲルスライスは、本発明 の方法を適用できるＤＮＡを含有する水溶液の１例である。 Ｃ．真空マニホールドを使用するフラグメント精製 １．実施例２の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．３からの融解アガローススライスに加え 、２０秒間渦形成することにより混合する。 ２．各ゲルスライス毎に１本のミニカラム（実施例３参 照）を使用する。３ｍｌ容使い捨てルアーロック注射器からプランジャーを取り 外し、注射器筒を各ミニカラムのルアーロック伸長部に装着し、カラムアセンブ リの先端を真空マニホールドに挿入する。 ３．結合したＤＮＡを含有する樹脂を注射器筒にピペットで移し、真空を加え ることにより樹脂をミニカラムに吸引する。 ４．カラム洗浄溶液２ｍｌを注射器筒に加えることによりミニカラムを真空下 に洗浄する。 ５．真空を更に０．５〜２分間持続することによりミニカラムを乾燥する。 ６．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管に移す。 ７．ミニカラムを２分間回転させ、残留カラム洗浄溶液を除去する。 ８．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。 ９．結合したＤＮＡを溶離させるために、水又はＴＥ緩衝液５０μｌをミニカ ラムに加え、１分間待機する。ＤＮＡは３０分間までミニカラム上で無傷に維持 される。 １０．マイクロ遠心管でミニカラムを０．５〜１．０分 間１２，０００×ｇで回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。単離した ＤＮＡは、分析又は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水 又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃で保存することができる。 Ｄ．真空を用いずに使い捨て注射器を使用するフラグメント精製 １．実施例２の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．３からの融解アガローススライスに加え 、２０秒間渦形成する。 ２．各ゲルスライス毎に１本のミニカラム（実施例３参照）を使用する。３ｍ ｌ容使い捨てル注射器からプランジャーを取り外しておく。注射器筒を各ミニカ ラムのルアーロック伸長部に装着する。 ３．結合したＤＮＡを含有する樹脂をピペットで注射器筒に移す。注射器プラ ンジャーを挿入し、注射器プランジャーでスラリーをミニカラムに静かに押し込 む。 ４．ミニカラムを注射器から取り外し、溶液を注射器に入れ、注射器をミニカ ラムに再装着してカラム洗浄溶液を注射器プランジャーでミニカラムに静かに押 し込むことにより、ミニカラムをカラム洗浄溶液２ｍｌで洗浄する。 ５．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管 に移す。ミニカラムを１２，０００×ｇで２分間回転させ、樹脂を乾燥する。 ６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。 ７．結合したＤＮＡを溶離させるために、水又はＴＥ緩衝液５０μｌをカラム に加え、１分間待機する。 ８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管を０．５〜１．０分間１２，０００× ｇで回転させる。ミニカラムを取り外して廃棄する。単離したＤＮＡは、分析又 は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中 ４℃又は−２０℃で保存することができる。 実施例５ Ｍ１３ファージからの１本鎖ＤＮＡの単離 本実施例は、Ｍ１３ファージに感染した大腸菌の培養物１ｍｌから出発して実 施例１の樹脂を使用する１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の精製用プロトコルについ て記載する。 Ａ．緩衝液の組成 １．カラム洗浄溶液： ａ）２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴ Ａ，ｐＨ７．５。 ｂ）（ａ）を９５％エタノールで１：１．４に希釈。 Ｂ．Ｍ１３ファージに感染した大腸菌培養物からの上清 １．感染培養物１．５ｍｌをマイクロ遠心管に移し、５分間回転させる。 ２．清澄化上清１ｍｌをピペットで新しい管に移す。 Ｃ．真空マニホールドを使用するＤＮＡ精製 １．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．２からの上清に加え、反転により混合す る。 ２．各サンプル毎に１本のミニカラムを使用する。３ｍｌ容使い捨て注射器筒 を各ミニカラムのルアーロック伸長部に装着し、カラムアセンブリの先端を真空 マニホールドに挿入する。 ３．結合したＤＮＡを含有する樹脂をピペットで注射器筒に移し、真空を加え ることによりスラリーをミニカラムに吸引する。樹脂ベッドのみを残して完全な スラリー容量がカラムに吸引された後に真空源を遮断する。 ４．カラム洗浄溶液２ｍｌを注射器筒に加えることによりミニカラムを真空下 に洗浄する。 ５．真空を更に０．５〜２分間持続することにより樹脂を乾燥する。 ６．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管 に移す。ミニカラムをマイクロ遠心機で最高速度で２分間遠心し、残留カラム洗 浄溶液を除去する。 ７．ＤＮＡを溶離させるために、ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。 ８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加える。 ８．ミニカラムをマイクロ遠心機で０．５〜１．０分間回転させる。ミニカラ ムを取り出して廃棄する。こうして得られたＤＮＡは、分析又は他の分子生物学 的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃ で保存することができる。 Ｄ．（真空を用いずに）使い捨て注射器を使用するＤＮＡ精製 １．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．２からの上清に加え、反転により混合す る。 ２．各サンプル毎に１本のミニカラムを使用する。３ｍｌ容使い捨て注射器筒 を各ミニカラムのルアーロック伸長部に装着する。 ３．結合したＤＮＡを含有する樹脂をピペットで注射器筒に移す。注射器プラ ンジャーを挿入し、注射器プランジャーでスラリーをミニカラムに静かに押し込 む。 ４．ミニカラムを注射器から取り外して溶液を注射器に入れることにより、ミ ニカラムをカラム洗浄溶液２ｍｌで洗浄する。注射器をミニカラムカラムに再装 着して、カラム洗浄溶液を注射器プランジャーでミニカラムに静かに押し込む。 ５．ミニカラムをマイクロ遠心管に移し、マイクロ遠心機に入れる。ミニカラ ムを２分間回転させて樹脂を乾燥する。 ６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。 ７．ＤＮＡを溶離させるために、８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μ ｌをミニカラムに加える。 ８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管を遠心機で０．５〜１．０分間回転さ せる。ミニカラムを取り出して廃棄する。こうして得られたＤＮＡは、分析又は 他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４ ℃又は−２０℃で保存することができる。 実施例６ λＤＮＡの単離 標準手順により得たファージ溶解物から得たλファージのペレットを標準ファ ージ緩衝液（例えば１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ，４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄）０ ．５ｍｌに再懸濁する。次に再懸濁したファージを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管 に移し、１２，０００×ｇで１０秒間遠心して不溶性粒子を除去する。ペレット を撹乱しないように注意しながら上清を吸引し、新しい１．５ｍｌ容マイクロ遠 心管に移す。上清は、本発明の分離及び単離方法を適用するＤＮＡ（この場合は パッケージλＤＮＡ）の水溶液である。実施例１の懸濁液１ｍｌを加え、管を反 転することにより混合する。 真空マニホールドを使用する場合には、実施例５の段階Ｃ．２に従う。次にフ ァージ懸濁液をピペットで注射器筒に移し、真空を加えて懸濁液をミニカラムに 吸引する。８０％イソプロパノール（カラム洗浄溶液）２ｍｌを注射器筒に加え 、真空を加えてこの溶液をミニカラムに吸引する。更に０．５〜２分間真空に引 き続けることにより懸濁液を乾燥する。注射器筒を取り外し、ミニカラムを１． ５ｍｌ容遠心管に移す。ミニカラムを１２，０００×ｇで２分間遠心し、残留イ ソプロパノール溶液を除去する。ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。８ ０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加え、その直後に１２，０００ ×ｇで０．５〜１．０分間ミニカラムを遠心し、精製λＤＮＡを溶離する。ミニ カラムを取り出して廃棄する。精製λＤＮＡはマイクロ遠心管内で４℃又は−２ ０℃で保存することができる。 真空マニホールドを使用しない場合には、注射器プランジャーを使用してファ ージ懸濁液をゆっくり且つ静かにミニカラムに押し込んだ後、注射器をミニカラ ムから取り外し、プランジャーを取り外して注射器をミニカラムに再装着し、８ ０％イソプロパノール２０ｍｌをピペットで注射器に移し、プランジャーを再挿 入し、イソプロパノール溶液をカラムに静かに押し込む以外は前項と同様に操作 する。次にミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、１２，０００×ｇ で２分間遠心してイソプロパノール溶液を樹脂から除去する。カラムを新しいマ イクロ遠心管に移す。８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加え、そ の直後にミニカラムを０．５〜１．０分間１２，０００×ｇで遠心し、精製λＤ ＮＡを溶離させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。λＤＮＡはマイクロ遠心 管内で４℃又は−２０℃で保存することができる。 実施例７ ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの精製 ５００ｂｐ ＰＣＲ産物５０ｎｇ〜１５μｇを実施例１又は実施例２の懸濁液 １ｍｌに加えると、９５％を越える回収率が得られる。 低ゲル化／融解温度アガロースゲルバンドスライスからの精製を使用した回収 率（５００ｂｐ産物で７０〜９０％）は直接精製を使用した回収率（９５％まで ）よりも低い。非特異的増幅産物の存在が望ましくない場合にはアガロース法が 推奨される。 ７Ｍユリアポリアクリルアミドゲルのスライスからは並の回収率が得られる。 ３７℃で少なくとも３０分間にわたるゲルからＴＥ緩衝液へＤＮＡの受動的溶離 を使用することができる。本発明の方法を適用するＤＮＡ溶液としてＴＥ溶液中 のＤＮＡを使用することができる。 直接精製では、ＰＣＲ反応からの水（下層）相を清潔なマイクロ遠心管に移す 。サンプル中の鉱油が多すぎると、ＰＣＲ産物精製の収率が低下する恐れがある 。５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８），１ ．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液のアリコート １００μｌを１２ｍｍ×７ ５ｍｍポリプロピレン管又は１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に加える。ＰＣＲ反応 混合物３０〜３００μｌを加える。短時間渦形成して混合する。実施例１又は実 施例２の懸濁液１ｍｌを加え、１分間に３回短時間渦形成する。次に実施例６又 はこのような手順に関する他の実施例に記載するように、真空マニホールド手順 又はマニホールドを使用しない手順を実施する。 実施例８ ＲＮＡ精製 ＲＮＡは実施例１の樹脂の代わりに下記樹脂を使用して実施例３の手順に従う ことにより精製することができる。 超純粋グアニジン−ＨＣｌ（米国、オハイオ州、クリーブランドに所在のＡｍ ｒｅｓｃｏ製Ａｍｒｅｓｃｏ Ｕｌｔｒｏｐｕｒｅ）２０ｋｇを脱イオン蒸留水 ３０Ｌに溶解することにより７Ｍグアニジン−ＨＣｌ（即ち塩酸グアニジニウム ）溶液を調製した。 次に下記のように樹脂用ガラス粒子（即ち本実施例ではガラス微細繊維）を作 成した。１２．５ｃｍのガラス繊維濾紙（多数の実験室科学装置販売業者を通し てＷｈａｔｍａｎから広く販売されているＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａ， Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１８２０−１２５）６３枚（総重量約４１．７ｇ）を４ 分の１に切断した。次に中〜高速ポリトロンで分散しながら濾紙を５Ｍ ＮａＣ ｌ ６Ｌに漸次加えた。濾紙の全部を加えた後に、残っている紙が見えなくなる まで均質スラッジに均質化し、この均質化を約５分間続けた。次にスラッジをブ フナー漏斗で集め、脱イオン蒸留水２４Ｌで洗浄した。 本実施例ではＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａ濾紙を特定しているが、Ｗｈａｔｍａ ｎ ＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ及びＧＦ／Ｆ濾紙、並びに本明細書中に記載するガラス 微細繊維作成工程により除去可能な結合剤を含有する任意のガラス繊維濾紙も同 様に適切である。 次に懸濁液（本明細書中では「樹脂」又は「スラリー」とも言う）を以下のよ うに調製した。洗浄したガラス微細繊維スラッジ４０ｇとシリカゲル６０−１０ （米国、メリーランド州、ボルチモアに所在のＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ， Ｄａｖｉ ｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製、細孔径６０Å、粒度９〜１１ μｍ）９００ｇを７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液３０Ｌに加えた。この溶液にクエ ン酸塩（４００ｍＭ，ｐＨ４．０）（米国、ミズーリ州、セント ルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙの分子生物学グ レードクエン酸）１７６４．６ｇを加えた。 あるいは、（２００ｍＭクエン酸緩衝液を使用して）７Ｍ塩酸グアニジン，ｐ Ｈ４．０中で０．１４％（ｗ／ｖ）Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａガラス微細繊維ス ラッジ、４％（ｗ／ｖ）シリカゲル６０−１０からＲＮＡ単離用樹脂を調製した 。 これらの樹脂のいずれか一方１ｍｌを実施例３の手順に従って使用し、ＲＮＡ を単離した。 実施例９ 組織からのＲＮＡ精製 本実施例は、実施例８の樹脂を使用する動物組織からのＲＮＡ単離手順につい て記載する。 Ａ．精製用調製物 １．５０ｍｌ容厚壁ポリプロピレン遠心管を０．０５％ピロ炭酸ジエチル（Ｄ ＥＰＣ）中に室温で１時間置いた後、管を３０分間オートクレーブに入れ、残留 ＤＥＰＣを分解させた。 ２．フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール （２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）溶液１００ｍｌを室温で１５分間放置し、相を分 離させた。 ３．変性用溶液を次のように調製した。チオシアン酸グアニジン（最終濃度４ Ｍ）２５ｇをＣＳＢ緩衝液［脱イオン水中４２ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２ ｍＭβメルカプトエタノール及び０．８３％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン ］３３ｍｌに加え、成分が完全に溶解するまで十分に混合した。変性用溶液を６ ５℃水浴中で加熱し、４℃で保存した。 Ｂ．組織破壊 最適性能を得るために、サンプルを得た直後にＲＮＡを単離した。他方、サン プルを得た直後にＲＮＡを単離しない場合には、サンプルを液体窒素中で凍結し 、将来の使用に備えて−７０℃で保存することができる。 １．変性用溶液１２ｍｌを５０ｍｌ容滅菌細胞培養管に分配し、５分間氷冷し た。 ２．組織（新鮮又は凍結）１ｇを５０ｍｌ容滅菌円錐形細胞培養管に入れ、段 階Ｂ．１からの変性用溶液を加えた。高レベルに設定した高速ホモジナイザー（ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で組織を１５〜３０秒間破壊し た。あるいは、組織を細断し、Ｄｏｕｎｃｅガラス−Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザ ーで破壊してもよい。 Ｃ．ＲＮＡ抽出 １．破壊したサンプルに２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１．２ｍｌを加え 、反転により十分に混合した。 ２．段階Ａ．２からのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合 物の下層有機相１２ｍｌを段階Ｃ．１のサンプルに加え、反転により混合した。 次にサンプルを１０秒間震盪し、１５分間氷冷した。 ３．段階Ｃ．２の混合物を５０ｍｌ容ＤＥＰＣ処理管（段階Ａ．１で準備）に 移し、１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心した。固定角度型遠心機又はスイ ングバケット型遠心機のいずれを使用してもよい。 Ｄ．ＲＮＡ沈殿 １．等容量のイソプロピルアルコールを段階Ｃ．３の混合物に加え、少なくと も３０分間−２０℃でインキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡ含量が比 較的少ないサンプルからＲＮＡを沈殿させるには長時間沈殿（一晩まで）を使用 すべきである。 ２．段階Ｄ．１の沈殿ＲＮＡを１０，０００×ｇで１５ 分間４℃で遠心することによりペレット化した。 ３．ＲＮＡペレットを変性用溶液５ｍｌに再懸濁し、ＲＮＡが溶解するまで渦 形成した。場合によっては、ペレットを再懸濁させるために６５℃までの加熱が 必要な場合もある。加熱はできるだけ短時間にすべきである。 ４．段階Ｄ．３の再懸濁ＲＮＡ溶液に等容量のイソプロピルアルコールを加え 、上記段階Ｄ．１に記載したようにＲＮＡを沈殿させた。 Ｅ．ＲＮＡ洗浄 １．段階Ｄ．４の沈殿ＲＮＡを１０，０００×ｇで１５分間４℃で遠心するこ とによりペレット化し、ペレットを氷冷７５％エタノールで洗浄し、上記のよう に遠心した（段階Ｅ．１）。この段階には最低１０ｍｌの７５％エタノールを使 用すべきである。 ２．段階Ｅ．１で調製したペレットを真空デシケーターで１５〜２０分間乾燥 した。ＲＮＡペレットは完全に乾燥すると次段階で再懸濁しにくくなるので完全 に乾燥すべきではない。 ３．段階Ｅ．２のＲＮＡペレットをＲＮアーゼ非含有水（米国、ウィスコンシ ン州、マディソンに所在のＰｒｏｍ ｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１〜３ｍｌに再懸濁し、−２０℃で保存した。長期間保存 するためには、ｐＨ５．０の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム溶液をエタノール２．５ 容量に加えることにより調製した溶液を使用してＲＮＡを再沈殿させ、−７０℃ で保存すべきである。 Ｆ．ＲＮＡ精製 その後、実施例３の段階Ｃ及びＤのプロトコルに従って実施例８のＲＮＡ樹脂 のいずれか一方１ｍｌを使用することにより、ＲＮＡを精製することができる。 実施例１０ 樹脂成分最適化 ＧＦ／Ａ粉砕ガラス繊維、シリカゲル６０−１０及び７Ｍ塩酸グアニジン水溶 液を使用して実施例１に記載したように対照樹脂を調製した。樹脂は０．３５％ （ｗ／ｖ）ＧＦ／Ａと３．５％（ｗ／ｖ）シリカゲルを含有していた。この樹脂 は培養物１００〜１０００ｍｌからプラスミドＤＮＡを単離するのに適している 。 この樹脂を対照として使用し、ＤＮＡの単離における樹脂の成分の各々の機能 範囲を示すために成分の各々を一度に１種類ずつ変化させ、他の成分は一定に維 持して一連の 実験を実施した。 １．樹脂のシリカ含量の変化 ２．樹脂のＧＦ／Ａ繊維含量の変化 ３．樹脂の塩酸グアニジンモル濃度の変化 実施例１１ 樹脂成分最適化 ＧＦ／Ａ粉砕ガラス繊維、シリカゲル６０−１０及び７Ｍ塩酸グアニジン水溶 液を使用して実施例１に記載したように対照樹脂を調製した。樹脂は０．１４％ （ｗ／ｖ）ＧＦ／Ａと１．４％（ｗ／ｖ）シリカゲルを含有していた。この樹脂 は培養物１〜３ｍｌからプラスミドＤＮＡを単離するのに適している。 この樹脂を対照として使用し、ＤＮＡの単離における樹脂の成分の各々の機能 範囲を示すために成分の各々を一度に１種類ずつ変化させ、他の成分は一定に維 持して一連の 実験を実施した。 １．樹脂のシリカ含量の変化 ２．樹脂のＧＦ／Ａ繊維含量の変化 ３．樹脂の塩酸グアニジンモル濃度の変化 以上、本発明を多少特定的に説明した。当業者は発明の趣旨の範囲内で上記態 様の多数の変形及び変更が存在することを理解されよう。本発明はこのような変 形及び変更を包含するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シリカゲルとガラス粒子の混合物。 ２．シリカゲルとガラス微細繊維から主に構成される請求項１に記載の混合物。 ３．シリカゲルとガラス粒子の重量比が５：１〜５０：１である請求項１に記載 の混合物。 ４．シリカゲルとガラス微細繊維の重量比が５：１〜５０：１である請求項２に 記載の混合物。 ５．更にカオトロピック塩を混合した請求項１に記載の混合物。 ６．更にカオトロピック塩を混合した請求項２に記載の混合物。 ７．更にカオトロピック塩を混合した請求項３に記載の混合物。 ８．更にカオトロピック塩を混合した請求項４に記載の混合物。 ９．カオトロピック塩が塩酸グアニジニウムである請求項５から８のいずれか一 項に記載の混合物。 １０．カオトロピック塩がチオシアン酸グアニジニウムで ある請求項５から８のいずれか一項に記載の混合物。 １１．更にキレート化剤を混合した請求項１０に記載の混合物。 １２．キレート化剤がＥＧＴＡ及びＥＤＴＡの可溶性塩から構成される群から選 択される請求項１１に記載の混合物。 １３．１種以上のカオトロピック塩を含有しており且つ少なくとも４Ｍのカオト ロピックイオン濃度を有する、水溶液中のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液。 １４．ガラス粒子がガラス微細繊維である請求項１３に記載の懸濁液。 １５．シリカゲルとガラス粒子の重量比が５：１〜５０：１である請求項１３に 記載の懸濁液。 １６．シリカゲルとガラス粒子の重量比が５：１〜５０：１である請求項１４に 記載の懸濁液。 １７．溶液中にグアニジニウムイオンが少なくとも４Ｍの濃度で存在する請求項 １３に記載の懸濁液。 １８．溶液中にグアニジニウムイオンが少なくとも４Ｍの濃度で存在する請求項 １４に記載の懸濁液。 １９．溶液中にグアニジニウムイオンが少なくとも４Ｍの濃度で存在する請求項 １５に記載の懸濁液。 ２０．溶液中にグアニジニウムイオンが少なくとも４Ｍの濃度で存在する請求項 １６に記載の懸濁液。 ２１．カオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジニウムである請求項 １７に記載の懸濁液。 ２２．カオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジニウムである請求項 １８に記載の懸濁液。 ２３．カオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジニウムである請求項 １９に記載の懸濁液。 ２４．カオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジニウムである請求項 ２０に記載の懸濁液。 ２５．カオトロピック塩が５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであ る請求項１７に記載の懸濁液。 ２６．カオトロピック塩が５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであ る請求項１８に記載の懸濁液。 ２７．カオトロピック塩が５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであ る請求項１９に記載の懸濁液。 ２８．カオトロピック塩が５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであ る請求項２０に記載の懸濁液。 ２９．ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡの塩を含有する請求項２４から２８のいずれか一項 に記載の懸濁液。 ３０．約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のＥＤＴＡの２ナトリウム塩を含有する請求 項２９に記載の懸濁液。 ３１．５０塩基を越える長さを有するＤＮＡ又はＲＮＡをそれぞれ含有する第１ の水溶液からこのような長さのＤＮＡ又はＲＮＡを分離する方法であって、（１ ）１種以上のカオトロピック塩を含有し且つ少なくとも４Ｍのカオトロピックイ オン濃度を有する第３の水溶液が前記第１の水溶液のアリコートの容量の約２倍 未満であるという条件下で、前記第１の水溶液のアリコートを前記第３の水溶液 と混合することにより第２の水溶液を調製する段階と、（２）前記第２の水溶液 のアリコートをシリカゲルとガラス粒子の混合物に接触させる段階を含む前記方 法。 ３２．段階（２）の後に、（３）段階（２）で第２の溶液の前記アリコートに接 触させたシリカゲルとガラス粒子の混合物の第１の部分から、前記混合物の前記 第１の部分に結合していない前記アリコートの実質的に全部を分離する段階と、 （４）シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第１の部分の一部である前記 混合物の第２の部分を、シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第２の部分 からカオトロピックイオンの実質的に全部を除去するのに有効 であり且つ短いオリゴヌクレオチド以外のＤＮＡを除去するには実質的に無効な 第４の水溶液で洗浄する段階と、段階（４）の後に、（５）シリカゲルとガラス 粒子の前記混合物の前記第２の部分の一部である前記混合物の第３の部分を水又 は第５の水溶液で洗浄し、ＤＮＡを前記第３の部分から溶離させる段階を含む請 求項３１に記載の方法。 ３３．第３の溶液においてカオトロピック塩が塩酸グアニジニウム及びチオシア ン酸グアニジニウムから構成される群から選択され、シリカゲルとガラス粒子の 混合物がシリカゲル５重量部〜５０重量部対ガラス微細繊維１重量部の重量比の シリカゲルとガラス微細繊維から主に構成される請求項３１に記載の方法。 ３４．第３の溶液においてカオトロピック塩が塩酸グアニジニウム及びチオシア ン酸グアニジニウムから構成される群から選択され、シリカゲルとガラス粒子の 混合物がシリカゲル５重量部〜５０重量部対ガラス微細繊維１重量部の重量比の シリカゲルとガラス微細繊維から主に構成され、第４の溶液がメタノール、エタ ノール及びイソプロパノールから構成される群から選択されるアルコール２０容 量％〜９５容量％を含有する水溶液であり、第５の溶液がｐＨ ６．５〜８．５の低塩緩衝液である請求項３２に記載の方法。 ３５．第３の溶液においてカオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジ ニウム又は５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであり、カオトロピ ック塩がチオシアン酸グアニジニウムである場合には、第３の溶液が５ｍＭ〜１ ５ｍＭの濃度のＥＤＴＡを含有する請求項３３に記載の方法。 ３６．第３の溶液においてカオトロピック塩が６Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジ ニウム又は５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムであり、カオトロピ ック塩がチオシアン酸グアニジニウムである場合には、第３の溶液が５ｍＭ〜１ ５ｍＭの濃度のＥＤＴＡを含有する請求項３４に記載の方法。 ３７．第５の溶液がＴＥ緩衝液である請求項３６に記載の方法。 ３８．水溶液中のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液であって１種以上のカオトロ ピック塩を含有し且つ少なくとも４Ｍのカオトロピックイオン濃度を有する前記 懸濁液中の溶液の容量が前記第１の溶液のアリコートの容量の約２倍未 満であるという条件下で、前記第１の溶液のアリコートを前記懸濁液と混合する ことにより、第２の溶液を調製する段階と第２の溶液をシリカゲルとガラス粒子 の混合物に接触させる段階とを同時に実施する請求項３１又は３２に記載の方法 。 ３９．水溶液中のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液であって１種以上のカオトロ ピック塩を含有し且つ少なくとも４Ｍのカオトロピックイオン濃度を有する前記 懸濁液中の溶液の容量が前記第１の溶液のアリコートの容量の約２倍未満である という条件下で、前記第１の溶液のアリコートを前記懸濁液と混合することによ り、第２の溶液を調製する段階と第２の溶液をシリカゲルとガラス粒子の混合物 に接触させる段階とを同時に実施する請求項３３又は３４に記載の方法。 ４０．水溶液中の珪藻土とガラス微細繊維の懸濁液であって６Ｍ〜８Ｍの濃度の 塩酸グアニジニウム又は５Ｍ〜７Ｍの濃度のチオシアン酸グアニジニウムを含有 する前記懸濁液のアリコート中の溶液の容量が第１の溶液のアリコートの容量の 約２倍未満であるという条件下で、前記第１の溶液のアリコートを前記懸濁液の アリコートと混合すること により、第２の溶液を調製する段階と第２の溶液をシリカゲルとガラス微細繊維 の混合物に接触させる段階とを同時に実施する請求項３５から３７のいずれか一 項に記載の方法。 ４１．分離される核酸がＤＮＡである請求項３１から４０のいずれか一項に記載 の方法。 ４２．分離される核酸がＲＮＡである請求項３１から４０のいずれか一項に記載 の方法。