DE19506887C2 - Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS - Google Patents
Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNSInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen
simultanen Isolierung von genomischer Desoxyribonu
kleinsäure (DNS) und zellulärer Total-Ribonukleinsäure
(RNS) aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien.
Es ist für eine Vielzahl von biologisch, molekularbio
logisch, medizinisch-analytisch sowie biochemisch ar
beitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit
sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekular
biologie, Biochemie, Gentechnik, Medizin, Veterinärme
dizin und alle angrenzenden Gebiete.
Die simultane Isolierung von genomischer DNS wie
auch zellulärer Total-RNS aus ein und demselben biolo
gischen Ausgangsmaterial ist bis zum heutigem Zeit
punkt an nur einige wenige praktizierbare Methoden
gebunden. So beschreiben Raha, S. Merante, F., Prote
au, G. und Reed, J. K. (GATA, 1990, 7(7): 173-177) eine
Methode zur Trennung genomischer DNS und zellulä
rer Total-RNS über selektive Präzipitationsschritte un
ter Verwendung von Litiumchlorid. Eine weitere Mög
lichkeit der simultanen Isolierung von DNS und RNS
basiert auf Durchführung einer Ultrazentrifugation
durch einen Zäsiumchloridgradienten zur Pelletierung
der RNS und anschließender Dialyse der DNS aus der
Guanidinium-Phase (Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor,
A., Eydmann, M., Denner, J. und Knowles, M. A.; Anal.
Biochem. (1990); 188; 338-343). Ein solches Verfahren
benötigt einen erheblichen zeitlichen (mindestens
48 Stunden) sowie apparativen Aufwand (Ultrazentrifu
gationsentechnik, spezielle Spezialrotoren).
Ein z. Z. relativ häufig genutztes und auch kommer
ziell verfügbares Verfahren beruht auf der Verwendung
eines Reagenz aus Guanidinthiocyanat und Phenol. Das
biologische Material wird in diesem Reagenz homoge
nisiert, wobei sich die RNS nach Zugabe von Chloro
form und durchzuführender Phasentrennung in der
wäßrigen Phase befindet und aus dieser präzipitiert
wird. Die zurückbleibende Interphase bzw. phenolische
Phase enthält sowohl Proteine als auch genomische
DNS. Durch Veränderung des pH Wertes und erneuter
Phasentrennung soll die genomische DNS ebenfalls in
die wäßrige Phase überführt werden und wird aus dieser
wiederum präzipitiert. /Chomczynski, P., Biotechniques
1993, 15(3): 532-536/.
Prinzipiell muß nach dem Stand der Technik davon
ausgegangen werden, daß die isolierte zelluläre Total-
RNS in den meisten Fällen mit genomischer DNS kon
taminiert ist.
So enthält die mittels dem von Chomcynski entwickel
ten und genutzten Reagenz erhaltene wäßrige Phase
neben der RNS auch genomische DNS, welche dann
ebenfalls aus dieser Phase präzipitiert wird und sich
damit in der finalen RNS-Präparation als kontaminie
render Bestandteil befindet. Gerade die Kontamination
isolierter zellulärer RNS mit genomischer DNS stellt für
eine Vielzahl von weiteren Verwendungen der RNS ein
gravierendes Problem dar.
So ist z. B. die Anwendung eines RNAse Protection
Assays zwingend an eine DNS freie RNS gebunden.
Ferner muß auch für eine Vielzahl von RT-PCR-Reak
tionen die verwendete RNS frei von einer Kontamina
tion mit genomischer DNS sein. So besteht z. B. bei
Expressionsuntersuchungen von cDNS-Konstrukten in
transgenen Organismen als auch bei Nachweisen der
Expression intronloser Gene wie auch von noch unbe
kannten Gensequenzen keine Möglichkeit nachzuwei
sen, ob das resultierende PCR-Fragment aus der konta
minierenden DNS oder aus der RNS amplifiziert wurde.
Sowohl aus der genomischen DNS wie auch aus einer
RNS abgeleitete Amplifikate hätten dieselbe Länge.
Dies zeigt die Bedeutung der Isolierung von genom
ischer DNS-freier Total-RNS.
Ein weiteres Problem besteht in der Präparationsdau
er zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und
zellulärer Total-RNS sowie in deren arbeitstechnischem
Aufwand.
Das einzige z. Z. kommerziell verfügbare Isolierungs
system benötigt für die Realisierung der simultanen Iso
lierung beider Nukleinsäurefraktionen mindestens
3 Stunden und ist mit einem nicht unerheblichen Auf
wand an notwendigen Reaktionsgefäßen und Feinche
mikalien belastet. Weiterhin benötigen alle diese Me
thoden auch eine relativ große Menge an biologischen
Ausgangsmaterialien, so daß bei Vorhandensein von nur
limitierter Mengen an Untersuchungsmaterialien mei
stens eine simultane Isolierung beider Nukleinsäuren
nicht mehr möglich ist.
Die Erfindung hat das Ziel, eine simultane Isolierung
von genomischer DNS und zellulärer Total-RNS hoher
Reinheit und ohne eine Kontamination mit genomischer
DNS auch aus sehr kleinen Mengen (< 105 Zellen; <
1 mg Gewebematerial) unterschiedlicher Ausgangsma
terialien zu erreichen.
Das Verfahren soll sehr einfach handhabbar sein, nur
geringe apparative Ausrüstung benötigen und es gestat
ten, beide Nukleinsäurefraktionen sehr schnell wie auch
aus sehr kleinen Mengen an Ausgangsmaterialien zu
isolieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß An
spruch 1 realisiert, die Unteransprüche 2-6 sind Vor
zugsvarianten.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Total-
RNS ist undegradiert und von exzellenter Qualität
(OD260 : OD280 = 1.8-2.0). Von entscheidender Bedeu
tung ist dabei, daß keine Kontamination genomischer
DNS mehr vorliegt. Dies bedeutet einen erheblichen
Vorteil gegenüber den meisten bisher Verwendung fin
denden Präperationsmethoden. Auch die ebenfalls aus
ein und derselben biologischen Probe isolierte genom
ische DNS ist von exzellenter Qualität und für eine
Vielzahl weiterer Verfahren als Substrat verwendbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiter
hin durch seine Einfachheit aus, benötigt nur geringe
Mengen an Feinchemikalien wie auch Zentrifugengefä
ße und minimiert auch die Menge und notwendige Zeit
dauer des Umganges mit toxischen organischen Solven
tien (benötigt nur einen Phenol/Chloroform Extrak
tionsschritt). Das Verfahren gestattet es, sowohl genom
ische DNS als auch zelluläre Total-RNS innerhalb von
weniger als 1,5 Stunden zu isolieren. Dies bedeutet eine
drastische Reduzierung der Präparationsdauer im Ver
gleich zu dem z. Z. kommerziell angebotenen diesbezüg
lichen Verfahren. Die Bindung der Desoxyribonuklein
säure erfolgt an der Oberfläche der im Anspruch 1 näher
beschriebenen hochdispersen und
nichtporösen Feststoffpartikel.
Die Bindung der Desoxyri
bonukleinsäure an das verwendete Trägermaterial wird
durch die chaotropen Salze des Lysepuffers vermittelt. Die
Lyse der Ausgangsmaterialien und die Bindung an das
Trägermaterial erfolgen im selben Reaktionsgefäß.
Das sehr einfache und nur wenige experimentelle
Schritte umfassende Verfahren ist in idealster Weise für
eine breite Anwendung in medizinischen Diagnostik-
Laboratorien geeignet und steht in diesem Zusammen
hang such Anwendern zur Verfügung, welche nicht
über spezielle molekularbiologisch-biochemische
Kenntnisse verfügen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist u. a. die
Voraussetzung gegeben, aus limitierten Mengen an Un
tersuchungsmaterialien sowohl die DNS als auch die
RNS zu isolieren. Dies erlaubt Untersuchungen von Ge
nen (DNS-Untersuchung) und deren Expression (RNS-
Untersuchung). Vor allem quantitative Abnormitäten
von Genen und deren RNS-Expression scheinen eine
wesentliche Bedeutung von Vorgängen während der
Kanzerogenese und Metastasierung wie auch bei der
postoperativen Progression von Tumorpatienten zu
spielen. Die Möglichkeit des Findens korrelativer Zu
sammenhänge bezüglich der Anzahl bestimmter tumo
rassoziierter DNS-Sequenzen, deren Struktur (Se
quenzinformation) und deren Expression (RNS) ist so
mit von entscheidender Bedeutung für ein besseres Ver
stehen von Zusammenhängen pathogener Mechanis
men.
Ferner erlaubt eine Methode der simultanen Isolie
rung von DNS und Total-RNS auch die Untersuchung
unterschiedlicher Spleißing-Mechanismen (z. B. Alter
natives Spleißen, Trans-Spleißen). Die Untersuchung
von Spleißvorgängen hat sowohl im Bereich der Grund
lagenforschung (Untersuchung von Vorgängen der
Genregulation) wie auch auf medizinischen Gebiet
(Aufklärung immunologischer Phänomene bei parasitä
ren Erkrankungen; z. B. nach Infektion mit Afrikani
schen Trypanospomen) ebenfalls eine große Bedeutung.
Die Mehrzahl solcher Studien scheitert am Fehlen
eines geeigneten methodischen Instrumentariums zur
simultanen Isolierung von DNS und RNS, vor allem bei
Vorhandensein nur geringer Mengen an Untersu
chungsmaterialien.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren besteht die
Möglichkeit der simultanen Isolierung von genomischer
DNS und zellulärer Total-RNS aus bakteriellen Lysaten,
aus Zellkulturen, intakten oder gefrorenen Gewebepro
ben, Spermien, Körperflüssigkeiten, Pflanzenzellen, He
fezellen sowie Blutserum, Blutplasma und Vollblut.
Die erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten erlau
ben die simultane Isolierung beider Nukleinsäuren
(DNS und RNS) mit einem extrem geringen zeitlichen
sowie apparativen Aufwand.
Es ist keine zeitaufwendige Proteinase-Verdauung
notwendig. Der geringe zeitliche Aufwand der simultan
en Isolierung von DNS und RNS aus ein und demselben
Ausgangsmaterial stellt für eine Vielzahl von potentiel
len Anwendern eine enorm wichtige Größe dar und
bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber
anderen Verfahren. Die Eigenschaft des verwendeten
Lysepuffers, sowohl die zelluläre Integrität zu zerstören
wie auch endogene wie exogene DNasen und vor allem
RNasen hochpotent zu inaktivieren, gestattet es dar
über hinaus, DNS und RNS aus Frischpräparaten unter
Feldbedingungen (z. B. bei Expeditionen, nach Opera
tionen) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen
unter Lysepuffer zu lagern und zu transportieren und
die Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen
Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.
Die Erfindung soll nachfolgend an einem
Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Lyse der Zellen durch Zugabe von Lysepuffer (Gua
nidiniumthiocyanat; N-Lauroyl-Sarcosin; DTT; Natriumci
trat) und Überführung der Zell-Lyse-Suspension in ein
1.5 ml Eppendorf-Zentrifugengefäß. Zugabe des Trä
germaterials zur Zell-Lyse-Suspension, kurzes Vorte
xen, Inkubation für 5 Minuten in einem Eisbad und an
schließende Pelletierung des Trägermaterials durch
kurze Zentrifugation in einer Tuchzentrifuge (30 Se
kunden).
Überführung des Überstandes in ein neues Eppen
dorf-Zentrifugengefäß und Zugabe von Phenol (wasser
gesättigt oder Tris-gepuffert), Chloroform und Natri
umacetat und 5 minütige Inkubation auf Eis. Nach er
folgter Phasentrennung durch Zentrifugation wird die
obere wäßrige Phase in ein neues Eppendorf-Zentrifu
gengefäß überführt, mit einem gleichem Volumen Iso
propanol versetzt und zur Präzipitation der RNS für
20-30 Minuten bei -20°C inkubiert. Die am Träger
pellet gebundene genomische DNS wird während der
Isopropanolfällung der RNS mit Waschpuffer (50 mM
NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v Ethanol)
versetzt und gewaschen und anschließend die genom
ische DNS durch Zugabe eines Elutionspuffers (Tris;
EDTA) bei 52°C vom Trägermaterial abgelöst, der Trä
ger durch kurze Zentrifugation von der eluierten ge
nomischen DNS abgetrennt und diese in ein neues Reak
tionsgefäß überführt.
Das nach Inkubation bei -20°C und anschließender
Zentrifugation erhaltene RNS-Pellet wird zweimal mit
70%igem Ethanol gewaschen und nach erfolgter voll
ständiger Entfernung des Ethanols das Pellet in RNase
freiem TE-Puffer oder DEPC-behandeltem Aqua Bidest
aufgenommen.
Claims (6)
1. Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total-
RNS durch
- 1. Lyse von diese Nukleinsäuren enthaltenden Materialien mittels chaotroper Salze, aus der Gruppe Guanidiniumthiocyanat und Guanidinhydrochlorid, mit Ionenstärken größer als 4-molar
- 2. Inkubation des Lysates mit einem mineralischen Träger, wobei als Trägermaterialien zur Bindung der genomischen DNS hochdisperse, nichtporöse SiO2-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m2/g, vorzugsweise 50 m2/g eingesetzt werden, sowie
- 3. einerseits Separation des Trägers mit der gebundenen genomischen DNS von dem RNS enthaltenden Lysat durch Zentrifugation, Waschung des Trägers mit einem Waschpuffer und Ablösung der trägerfixierten genomischen DNS vom Trägermaterial mit einem Puffer geringer Salzkonzentration,
- 4. andererseits Zugabe definierter Anteile von Phenol, Chloroform und Natriumacetat zum Lysat und Präzipitation der Total-RNS nach Phasentrennung aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von Isopropanol.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit
der fixierten genomischen DNS vom Lysat durch einen kurzen Zentrifugationsschritt
abgetrennt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
die am Träger gebundene genomische DNS mit einem Waschpuffer, bestehend aus
50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70% v/v Ethanol, gewaschen
wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die trägerfixierte genomische DNS mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration bestehend aus 10
mM Tris HCl und 1 mM EDTA bei einer Temperatur von 48-56°C, vorzugsweise 52°C,
eluiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
es als Batch-Verfahren durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.
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